2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng Rifampicin trong huyết tương bằng HPLC
- Quy trình chiết tách RIF: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp.
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách RIF khỏi các thành phần tạp trong huyết tương cho phép xác định được lượng RIF trong mẫu với độ chính xác thích hợp.
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Tính đặc
hiệu/chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), tỷ lệ thu hồi, độ ổn định.
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu chuẩn RIF và IS trong MeOH và trong HT trắng: - Mẫu trắng: Huyết tương trắng không chứa RIF
- Dung dịch chuẩn gốc: Nồng độ chính xác khoảng 200,0 g RIF/mL MeOH chứa vitamin C (1 mg/mL)
- Dung dịch chuẩn nội: Nồng độ chính xác khoảng 1,0 mg IS/mL MeOH chứa Vitamin C (1 mg/mL)
- Dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị hai dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2 lần lượt có nồng độ RIF chính xác khoảng 20,0 và 2,0
g/mL trong huyết tương trắng.
+ Dung dịch chuẩn làm việc WS1 (20,0 g/mL): Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn gốc, bốc hơi dung môi bằng khí N2. Hòa tan cắn trong 5,0 mL huyết tương trắng chứa Vitamin C (1mg/mL)
+ Dung dịch chuẩn làm việc WS2 (2,0 g/mL): Hút 1,0 mL WS1 hòa tan trong 10,0 mL huyết tương chứa Vitamin C (1mg/mL)
Từ dung dịch chuẩn làm việc tiến hành pha loãng với huyết tương trắng như bảng 2.3 để thu được mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,2 đến 20,0 g/mL
Bảng 2.3:Chuẩn bị đường chuẩn
Nồng độ (g/mL) 0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 16,0 20,0 V WS2 (L) - 50 125 250 500 - - - - V WS1 (L) - - - 100 200 400 500 VHT trắng (L) 500 450 375 250 - 400 300 100 - Chuẩn bị các mẫu QC:
Chuẩn bị tương tự mẫu chuẩn. Mẫu QC chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha mẫu chuẩn. Theo quy định của hướng dẫn, mẫu QC gồm 3 loại: Mẫu LQC có nồng độ bằng khoảng 2 – 3 lần nồng độ mẫu LLOQ; mẫu MQC có nồng độ khoảng 50% nồng độ Cmax và mẫu HQC có nồng độ khoảng 70 – 80 % mẫu ULOQ.
Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị hai dung dịch chuẩn làm việc WSQC 1 và WSQC 2 lần lượt có nồng độ RIF chính xác khoảng 20,0 và 4,0 g/mL trong huyết tương trắng chứa Vitamin C (1 mg/mL)
+ Chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn làm việc WS1 để có được dung dịch WSQC1 có nồng độ RIF khoảng 20 g/mL trong huyết tương trắng chứa Vitamin C (1 mg/mL)
+ WSQC2 (4,0 g/mL): Hút 1,0 mL WSQC1 hòa tan trong 5,0 mL huyết tương trắng chứa Vitamin C (1 mg/mL)
Chuẩn bị các mẫu QC có nồng độ lần lượt là: LQC = 0,6 µg/mL; MQC = 9,0 µg/mL; HQC = 18,0 µg/mL được trình bày ở bảng 2.4
Bảng 2.4:Chuẩn bị mẫu kiểm tra
QC Nồng độ (g/mL) V WSQC2 (L) V WSQC1 (L) VHT trắng (L)
LQC 0,6 75 - 425
MQC 9,0 - 225 275
HQC 18,0 - 450 50
Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng dưới: Mẫu LLOQ 0,2 g/mL được chuẩn bị như bảng 2.5
Bảng 2.5:Chuẩn bị mẫu giới hạn định lượng dưới
Nồng độ (g/mL) V WS2 (L) VHT trắng (L)
LLOQ 0,2 50 450 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.2.1.Xác định điều kiện sắc ký
Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC – Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:
+ Các cột pha đảo khác nhau.
+ Pha động có thành phần, tỷ lệ khác nhau. + Lựa chọn chất thích hợp làm nội chuẩn.
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng rifampicin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS.
2.3.2.2.Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách rifampicin từ huyết tương trên các mẫu chuẩn rifampicin hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như:
+ Tủa protein với các tác nhân gây tủa là: MeOH, HClO4. + Chiết lỏng - lỏng.