2.3.1. Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa CBZ
2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc
- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn CBZ trong methanol (MeOH) để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ CBZ chính xác khoảng 500 µg/mL.
- Dung dịch chuẩn nội gốc: hòa tan chất chuẩn Propylparaben trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 250 µg/mL.
2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu đường chuẩn
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH để có dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ CBZ chính xác khoảng 100 g/mL. Từ dung dịch chuẩn làm việc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSCC1 và WSCC2) có nồng độ CBZ lần lượt khoảng 10 g/mL và 1 g/mL.
Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn CBZ. Tiến hành pha loãng WSCC1 VÀ WSCC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ từ 0,1 – 10 g/mL như ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Chuẩn bị đường chuẩn
2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu kiểm tra
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH để có dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ CBZ chính xác khoảng 100 g/mL. Từ dung dịch chuẩn làm việc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSQC1 và WSQC2) có nồng độ CBZ lần lượt khoảng 10 g/mL và 1 g/mL.
Tiến hành pha loãng WSQC1 và WSQC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu LQC (0,3g/mL), MQC (4,0 g/mL), HQC (8,0 g/mL) như ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Chuẩn bị mẫu kiểm tra
Ký hiệu LQC MQC HQC
Nồng độ (µg/mL) 0,3 4,0 8,0
VHT trắng (µL) 700 600 200
VWSQC1 (µL) - 400 800
VWSQC2 (µL) 300 - -
Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốc độc lập.
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.2.1. Xác định điều kiện sắc ký
Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC- Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:
-Lựa chọn bước sóng phát hiện -Lựa chọn chất chuẩn nội
Mẫu Blank S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
Nồng độ (g/mL) 0,1 0,2 0,5 1,0 3,0 5,0 7,0 10,0
VHT trắng (L) 1000 900 800 500 0 700 500 300 0
VWSCC1 (L) - - - 300 500 700 1000
- Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn pha động -Lựa chọn tốc độ dòng
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector PDA
2.3.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách CBZ từ huyết tương trên các mẫu chuẩn CBZ hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như:
-Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: acetonitril (MeCN); methanol (MeOH) hoặc tác nhân gây tủa là acid như: acid percloric 20%.
-Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: diethyleter, cloroform, dicloromethan và hỗn hợp dung môi diethyleter với cloroform, dicloromethan với các tỷ lệ khác nhau.
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc
Chỉ tiêu độ đặc hiệu – chọn lọc được quy định tại mục 1.3.2.1 Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu:
- Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau - Huyết tương trắng có pha chuẩn nội.
- Huyết tương trắng có pha chuẩn CBZ ở nồng độ 0,1 µg/mL và IS. So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung dịch có nồng độ như sau: 0,1 – 0,2 – 0,5 – 1,0 – 3,0 – 5,0 – 7,0 – 10,0 µg/mL.
Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của CBZ và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của CBZ/IS và nồng độ CBZ có trong mẫu và xác định hệ số tương quan r.
Tính lại nồng độ CBZ các mẫu theo phương trình hồi quy từ đó xác định lại độ đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.
2.3.3.3. Giới hạn định lượng dưới
Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn CBZ ở nồng độ khoảng 0,1 µg/mL. Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu LLOQ. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ chính xác bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng.
2.3.3.4. Độ đúng
Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ theo bảng 2.7 sau: Bảng 2.7. Chuẩn bị mẫu QC xác định độ đúng
Mẫu QC Mã Khoảng xác định Giá trị
(µg/mL)
Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC ≤ 3 x LLOQ 0,3
Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình MQC Gần điểm giữa của đường chuẩn 4,0
Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC 75% - 90% ULOQ 8,0
Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được với giá trị thực có trong mẫu.
2.3.3.5. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày
Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện.
Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày.
Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.
2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng.
Xác định tỷ lệ thu hồi của CBZ và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của CBZ và IS trong các mẫu QC có qua xử lý với đáp ứng của CBZ và IS trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý).
2.3.3.7. Độ ổn định
Độ ổn định dung dịch chuẩn nội làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội gốc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (khoảng 6 giờ). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn nội gốc sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.
Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một thời gian nhất định (khoảng 10 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn CBZ gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian nhất định (khoảng 10 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng. Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.
Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã
Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35oC ± 5oC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12-24 giờ. Lặp lại chu kì đông – rã 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ CBZ có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ CBZ có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ CBZ trong mẫu
sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn
Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 6 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ CBZ trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
* Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài
Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35oC ± 5oC, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định khoảng sau 30, 45, 60 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ CBZ trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)
So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong auto- sampler sau một thời gian xác định (khoảng 24 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý. Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn
3.1.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ
Quét phổ hấp thụ của mẫu chuẩn CBZ dung dịch trong MeOH, ta được phổ của CBZ như hình 3.1 sau:
Hình 3.1.Phổ hấp thụ UV-VIS của CBZ
Dựa vào phổ hấp thụ của CBZ ở trên, CBZ có 2 cực đại hấp thụ tại λ = 212 nm và 285 nm. Ở bước sóng 212 nm độ hấp thụ của CBZ cao hơn độ hấp thụ ở bước sóng 285nm nhiều. Do đó, kết hợp tham khảo một số tài liệu về phương pháp định lượng CBZ và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn bước sóng phù hợp tiến hành chạy sắc ký là λ = 212 nm. Qua quá trình khảo sát điều kiện sắc ký, nhận thấy mẫu chuẩn đáp ứng tốt tại bước sóng λ = 210 nm.
200 300 400 500 600 700 nm -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 mAU 7.83/ 1.00 2 0 2 25 6 3 74 455 554 2 12 28 5 6 36 48 8 39 0
3.1.1.2. Lựa chọn nội chuẩn
Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất, và các chuẩn sẵn có ở phòng thí nghiệm chúng tôi khảo sát một số chất làm nội chuẩn như: trimetazidin, olanzapin, acid fenofibric, propylparaben.
Sau đây là các sắc ký đồ thu được trong quá trình khảo sát IS
Hình 3.2. SKĐ CBZ và nội chuẩn trimetazidin
Hình 3.3. SKĐ CBZ và nội chuẩn olanzapin
Hình 3.4. SKĐ CBZ và nội chuẩn acid fenofibric
Hình 3.5. SKĐ CBZ và nội chuẩn propylparaben
Qua kết quả 4 sắc ký đồ ta thấy:
0.0 2.5 5.0 min 0 250 500 750 1000 1250mAU210nm4nm (1.00) Tr im e ta z id in/4. 8 10 /60 22 73 3 C a rb a m azepi n /6 .8 97 /11 59 15 48 5.0 10.0 15.0 min 0 250 500 750 1000 1250mAU210nm,4nm (1.00) C ar ba m az epi n/ 6. 90 2/ 88 61 72 6 Ola nz ap in /17 .4 54 /5 666 10 2 5.0 10.0 15.0 min 0 250 500 750 1000 1250 mAU 210nm,4nm (1.00) C a rba m a z e p in /6 .9 0 4/ 80 1 89 9 9 2.5 5.0 7.5 min -250 0 250 500 750 1000 1250 mAU 210nm,4nm (1.00) C a rb amaz ep in /6 .9 1 3 /91 5 4 2 7 0 P ro p y lp a ra b e n /8 .0 0 4/ 4 9 8 28 0 4
-Hình 3.2: Trimetazidin có thời gian lưu tại 4,8 phút và phân tách rõ với pic CBZ, nhưng pic của IS có hệ số kéo đuôi cao (T=1,828). Nên chúng tôi không lựa chọn Trimetazidin làm nội chuẩn.
-Hình 3.3: Olanzapin có thời gian lưu tại 17,4 phút, tuy phân tách rõ với pic CBZ nhưng thời gian lưu quá dài, không thuận lợi cho quá trình phân tích nhiều mẫu trong ngày. Nên chúng tôi không lựa chọn olanzapin làm nội chuẩn.
-Hình 3.4: Không xuất hiện pic IS sau thời gian chạy sắc ký 17,5 phút, thời gian lưu quá dài, nên không lựa chọn acid fenofibric làm nội chuẩn.
-Hình 3.5: Propylparaben có thời gian lưu tại 8,0 phút, pic phân tách rõ ràng với pic của CBZ, hình dáng pic cân đối. Do vậy lựa chọn propylparaben làm nội chuẩn cho phương pháp.
3.1.1.3. Lựa chọn cột sắc ký
Tiến hành phân tích trên hệ sắc ký pha đảo: chất phân tích ít phân cực và pha động phân cực. Trong hai loại cột pha đảo thường được sử dụng là cột C8 và C18 thì cột C8 phân cực hơn so với cột C18 ảnh hưởng đến khả năng phân tách CBZ khỏi các thành phần tạp chất do vậy ít được sử dụng hơn. Kết hợp tham khảo một số tài liệu định lượng CBZ trong dịch sinh học, chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột sắc ký Rp18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) với bảo vệ cột Rp18 (4 x 3 mm; 5µm) kết quả thực nghiệm thấy cột Rp18 có khả năng tách tốt và chọn lọc CBZ ra khỏi mẫu phân tích (hình 3.5).
3.1.1.4. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng
Tiến hành khảo sát trên các hệ pha động gồm MeCN : đệm phosphat pH 7,0 và MeOH : đệm phosphat pH 7,0 với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi thấy hệ pha động sử dụng MeOH cho đáp ứng pic cao hơn và hình dáng pic cân đối hơn so với hệ pha động sử dụng MeCN. Do vậy chúng tôi lựa chọn thành phần hệ pha động để định lượng CBZ trong huyết tương là MeOH và đệm phosphat pH 7,0.
Khảo sát tỷ lệ MeOH và đệm phosphat trong pha động, kết quả cho thấy khi tăng tỷ lệ MeOH trong pha động, thời gian lưu của chuẩn và chuẩn nội đều giảm, hệ số phân giải giữa CBZ và IS cũng giảm đi. Qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn hệ
pha động gồm MeOH : đệm pH 7,0 với tỷ lệ tương ứng là 58 : 42, pic của chuẩn và chuẩn nội trên sắc ký đồ tách nhau rõ ràng, hệ số phân giải phù hợp.
Tuy nhiên với hệ pha động MeOH : đệm pH 7,0 (58 : 42) và tốc độ dòng là 1,0mL/ phút thời gian lưu tương ứng của chuẩn và chuẩn nội là khoảng 7,7 phút và 9,0 phút, thời gian phân tích hơi dài. Do đó để giảm thời gian phân tích mẫu, chúng tôi tiếp tục khảo sát thay đổi tốc độ dòng. Kết quả sắc ký cho thấy ở tốc độ dòng 1,3 mL/phút thời gian lưu tương ứng của chuẩn và chuẩn nội khoảng 6,0 phút và 7,4 phút nên thời gian phân tích một mẫu khoảng 8,5 phút phù hợp với phân tích số lượng mẫu nhiều trong phân tích mẫu trong dịch sinh học.
Sau đây là một số sắc ký đồ thu được từ quá trình khảo sát:
Hình 3.6. SKĐ của CBZ và IS trong pha động MeOH : đệm pH 7,0 (60:40)
và tốc độ dòng 1,0 mL/phút