Định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ QUỲNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ QUỲNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan 2. DS. Phạm Lê Minh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội với sự hướng dẫn và chỉ bảo và giúp đỡ tận tình của ThS. Đặng Thị Ngọc Lan và DS. Phạm Lê Minh cùng các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới hai thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn, dìu dắt chỉ bảo tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu vì đã luôn giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các kĩ thuật viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban giám hiệu, phòng đào tạo nhà trường và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường. Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Vũ Thị Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… 1 Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………. 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……………………………………. 2 1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin …………………………………………… 2 1.1.1.1. Tính chất ………………………………………………………………… 2 1.1.1.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 2 1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3 1.1.2. Tổng quan về simvastatin …………………………………………………… 4 1.1.2.1. Tính chất ………………………………………………………………… 4 1.1.2.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 5 1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5 1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 7 1.2.1. Khái niệm HPLC ………………………………………………………… 7 1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ………………………………………… 7 1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ………………………………………………. 8 1.2.4. Các thông số đặc trưng trong HPLC ……………………………………… 9 1.2.4.1. Hệ số phân bố K ………………………………………………………… 9 1.2.4.2. Thời gian lưu t R ………………………………………………………… 9 1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’ …………………………………………………… 10 1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α …………………………………………………………. 10 1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký …………… …………. 10 1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết N ……………………………………………………… 11 1.2.4.7. Độ phân giải R S ………………………………………………………… 11 1.2.5. Ứng dụng của HPLC ………………………………………………………. 11 1.2.5.1. Định tính ………………………………………………………………… 11 1.2.5.2. Định lượng ………………………………………………………………. 12 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………… … 14 2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ ………… 14 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………… 14 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ………………………………………………… … 14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU …………………………………………… … 15 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………… 16 2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 16 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc …………………………………………. 16 2.3.3. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ………………………….…………. 16 2.3.4. Thẩm định phương pháp ………………………………………………… 17 2.3.4.1. Tính tương thích hệ thống ……………………………………………… 17 2.3.4.2. Tính đặc hiệu / chọn lọc …………………………………………………. 17 2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ……………………………… ……… 18 2.3.4.4. Độ lặp ……………………………………………………………………. 18 2.3.4.5. Độ đúng ………………………………………………… ……………… 19 2.3.4.6. Phương pháp xử lý kết quả ………………………………………………. 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………… 21 3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ……………………… …… 21 3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 21 3.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ………………………………………. 21 3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……………………… 22 3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký ……………………………………………………… 22 3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ………………………………………… 22 3.2.3. Lựa chọn pha động ………………………………………………………… 23 3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng …………………………………………… 25 3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP …………………………………………… 26 3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ………………………………… …… 26 3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp …………………………….……. 28 3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ………………………………………. 28 3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……………………………………… 30 3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ……………………………………… 31 3.4. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM ………………………………………………………… 33 3.5. BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………… 37 KẾT LUẬN ………………………………………………………………………. 37 ĐỀ XUẤT …………………………………………………………………… … 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ 1 ASEAN Association of Southeast Asian Nations 2 HPLC High performance liquid chromatography 3 DMSO Dimethyl sulfoxid 4 FDA Food and Drug Administration 5 DĐVN Dược điển Việt Nam 6 VN Việt Nam 7 LSX Lô sản xuất 8 HSD Hạn sử dụng 9 NSX Ngày sản xuất 10 SĐK Số đăng kí 11 KNTTW Kiểm nghiệm thuốc trung ương 12 SKS Số kiểm soát 13 CYP3A4 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 14 HDL High-density lipoprotein 15 LDL Low-density lipoprotein 16 dd Dung dịch 17 SIM Simvastatin 18 CA Calci atorvastatin 19 NXB Nhà xuất bản DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát pH đệm 24 2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động và tốc độ dòng 25 3 Bảng 3.3 Tính tương thích hệ thống 27 4 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của simvastatin 29 5 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của calci atorvastin 30 6 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với calci atorvastatin và simvastatin 31 7 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 32 8 Bảng 3.8 Kết quả định lượng một số chế phẩm có calci atorvastatin, simvastatin 34 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ STT Ký hiệu Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo calci atorvastatin 2 2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo simvastatin 4 3 Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu simvastatin (a) và của mẫu calci atorvastatin (b) 22 4 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm và 246 nm 23 5 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu khảo sát lựa chọn pha động với đệm pH 4,5 của mẫu simvastatin (a) và mẫu calci atorvastatin (b) 24 6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn kép ở pH 2,5 25 7 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép theo chương trình chạy đã xây dựng 26 8 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của simvastatin 29 9 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của calci atorvastatin 30 10 Hình 3.8 Sắc ký đồ định lượng một số chế phẩm với mẫu chuẩn kép (a), mẫu thử của chế phẩm Simvastatin (b) và mẫu thử của chế phẩm Atostin (c) 35 - 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở các nước trên thế giới ngày càng đa dạng và phức tạp, tỉ lệ những người mắc các bệnh tim mạch, tiểu đường, ung thư… ngày càng cao dần thay thế cho các bệnh nhiễm trùng trước đây. Điều này là do sự thay đổi của khí hậu, thói quen sinh hoạt khi đời sống đang ngày càng nâng cao. Việt Nam cũng không nằm ngoài quy luật này. Trước đây, mô hình bệnh tật ở Việt Nam chủ yếu là các bệnh nhiễm trùng thì nay mô hình bệnh tật đã hoàn toàn thay đổi: chỉ có 27% là các bệnh do vi trùng gây nên, có đến 62% các bệnh không phải do vi trùng (các bệnh lây nhiễm do siêu vi trùng) như: huyết áp, tâm thần, tim mạch, suy dinh dưỡng, tiểu đường còn lại 11% loại bệnh do tai nạn thương tích [4]. Theo số liệu của Cục Quản lý Dược, nguyên nhân gây tử vong chính ở Việt Nam hiện nay thuộc về nhóm bệnh tim mạch (13%) [4]. Trong đó phải nói đến các bệnh xơ vữa động mạch, với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não Nguyên nhân chủ yếu là do các rối loạn lipid máu. Calci atorvastatin và simvastatin là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng nhiều hiện nay. Tuy nhiên, trong các tài liệu trong nước như DĐVN IV và một số tài liệu nước ngoài chúng tôi tham khảo [3, 12, 15, 16, 17, 23], chưa có nhiều phương pháp chuẩn để định lượng hai chất này cũng như các statin khác hoặc quy trình còn phức tạp. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng các statin này là hết sức cần thiết. Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu cụ thể sau:  Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao  Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [...]... tích định tính và định lượng -8- Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký rây phân tử Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố 1.2.3 Sắc ký phân bố hiệu năng cao [1, 2] Sắc ký. .. µm - Bình định mức dung tích 10 ml, 20 ml, 100 ml - Pipet thủy tinh chính xác 5 ml, 10 ml - Ống đong dung tích 100 ml, 500 ml - Cốc có mỏ dung tích 50 ml, 100 ml, 1000 ml - Bơm tiêm, vial 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao - Lựa chọn điều kiện sắc ký  Lựa chọn cột sắc ký  Lựa chọn pha động và các điều... theo chương trình chạy đã xây dựng Như vậy qua kết quả khảo sát thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin trong chế phẩm như sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 G 1314A kết nối với detector UV-Vis - Cột sắc ký Apollo C18 5u ( 4,6 x 250 mm, 5µm) - Pha động: Acetonitril : đệm phosphat pH 2,5 (70 : 30) - Tốc độ dòng: 1,2... phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin  Phương pháp 1 [8]: Phương pháp: định lượng đồng thời atorvastatin, lovastatin và simvastatin bằng kỹ thuật sắc ký mixen điện động: - Dung dịch điện ly nền dinatri tetraborat 15 mM pH 8,0 chứa 50 mM chất hoạt động bề mặt sodium deoxycholat và 15% methanol - Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu quả 48,5... giữa pha tĩnh và pha động Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết  Pha tĩnh: Sắc ký lỏng - lỏng: pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác Các tiểu phân này thường có đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong sắc ký điều chế) Pha tĩnh... tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng - 12 - quang phổ thường gặp nhiều khó khăn, do đó sắc ký trong đó có HPLC thường được dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ 1.2.5.2 Định lượng Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc. .. ký Dung dịch chuẩn kép này chứa cả hai chất chuẩn ở nồng độ 0,15 mg/ml 3.2 KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký Qua các tài liệu nghiên cứu về định lượng calci atorvastatin và simvastatin, tôi thấy rằng các phương pháp đều sử dụng sắc ký phân bố pha đảo Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến với nhiều tính ưu việt Do đó, tôi đã lựa chọn sắc. .. của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các thành phần dung môi Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo - Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc ký pha thuận Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch thẳng như: pentan, hexan, heptan… Trong sắc ký pha thuận các... PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Khái niệm HPLC [2] HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh sử dụng 1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1, 7] Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha... chạy sắc ký các mẫu chuẩn đơn khảo sát của cả 2 chất ở 2 bước sóng 238 nm và 246 nm thu được kết quả về chiều cao của pic như sau: - Simvastatin: 278 mAU (tại 238 nm) và 205 mAU (tại 246 nm) - Calci atorvastatin: 469,85 mAU (tại 238 nm) và 488,3 mAU (tại 246 nm) Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm và 246 nm Ta thấy chiều cao pic của simvastatin thấp hơn nhiều so với calci atorvastatin . đồng thời calci atorvastatin và simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao  Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao - 2 - Chương. tài: Định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với hai mục tiêu cụ thể sau:  Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci. pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5 1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO