Định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin  Phương pháp 1 [8]: Phương pháp: định lượng đồng thời atorvastatin, lovastatin và simvastatin bằng kỹ thuật s

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội với sự hướng dẫn và chỉ bảo và giúp đỡ

tận tình của ThS Đặng Thị Ngọc Lan và DS Phạm Lê Minh cùng các thầy

cô trong bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới hai thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn, dìu dắt chỉ bảo tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu vì

đã luôn giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các kĩ thuật viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban giám hiệu, phòng đào tạo nhà trường và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường

Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Vũ Thị Quỳnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN ……… 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……… 2

1.1.1 Tổng quan về calci atorvastatin ……… 2

1.1.1.1 Tính chất ……… 2

1.1.1.2 Tác dụng dược lý ……… 2

1.1.1.3 Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3

1.1.2 Tổng quan về simvastatin ……… 4

1.1.2.1 Tính chất ……… 4

1.1.2.2 Tác dụng dược lý ……… 5

1.1.2.3 Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……… 5

1.1.3 Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 7

1.2.1 Khái niệm HPLC ……… 7

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký ……… 7

1.2.3 Sắc ký phân bố hiệu năng cao ……… 8

1.2.4 Các thông số đặc trưng trong HPLC ……… 9

1.2.4.1 Hệ số phân bố K ……… 9

1.2.4.2 Thời gian lưu tR ……… 9

1.2.4.3 Hệ số dung lượng k’ ……… 10

1.2.4.4 Hệ số chọn lọc α ……… 10

1.2.4.5 Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ……… ………… 10

1.2.4.6 Số đĩa lý thuyết N ……… 11

1.2.4.7 Độ phân giải RS ……… 11

1.2.5 Ứng dụng của HPLC ……… 11

1.2.5.1 Định tính ……… 11

1.2.5.2 Định lượng ……… 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… … 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ ………… 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ……… 14

2.1.2 Hóa chất và thiết bị ……… … 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ……… … 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 16

2.3.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ……… 16

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc ……… 16

2.3.3 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ……….………… 16

2.3.4 Thẩm định phương pháp ……… 17

2.3.4.1 Tính tương thích hệ thống ……… 17

2.3.4.2 Tính đặc hiệu / chọn lọc ……… 17

2.3.4.3 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ……… ……… 18

2.3.4.4 Độ lặp ……… 18

2.3.4.5 Độ đúng ……… ……… 19

2.3.4.6 Phương pháp xử lý kết quả ……… 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ……… 21

3.1 XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ……… …… 21

3.1.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ……… 21

3.1.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ……… 21

3.2 KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……… 22

3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký ……… 22

3.2.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện ……… 22

3.2.3 Lựa chọn pha động ……… 23

3.2.4 Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng ……… 25

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ……… 26

3.3.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống ……… …… 26

3.3.2 Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp ……….…… 28

3.3.3 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ……… 28

3.3.4 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……… 30

3.3.5 Khảo sát độ đúng của phương pháp ……… 31

3.4 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN TRONG CHẾ PHẨM ……… 33

3.5 BÀN LUẬN ……… 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……… 37

KẾT LUẬN ……… 37

ĐỀ XUẤT ……… … 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ASEAN Association of Southeast Asian Nations

2 HPLC High performance liquid chromatography

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo calci atorvastatin 2

3 Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu

simvastatin (a) và của mẫu calci atorvastatin (b) 22

4 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm

5 Hình 3.3

Sắc ký đồ mẫu khảo sát lựa chọn pha động với đệm

pH 4,5 của mẫu simvastatin (a) và mẫu calci

atorvastatin (b)

24

6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn kép ở pH 2,5 25

7 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép theo chương trình chạy đã

8 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng

độ và diện tích pic của simvastatin 29

9 Hình 3.7

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng

độ và diện tích pic của calci atorvastatin 30

10 Hình 3.8

Sắc ký đồ định lượng một số chế phẩm với mẫu chuẩn kép (a), mẫu thử của chế phẩm Simvastatin (b) và mẫu thử của chế phẩm Atostin (c)

35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở các nước trên thế giới ngày càng đa dạng và phức tạp, tỉ lệ những người mắc các bệnh tim mạch, tiểu đường, ung thư… ngày càng cao dần thay thế cho các bệnh nhiễm trùng trước đây Điều này là do sự thay đổi của khí hậu, thói quen sinh hoạt khi đời sống đang ngày càng nâng cao Việt Nam cũng không nằm ngoài quy luật này Trước đây, mô hình bệnh tật ở Việt Nam chủ yếu là các bệnh nhiễm trùng thì nay mô hình bệnh tật đã hoàn toàn thay đổi: chỉ có 27% là các bệnh do vi trùng gây nên, có đến 62% các bệnh không phải do vi trùng (các bệnh lây nhiễm do siêu vi trùng) như: huyết áp, tâm thần, tim mạch, suy dinh dưỡng, tiểu đường còn lại 11% loại bệnh do tai nạn thương tích [4]

Theo số liệu của Cục Quản lý Dược, nguyên nhân gây tử vong chính ở Việt Nam hiện nay thuộc về nhóm bệnh tim mạch (13%) [4] Trong đó phải nói đến các bệnh

xơ vữa động mạch, với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu

cơ tim, nhồi máu não Nguyên nhân chủ yếu là do các rối loạn lipid máu Calci atorvastatin và simvastatin là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng nhiều hiện nay Tuy nhiên, trong các tài liệu trong nước như DĐVN IV và một số tài liệu nước ngoài chúng tôi tham khảo [3, 12, 15, 16, 17, 23], chưa có nhiều phương pháp chuẩn để định lượng hai chất này cũng như các statin khác hoặc quy trình còn phức tạp Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng các statin này là hết sức cần thiết

Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời calci

atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

với hai mục tiêu cụ thể sau:

 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và

simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng

sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU

1.1.1 Tổng quan về calci atorvastatin

1.1.1.1 Tính chất

a Công thức cấu tạo [5, 23]

Calci atorvastatin là một thuốc trong nhóm statin, thuộc dẫn chất acid heptanoic (không đóng vòng δ-lacton) Thuốc có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo calci atorvastatin

Công thức phân tử: C66H68CaF2N4O10

Phân tử lượng: 1155,34

Tên khoa học: Calcium (β R, δ R)-2-(p-fluorophenyl)-β,

δ-dihydroxy-5-isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)pyrrole-1-heptanoate (1:2), trihydrate [344423-98-9] Anhydrous [134523-03-8]

b Tính chất vật lý [16, 21, 23]

Calci atorvastatin có dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng nhạt Tan nhiều trong methanol, hơi tan trong rượu, không tan đến ít tan trong nước cất, đệm phosphat pH 7,4 và trong acetonitril

tác cho phản ứng biến đổi 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG CoA) thành mevalonate, đây là bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol tại gan do đó làm giảm lượng cholesterol Ức chế cạnh tranh với enzyme khử HMG CoA làm giảm tổng hợp cholesterol, tăng biểu hiện của các thụ thể lipoprotein mật

độ thấp (thụ thể LDL) trên tế bào gan, điều này làm tăng hấp thu LDL bởi các tế bào gan, làm giảm lượng LDL - cholesterol trong máu Như các statin khác, calci atorvastatin cũng làm giảm nồng độ triglyceride trong máu và hơi làm tăng lượng HDL - cholesterol

Dược động học: Calci atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống, với thời gian xấp

xỉ nồng độ tối đa (T max) 1 - 2 giờ Sinh khả dụng tuyệt đối của thuốc là khoảng 14%, tỉ lệ gắn với protein cao (≥ 98%) Cơ chế chuyển hóa chính của calci atorvastatin là thông qua cytochrom P450 3A4 hydroxyl để tạo thành ortho và parahydroxylated hoạt động Calci atorvastatin chủ yếu đào thải qua gan mật, có ít hơn 2% thu hồi trong nước tiểu Thời gian bán thải của thuốc là 14 giờ, hầu như không có chu kỳ gan ruột

1.1.1.3 Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm

- Pha động: Dung dịch đệm kali dihydrogen phosphat pH 3,0 : acetonitril

(60 : 40)

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm

 Phương pháp 3 [23]

- Cột: Cột L7 ( 25 cm x 4,6 mm x 5µm), điều nhiệt cột ở 35 oC

Pha động: chương trình gradient dung môi như sau:

+ Dung môi A: acetonitril : tetrahydrofuran : đệm ammonium acetat pH 5,0 ± 0,1 (21 : 12 : 67)

+ Dung môi B: acetonitril : tetrahydrofuran : đệm ammonium acetat pH 5,0 ± 0,1 (61 : 12 : 27)

Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)

a Công thức cấu tạo [6, 22, 23]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo simvastatin

Công thức phân tử: C25H38O5

Phân tử lượng: 418,57

Tên khoa học: Butanoic acid, 2,2-dimethyl-, dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)ethyl]-1-naphthalenyl ester, [1S-[1α,3α,7β,8β (2S*,4S*),8aβ]]

Là một trong các statin như calci atorvastatin, simvastatin cũng hoạt động theo

cơ chế ức chế enzyme khử HMG-CoA (3- Hydroxymethyl- 3- Glutaryl Coenzyme A reductase inhibitors) ở trong gan Đây là một enzyme khử cần thiết cho việc sản sinh cholesterol giai đoạn sớm Trong máu, simvastatin làm giảm cholesterol toàn phần và lipoprotein mật độ thấp (LDL) hay cholesterol "xấu" cũng như triglycerid Simvastatin cũng làm tăng lipoprotein mật độ cao (HDL) hay cholesterol

"tốt" Tăng mức cholesterol HDL, cũng như làm giảm cholesterol LDL có thể làm chậm sự phát triển của bệnh động mạch vành

Dược động học: Simvastatin hấp thụ nhanh sau khi uống, qua chuyển hóa lần đầu qua gan và có sinh khả dụng tuyệt đối là 5%, nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 4 giờ Phân bố chủ yếu đến gan, qua được hàng rào máu não, 95% liên kết với protein huyết tương Qua gan, simvastatin được chuyển hóa bới CYP3A4 thành dạng có hoạt tính Thời gian bán thải của simvastatin là 2 giờ và 1,9 giờ với simvastatin dạng acid Thải trừ chủ yếu qua phân (60%) và thận (13%)

1.1.2.3 Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm

 Phương pháp 1 [12]:

- Cột Hypersil ODS 25 cm x 4.,6 mm, 5 µm, điều nhiệt cột ở 45oC

- Pha động: đệm phosphat pH 4,5 : acetonitril (7 : 13)

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 238

- Pha động: acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH 4,5 (65 : 35)

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, bước sóng ghi: 238

nm

1.1.3 Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin

 Phương pháp 1 [8]:

Phương pháp: định lượng đồng thời atorvastatin, lovastatin và simvastatin bằng

kỹ thuật sắc ký mixen điện động:

- Dung dịch điện ly nền dinatri tetraborat 15 mM pH 8,0 chứa 50 mM chất hoạt động bề mặt sodium deoxycholat và 15% methanol

- Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu quả 48,5 cm, đường kính trong 50 µm; nhiệt độ cột 30oC; điện thế 30 kV Kiểu tiêm mẫu 50 mbar x 5 giây Bước sóng phát hiện 237 nm

- Calci atorvastatin được dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng cho simvastatin và lovastatin Lovastatin dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng calci atorvastatin

 Pha động: gradient dung môi của dung môi A (acetonitril + methyl acetat

2 mM + acid acetic 0,1%) và dung môi B (nước + methyl acetat 2 mM + acid acetic 0,1%)

 Hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ESI+

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1, 7]

Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký rây phân tử Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố

1.2.3 Sắc ký phân bố hiệu năng cao [1, 2]

Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc

vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết

 Pha tĩnh:

Sắc ký lỏng - lỏng: pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác Các tiểu phân này thường có đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong sắc ký điều chế) Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha

động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng

Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc phục được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol Tính phân cực của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết

 Pha động:

Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung môi Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các thành phần dung môi

Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân

cực được gọi là sắc ký pha thuận Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch thẳng như: pentan, hexan, heptan… Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử

- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc

ký pha đảo Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc Chất càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa giải sớm Dung môi pha động thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan trọng trong sắc ký pha đảo

1.2.4 Các thông số đặc trưng trong HPLC [1, 2, 7]

1.2.4.1 Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

K = Trong đó: CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/lit)

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/lit)

Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính Thời gian lưu của mỗi chất phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

Trong một phép phân tích nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, nếu tR quá lớn thì pic

bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc

VM: thể tích pha động (lít)

CS: nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh (mol/lít)

CM: nồng độ mol chất tan trong pha động (mol/lít)

Với quy ước KB >KA nên α luôn lớn hơn 1

Để tách riêng 2 chất thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 ÷ 2 Nếu α quá lớn thời gian phân tích sẽ dài

1.2.4.5 Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký

Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:

 Hệ số bất đối AF:

AF = Trong đó: a: Nửa chiều rộng phía trước pic

b: Nửa chiều rộng phía sau pic

(cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic)

Giá trị AF càng gần 1, pic càng đối xứng

 Hệ số kéo đuôi A S :

AS =

Với a và b đo ở 1/20 chiều cao pic

Nếu AS càng lớn hơn 1, pic kéo đuôi càng nhiều, pic càng mất cân đối

1.2.4.6 Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

N = 16 = 5,54

/

Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic

W1/2: chiểu rộng đo ở nửa chiều cao pic

tR,B, tR,A: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2,B, W1/2,A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị trên được tính theo cùng một đơn vị

Độ phân giải RS còn được tính theo công thức:

sinh vật HPLC có các ứng dụng phổ biến sau:

1.2.5.1 Định tính

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (tR) của chất phân tích trong cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ…), những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng

quang phổ thường gặp nhiều khó khăn, do đó sắc ký trong đó có HPLC thường được dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ

1.2.5.2 Định lượng

Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic

Các phương pháp định lượng trong HPLC [2]

 Phương pháp chuẩn ngoại

Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn và mẫu thử sẽ tính được

nồng độ các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm

- Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với mẫu thử, tiến

hành sắc ký cả hai mẫu trong cùng điều kiện Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

CX = CS Trong đó:

CX: nồng độ mẫu thử

CS: nồng độ mẫu chuẩn

SX (HX): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

SS (HS): diện tích (chiều cao) của píc mẫu chuẩn

- Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định

 Phương pháp chuẩn nội

Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này

gọi là chuẩn nội Từ dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của chất cần phân tích trong mẫu thử

Yêu cầu của chất chuẩn nội là:

- Tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích

- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất thử

- Không phản ứng với các thành phần trong mẫu thử

- Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

 Phương pháp thêm chuẩn

Nguyên tắc: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

Nồng độ chưa biết CX của mẫu thử được tính theo công thức:

CX = SX ∆

∆

Trong đó: SX: diện tích (hoặc chiều cao) của pic mẫu thử

∆C: lượng chất chuẩn thêm vào ∆S: sự chênh lệch diện tích pic (hoặc chiều cao)

 Kỹ thuật thêm đường chuẩn

Nguyên tắc: chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau

và các chất chuẩn với lượng tăng dần Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của pic tổng (thử + chuẩn) với lượng hoặc nồng độ chất chuẩn thêm vào (∆C) Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành là nồng độ của chất cần xác định

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chế phẩm có chứa calci atorvastatin 10mg:

- Viên nén Lipitad (STADA - VN), SĐK: VD-10728-10, NSX: 27-05-2012, HSD: 27-05-2015, LSX: 030512

- Viên nén Atostin (Công ty DP Trường Thọ), SĐK: VD-9565-09, NSX: 02-2012, HSD: 17-02-2015, LSX: 121

17 Viên nén Hacortin (COHAVINA 17 XNDP150), SĐK: VD17 459217 09, NSX: 30-11-2012, HSD: 30-11-2014, LSX: 28211

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

a Hóa chất

- Acetonitril, methanol tinh khiết loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)

- Chất chuẩn: simvastatin hàm lượng 99,14% (SKS: 0210182.02) và calci atorvastatin khan hàm lượng 98,77%, độ ẩm 4,98% (SKS: WS 0208225) do Viện KNTTW cung cấp

- Natriumdihydrogenphosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O) (Merck, Đức)

- Acid ortho - phosphoric 85% (Merck, Đức)

- Máy đo pH Eutech Instrument pH510 (Singapore)

- Autopipet 100 - 1000 µl, 1000 - 5000 µl (Nhật)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức)

- Máy li tâm Harmonic Series (Đài Loan)

- Máy hút chân không Vacuubrand Membran (Đức)

- Màng lọc Satorius cellulose acetat 0,4 µm (Đức)

- Cân phân tích Sartorius TE214S có độ chính xác ± 0,1 mg (Đức)

- Bơm tiêm, vial

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Lựa chọn điều kiện sắc ký

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xử lý và chuẩn bị mẫu thử

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp

Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích

Muốn định lượng được dược chất trong chế phẩm vấn đề đầu tiên cần quan tâm

là có được quy trình xử lý mẫu hợp lý, đảm bảo dược chất được chiết tách hoàn toàn vào mẫu thử, không bị biến đổi tính chất và không lẫn quá nhiều tạp gây sai lệch cho kết quả phân tích

Tham khảo các tài liệu kết hợp với thực nghiệm khảo sát lựa chọn ra quy trình

xử lý mẫu thích hợp Tiến hành xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu

Để có thể định lượng được dược chất trong các chế phẩm, việc chuẩn bị dung dịch gốc đối chiếu và các mẫu chuẩn là rất cần thiết, cần được tiến hành đồng thời với việc chuẩn bị mẫu thử

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản dung dịch chuẩn gốc

2.3.3 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký

Là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký, quyết định thời gian lưu giữa các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu và một số phương pháp định lượng các chất này ở các tài liệu tham khảo, pha động chúng tôi lựa chọn là hỗn hợp của acetonitril và đệm phosphat

Tiến hành khảo sát pha động về pH đệm, tỉ lệ pha động và tốc độ dòng để lựa chọn được các điều kiện phù hợp

2.3.4 Thẩm định phương pháp [9]

2.3.4.1 Tính tương thích hệ thống

Khảo sát tính tương thích hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm: máy móc thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử… Việc khảo sát tiến hành bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số kéo đuôi, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic

Yêu cầu: RSD không lớn hơn 2 (%)