Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.1 Các chế phẩm carbamazepin trên thị trường 5 1.2 Một số nghiên cứu định lượng carbamazepin trong dịch sinh học 6 3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời

VÕ THỊ VIỆT TRINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

VÕ THỊ VIỆT TRINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS: Phan Thị Phương Dung

2 ThS: Tạ Mạnh Hùng

Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương

sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

HÀ NỘI – 2015

Sau một thời gian thực hiện khóa luận với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn

TS Phan Thị Phương Dung, ThS Tạ Mạnh Hùng và Th.S Trần Lan Hương

là những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn tôi từng ngày trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị tại Trung tâm đánh giá tương đương

sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện

thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược

Hà Nội, những người đã tận tâm dạy dỗ, trang bị cho tôi các kiến thức và kỹ năng

trong học tập, nghiên cứu suốt 5 năm qua

Chân thành cảm ơn những người anh chị em cùng những người bạn của tôi đã luôn sát cánh, quan tâm, giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn khi thực hiện đề tài để tôi có thể đi đến ngày hôm nay

Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất dành cho gia đình của tôi - những người thân yêu đã luôn tin tưởng, động viên và chăm sóc tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Võ Thị Việt Trinh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về carbamazepin (CBZ) 2

1.1.1 Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 2

1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 2

1.1.3 Dược động học 3

1.1.4 Chỉ định và chống chỉ định 4

1.1.5 Một số chế phẩm trên thị trường 4

1.1.6 Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC 5

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

1.2.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 8

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 9

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11

1.2.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 14

1.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu 21

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 22

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương 27

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 27

3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có CBZ 31

3.1.3 Qui trình phân tích CBZ trong huyết tương 33

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 33

3.2.1 Tính chọn lọc-đặc hiệu 33

3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 35

3.2.3 Giới hạn định lượng dưới 36

3.2.4 Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày 37

3.2.5 Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 38

3.2.6 Độ ổn định của mẫu huyết tương 41

3.3 Bàn luận 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CBZ-E : Carbamazepine 10, 11- epoxide

CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control

Sample)

IS : Nội chuẩn (Internal Standard)

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification)

LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control

Sample) MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality

Control Sample) P.A : Tinh khiết phân tích (pure analysis)

QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample)

SKĐ : Sắc ký đồ

SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration)

US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and

Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible)

1.1 Các chế phẩm carbamazepin trên thị trường 5 1.2 Một số nghiên cứu định lượng carbamazepin trong dịch sinh học 6

3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời

3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 37 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 38

3.8 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn nội trong thời gian

3.11 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng

3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở

1.1 Cấu trúc cột LC-DB 12

3.4 Sắc ký đồ khảo sát acid fenofibric làm nội chuẩn 28 3.5 Sắc ký đồ khảo sát propylparaben làm nội chuẩn 28

3.6 Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH :

3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 34

3.11 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn carbamazepin (nồng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh động kinh được định nghĩa là sự rối loạn từng cơn chức năng của thần kinh trung ương do sự phóng điện đột ngột, quá mức, đồng thời của các neuron Bệnh xuất hiện ở tất cả mọi nơi trên thế giới và có thể ở mọi lứa tuổi Trong số các bệnh nhân động kinh, khoảng 50% trẻ em có vấn đề khó khăn về nhận thức, 6% bệnh nhân có bất thường về vận động, 6% rối loạn tâm thần nặng, 1/15 bệnh nhân phụ thuộc vào người khác cho các công việc hằng ngày vì lý do bệnh động kinh và mức độ tàn phế liên quan đến nó Trên thế giới người mắc bệnh động kinh chiếm khoảng 0,5% dân số và tại Việt Nam khoảng 2% dân số bị động kinh trong đó gần 60% số bệnh nhân là trẻ em [1], [20], [26]

Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị bệnh động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và động kinh thể co cứng giật rung Tuy nhiên khoảng điều trị của carbamazepin hẹp,

cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và có nhiều trường hợp bệnh nhân ngộ độc thuốc Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất

rõ và phức tạp Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm sàng của các chế phẩm carbamazepin, đặc biệt kiểm soát nồng độ carbamazepin trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết sức cần thiết Tại Việt Nam, năm 2010, Bộ Y Tế đã quy định các thuốc chứa hoạt chất carbamazepin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo mới được cấp phép đăng ký và lưu hành trên thị trường Việt Nam [7]

Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ carbamazepin trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học

các chế phẩm chứa hoạt chất carbamazepin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu:

1 Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA

2 Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CARBAMAZEPIN (CBZ)

1.1.1 Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C15H12N2O

- M=236,27g/mol

- Tên khoa học: 5H-Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide [10], [21]

1.1.1.2 Đặc điểm hóa lý

- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng

- Rất khó tan trong nước và ether, hơi tan trong aceton và ethanol (96%), dễ tan trong dicloromethan, methylen clorid, chloroform

- Nhiệt độ nóng chảy: 189-193°C [3], [5], [10], [14]

1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng

Carbamazepin là một hợp chất iminostilben - nhóm cấu trúc dibenzazepine, là một trong những thuốc cơ bản trong điều trị động kinh cục bộ và động kinh co cứng-giật rung CBZ làm ổn định tình trạng quá kích thích tại màng thần kinh, kìm hãm sự phóng lặp lại các xung thần kinh, giảm sự dẫn truyền synap của các xung kích thích Sự ức chế cảm ứng điện dòng Na+ có thể là cơ chế hoạt động chính của CBZ, nhờ đó CBZ có thể ức chế sự chuyển vận catecholamin, quá trình giải phóng glutamate [2], [4], [23]

Tác dụng chống co giật của CBZ đặc biệt hiệu quả ở các bệnh nhân động kinh cục bộ phức hợp tuy nhiên không hiệu quả trong động kinh cơn vắng CBZ làm tăng

ngưỡng động kinh, làm giảm nguy cơ co cứng và giảm các triệu chứng cai nghiện rượu

CBZ có tác dụng hướng tâm thần, nâng cao tâm trạng ở một số bệnh nhân trầm cảm bị động kinh và điều trị phối hợp với các thuốc chống loạn thần trong giai đoạn cấp tính của bệnh tâm thần phân liệt CBZ cũng có tác dụng điều trị bệnh rối loạn lưỡng cực, đặc biệt trong trường hợp bệnh nhân không đáp ứng điều trị với cả lithium và valproat

Ngoài ra, CBZ còn có tác dụng giảm đau do thần kinh như đau dây thần kinh sinh ba, giảm triệu chứng đau mãn tính phát sinh từ các hội chứng thần kinh ngoại

vi khác [2], [4], [9]

1.1.3 Dược động học

Sau khi uống, CBZ hầu như được hấp thu hoàn toàn, tuy chậm và thất thường Thời gian cần để đạt tới nồng độ đỉnh trong máu sau khi uống CBZ dạng viên nén, hỗn dịch, viên nén giải phóng kéo dài, viên nang giải phóng kéo dài lần lượt là: 4,5h; 1,5h; 3-12h và 4,1-7,7 giờ

Thuốc phân phối nhanh vào mô, rộng khắp cơ thể, phát hiện có trong dịch não tủy, não, dịch tá tràng, mật, nước bọt, cả nhau thai và sữa mẹ Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương: 75-78%, nồng độ thuốc trong dịch não tủy tương đương trong huyết tương Thể tích phân bố là: 0,88  0,06 lít/kg ở người lớn và 1,2  0,2 lít/kg ở trẻ em

Cơ chế chuyển hóa của CBZ không hoàn toàn sáng tỏ, theo nghiên cứu thì con đường chuyển hóa chính là quá trình oxy hóa bởi CYP3A, chủ yếu tạo thành carbamazepin-epoxid (CBZ-E) là một chất chuyển hóa có hoạt tính Ở người lớn, CBZ-E có trong máu với nồng độ từ 10 - 15% nồng độ của hợp chất mẹ, ở trẻ em là 20% CBZ-E có thể gây độc thần kinh, đặc biệt khi dùng thuốc đồng thời với phenytoin hoặc phenobarbital và việc tăng tỷ lệ epoxid có thể giải thích độc tính thần kinh của CBZ ở nồng độ điều trị trong huyết thanh

Thải trừ: CBZ-E tiếp tục chuyển hóa thành hợp chất bất hoạt và đào thải vào nước tiểu Chỉ có 3% CBZ bài tiết không thay đổi trong nước tiểu ở dạng không chuyển hóa, ở phân tỷ lệ này là 15% Thời gian bán thải:

- CBZ: Liều ban đầu :25 giờ đến 65 giờ Liều lặp lại (sau 3-5 tuần) : 12 giờ đến 17giờ (do quá trình tự cảm ứng của CBZ trong 3-5 tuần đầu)

bộ khác

- Ðau do nguyên nhân thần kinh: Giảm đau do dây thần kinh sinh ba và giảm đau dây thần kinh lưỡi hầu, đau trong zona, giang mai thần kinh…

- Dự phòng bệnh hưng - trầm cảm (không đáp ứng với liệu pháp thông thường)

- Ðiều trị hội chứng cai rượu

1.1.4.2 Chống chỉ định

- Loạn chuyển hóa porphyrin cấp tính

- Quá mẫn với CBZ hoặc dị ứng với các thuốc có cấu trúc liên quan như các thuốc

chống trầm cảm ba vòng

- Block nhĩ - thất

- Người có tiền sử loạn tạo máu và suy tủy

- Người mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu [2], [4]

1.1.5 Một số chế phẩm trên thị trường

Các chế phẩm CBZ trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng 200mg Ngoài ra còn có các dạng viên nén nhai, viên nén giải phóng kiểm soát, viên nang giải phóng chậm, hỗn dịch uống với hàm lượng 100, 200 hoặc 300 mg cho phù hợp với nhu cầu người sử dụng Một số chế phẩm chứa CBZ trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 sau:

Bảng 1.1 Một số chế phẩm CBZ trên thị trường [24], [25]

1.1.6 Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC

Hiện nay, định lượng CBZ nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Định lượng CBZ trong dịch sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác như HPLC, điện di mao quản, phóng xạ miễn dịch [12], [13] Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn

STT Dạng bào chế Tên biệt dược Hàm lượng Nhà sản xuất

Carbatol 200 200mg Torrent Pharm.Ltd

5 Hỗn dịch uống Carbamazepin

suspension 100mg/5ml Alpharma

được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm Một số phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng CBZ trong dịch sinh học

Nhận xét:

Phương pháp 1: Phương pháp cho độ nhạy cao và thời gian chạy sắc ký là 8

phút, thuận lợi cho quá trình phân tích Tuy nhiên dung môi chiết chỉ sử dụng cloroform – khó bay hơi nên có nhược điểm thời gian cô dài, dễ tạo nhũ tương gây khó khăn cho quá trình chiết Ngoài ra chất chuẩn nội 5 (p-metylphenyl) -5-phenylhydantoin của phương pháp không phổ biến, một chất hiện tại phòng thí nghiệm chúng tôi chưa có nên khó có thể áp dụng phương pháp vào nghiên cứu

5 metylphenyl) -5- phenylhydantoin

(p-µ-Bondapark C18 (30cm×4mm)

Acetonitril:

nước = 37:63 (v/v) Tốc độ dòng:

BDC C18 (250mm x 4.6 mm)

Bakerbond-Acetonitril : 10mM đệm phosphat pH 7,0 = 30 :70 (v/v) Tốc độ dòng:

propylparaben

µ-Bondapark C18 (150mm×4,6 mm)

MeOH:

nước=50:50 (v/v) Tốc độ dòng:

1ml/phút

UV,

λ 285nm

Phương pháp 2: Phương pháp cho độ chính xác cao (92,09% - 108,5%),

khoảng nồng độ tuyến tính từ 0.2-25 µg/mL, thời gian chạy sắc ký ngắn (khoảng 8 phút) Tuy nhiên sử dụng quy trình xử lí mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp này gặp nhiều khó khăn do không đủ kinh phí mua cột chiết và trang thiết bị chiết pha rắn Vì vậy phương pháp này khó có thể áp dụng ngay ở nước ta hiện nay

Phương pháp 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi

MeOH đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ và thời gian lưu của chuẩn nội khoảng 11,4 phút gây kéo dài thời gian phân tích, không thuận lợi cho quá trình phân tích nhiều mẫu trong ngày

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa của CBZ, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam

Conn 06856) high-pressure liquid

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [6], [8]

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng

ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký

 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí)

 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động

 Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy

ra quá trình phân tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích quá trình sắc ký Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm

 Bộ phận phát hiện (Detector)

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp, thường có các loại sau: Detector hấp thụ UV-VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [6], [8]

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

 Thời gian lưu (t R )

Thời gian lưu (tR) của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực (tR’), được tính bằng công thức sau:

tR’ = tR – tM.

Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài

 Thể tích lưu (V R )

Thể tích lưu (VR) là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ

VR= tR×Fc

Với: Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian

Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi ra khỏi hệ thống [6], [8]

Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [6]

a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [6], [8]

1.2.3.6 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:

= 16[ ] ℎ = 5,54[ ]

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [6], [8]

1.2.3.7 Độ phân giải R s của cột

Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

Trong đó:

t(R)A; t(R)B : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)

WA; WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A; W1/2B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: RS> 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [6], [8]

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.2.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại:

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:

- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [16]

–CH2 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-

R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl Do các nhóm

OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [6]

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid, pH < 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột

Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-

C18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi Kết quả giảm đi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS–Expended Polar Selectivity) [16]

1.2.4.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic… nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

 Yêu cầu của 1 pha động

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

- Hòa tan chất cần phân tích

- Có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

 Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả

- Bản chất của dung môi để pha pha động

 Tốc độ dòng của pha động:

Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [16]

1.2.4.3 Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ Detector phổ biến nhất là Detector UV-VIS Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [16]

1.2.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC

1.2.5.1 Cách đánh giá pic

- Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình

- Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định Đo chiều

cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình

1.2.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích

Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra

do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp

 Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử

những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

 Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn:

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là:

- Chuẩn hóa 1 điểm

- Chuẩn hóa nhiều điểm Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa

tỷ số diện tích (hay chiều cao) pic của chất chuẩn với chuẩn nội (SS / SIS) so với tỷ

số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS / CIS) Dựa vào đường chuẩn để tìm ra nồng độ chất thử [6], [8]

1.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 1.3.1 Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm

chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát

Quá trình phân tích mẫu sinh học thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp, lẫn nhiều tạp là các chất nội sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, do vậy phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [11], [19], [22]

1.3.2 Nội dung thẩm định phương pháp

1.3.2.1 Tính chọn lọc – đặc hiệu

Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác

Tính chọn lọc-đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên sắc ký đồ cho các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

- Pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp

- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích không được vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ

- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của IS [11], [19], [22]

1.3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Khoảng tuyến tính

là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy:

y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu)

Đường chuẩn đạt yêu cầu của thẩm định phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85-115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80% -120%

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn

Độ chính xác của phương pháp phân tích đạt yêu cầu khi thỏa mãn 2 điều kiện sau:

- Độ lặp lại trong ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15%

- Độ lặp lại giữa các ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15% [11], [19], [22]

1.3.2.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn:

- Đáp ứng của chất phân tích tại LLOQ ít nhất bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại cùng thời gian lưu

Tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu nếu thỏa mãn các điều kiện sau:

- Phương pháp xử lý mẫu được coi là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi không quá 110%

và không thấp hơn 30%

- Giá trị CV% giữa các đáp ứng của nội chuẩn và giữa các đáp ứng của chất phân tích trong các mẫu QC có qua xử lý ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

- Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khác nhau quá 15% [11], [19], [22]

1.3.2.6 Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử Do đó trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định sau:

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ ổn định của dung dịch pha loãng (nếu có)

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm: độ ổn định sau 3 chu kì đông – rã đông, độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách), độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định [11], [19], [22]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Máy móc, thiết bị

Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thiết bị đã dùng trong nghiên cứu

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, Nhật

Tủ lạnh sâu -35oC ± 5oC Sanyo MDF – 236, Nhật

Ống ly tâm thuỷ tinh thể tích 15mL Sartorius, Đức

Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC – Shimadzu gồm: Interface CBM-20; bơm

cao áp LC-20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20AC, Detector PDA M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO-20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC Solution Shimadzu

SPD-2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2, bảng 2.3, bảng 2.4

Bảng 2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.4 Các mẫu huyết tương trắng đã dùng trong nghiên cứu

01 13PN12273 Viện huyết học – truyền

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng HPLC

- Quy trình chiết tách CBZ: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu huyết tương

tự tạo chứa CBZ để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp

Tên Nơi sản xuất Số kiểm soát Hàm lượng Độ ẩm

Carbamazepin ZJP CO., Ltd 140227316 99,80% 0,1%

- Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm, đảm bảo phân tách CBZ khỏi các thành phần tạp có trong mẫu, cho phép xác định được lượng CBZ trong mẫu với độ đúng độ chính xác đáp ứng các quy định của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [19], [21]

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo

6 chỉ tiêu: tính đặc hiệu/chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), tỷ

lệ thu hồi, độ ổn định như trong hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích

trong dịch sinh học [19], [22]

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa CBZ

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc

- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn CBZ trong methanol (MeOH) để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ CBZ chính xác khoảng 500 µg/mL

- Dung dịch chuẩn nội gốc: hòa tan chất chuẩn Propylparaben trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 250 µg/mL

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu đường chuẩn

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH để có dung dịch chuẩn làm việc

có nồng độ CBZ chính xác khoảng 100 g/mL Từ dung dịch chuẩn làm việc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSCC1 và WSCC2) có nồng độ CBZ lần lượt khoảng 10 g/mL và 1 g/mL

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank) và 08 mẫu huyết tương

có pha chuẩn CBZ Tiến hành pha loãng WSCC1 VÀ WSCC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,1 – 10 g/mL như ở bảng 2.5

Bảng 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn

2.3.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm tra

Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH để có dung dịch chuẩn làm việc

có nồng độ CBZ chính xác khoảng 100 g/mL Từ dung dịch chuẩn làm việc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSQC1 và WSQC2) có nồng độ CBZ lần lượt khoảng 10 g/mL và 1 g/mL

Tiến hành pha loãng WSQC1 và WSQC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu LQC (0,3g/mL), MQC (4,0 g/mL), HQC (8,0 g/mL) như ở bảng 2.6

Bảng 2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra

Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốc độc lập

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.2.1 Xác định điều kiện sắc ký

Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:

HPLC Lựa chọn bước sóng phát hiện

- Lựa chọn chất chuẩn nội