Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng được quy trình định lượng đồng thời DA, BE, PR và TR trong mỹ phẩm bằng HPLC, góp phần đảm bảo chất lượng mỹ phẩm lưu hành trên thị trường. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI DEXAMETHASON ACETAT, BETAMETHASON, PREDNISOLON VÀ TRIAMCINOLON TRONG MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Xuyên*; Hoàng Việt Dũng*; Hoàng Mỹ Hạnh* Đào Văn Đơn*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng đồng thời đồng thời dexamethason acetat (DA), betamethason (BE), prednisolon (PR) triamcinolon (TR) mỹ phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV, pha động ACN:H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl Quy trình định lượng thẩm định đầy đủ Trong khoảng nồng độ - 50 g/ml, diện tích pic nồng độ có tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ Giới hạn định lượng chất DA, BE, PR TR 0,25 g/ml; 0,36 g/ml; 0,30 g/ml 0,33 g/ml Độ lặp lại < 3%, độ 93 - 99% Quy trình ứng dụng để kiểm tra DA, BE, PR TR mỹ phẩm thị trường * Từ khóa: Sắc ký lỏng hiệu cao; Glucocorticoid; Dexamethason acetat; Betamethason; Prednisolon; Triamcinolon; Mỹ phẩm SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DEXAMETHASONE ACETATE, BETAMETHASONE, PREDNISOLONE AND TRIAMCINOLONE IN COSMETICS BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous determination of glucocorticoids (dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone) in cosmetics was validated Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, µm) column, UV detection at 240 nm and flow at 1.0 ml/min The quantitation limits of dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone were about 0.25 g/ml; 0.36 g/ml; 0.30 g/ml 0.33 g/ml, respectively The calibration curve of each glucocorticoid had a correlation coefficient close to The precisions were all less than 3% The recovery rates of extraction were 93 - 99% for all glucocorticoids This method can be used to detemine dexamethasone acetate, betamethasone, prednisolone and triamcinolone simultaneously in cosmetics * Key words: HPLC; Glucocorticoid; Dexamethasone acetate; Betamethasone; Prednisolone; Triamcinolone; Cosmetics * Học viện Quân y ** Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Néi Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daodonvan@yahoo.com) Ngày nhận bài: 8/5/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 17/6/2013 Ngày báo đăng: 20/6/2013 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong xã hội đại, nhu cầu sử dụng mỹ phẩm ngày nhiều hiệu độ an toàn mỹ phẩm vấn đề đáng quan tâm với ngành dược mỹ phẩm Một số doanh nghiệp bất chấp an toàn người tiêu dùng, trộn số thuốc vào mỹ phẩm, đặc biệt glucocorticoid (GC) Trong đó, DA, BE, PR TR… GC rẻ tiền, dễ kiếm thường sử dụng để trộn mỹ phẩm [2, 3, 4] GC thuốc có tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng, ức chế miễn dịch thuốc phải bán theo đơn Các mỹ phẩm trộn lẫn GC có nhiều tác dụng khơng mong muốn như: teo da, xơ cứng bì, viêm da đỏ ửng, giãn mao mạch, mụn trứng cá bội nhiễm nấm, vi khuẩn, virut… Xuất phát từ vấn đề trên, năm 2003, Hiệp định Hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm có quy định cấm trộn GC vào mỹ phẩm [1] Ở nước ta, nghiên cứu định lượng đồng thời nhiều GC mỹ phẩm hạn chế Thực tế, đòi hỏi cần có quy trình phân tích đồng thời nhiều GC mỹ phẩm Vì vậy, tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời DA, BE, PR TR mỹ phẩm HPLC, góp phần đảm bảo chất lượng mỹ phẩm lưu hành thị trường NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Mẫu trắng: mẫu tự tạo bào chế dạng kem dầu nước (D/N), dạng bào chế thường gặp với mỹ phẩm làm trắng da thị trường Thành phần gồm: alcol cetylic, avÝt stearic, dầu parafin, span 80, tween 80, ethanol 96%, propylen glycol, alcol paraben, nước cất - Mẫu thử: mẫu tự tạo có thành phần giống mẫu trắng, đồng thời trộn GC với hàm lượng 0,05% chất * Dung mơi, hố chất: - Chất chuẩn: DA, BE, PR TR Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW cung cấp - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn HPLC - Các hố chất, dung mơi khác: ethanol, methanol…đạt tiêu chuẩn phân tích * Thiết bị dụng cụ phân tích: Các thiết bị phân tích chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 (2005) bao gồm: - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, àm) Phn mm x lý s liu Empowerđ - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích Sartorius độ xác 0,1 mg, máy lắc siêu âm, dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ xác thích hợp Phƣơng pháp nghiên cứu * Khảo sát quy trình định lượng: Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2, 3, 4], lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau: Cân xác 2,0 gam mẫu thử vào cốc mỏ 100 ml Thêm 20 ml MeOH vào cốc, lắc siêu âm 10 phút 400C Ngâm nước đá 30 phút Lọc dịch chiết qua giấy lọc thấm ẩm MeOH vào bình định mức 100 ml Thêm tiếp 20 ml MeOH vào cốc mỏ, tiến hành chiết (làm lần), gộp dịch chiết vào bình định mức; tráng cốc giấy lọc 10 ml MeOH (làm lần) chuyển vào bình định mức Sau đó, thêm MeOH đến vạch, lắc Lọc lạnh qua màng lọc 0,45 µm để phân tích HPLC * Điều kiện sắc ký [2, 3, 4] : TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Sau tham khảo tài liệu, lựa chọn điều kiện sau: (45/55) (v/v); hệ pha động (ACN:H2O) với tỷ lệ 30/70, 45/55 60/40 (v/v) Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV-Vis đo bước sóng 240 nm, Thể tích bơm mẫu 50 µl, tốc độ dòng 1,0 ml/phút Tiến hành khảo sát hệ pha động: hệ pha động MeOH:H2O với tỷ lệ * Thẩm định quy trình định lượng: Thẩm định quy trình định lượng với tiêu: tính tương thích hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ xác, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình định lượng ghi sắc ký đồ (hình 1) Phân tích kết quả, lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời chất DA, BE, PR TR sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm); detector UV - Vis; pha động ACN:H2O (45:55, v/v); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích bơm mẫu 50 µl AU 0.04 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 Hình 1: Sắc ký đồ DA, BE, TR PR với pha động ACN:H2O 45/55 (v/v) Thẩm định quy trình định lƣợng * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiêm sắc ký lần mẫu chuẩn hỗn hợp gồm chất DA, BE, PR TR có nồng độ 10 µg/ml Chạy sắc ký theo điều kiện chọn Bảng 1: Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký PR STT tR (phút) BE Spic (μV.s) tR (phút) 4,647 314.768 4,651 4,640 TR Spic (μV.s) tR (phút) 6,058 261.884 318.520 6,069 309.783 6,063 DA Spic Spic (μV.s) tR (phút) (μV.s) 7,157 223.465 12,931 249712 258.638 7,210 228.490 12,945 256374 262.578 7,148 218.861 13,027 249458 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 4,650 307.681 6,110 259.004 7,153 221.276 12,935 253781 4,693 318.205 6,066 266.254 7,167 217.753 13,025 250485 4,655 314.571 6,092 269.578 7,208 221.250 12,942 259381 X 4,656 313.921,3 6,076 262.989,3 7,174 221.849,2 12,968 253.198,5 SD 0,017 4.014,64 0,018 3.878,93 0,026 3.490,63 0,042 3.700,37 RSD (%) 0,37 1,28 0,30 1,47 0,36 1,57 0,32 1,46 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic chất < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, ứng dụng để phân tích mẫu với kết tin cậy * Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp PR, BE, TR DA có nồng độ µg/ml, mẫu trắng mẫu thử 0.010 AU BE PR 0.005 a TR DA 0.000 -0.005 -0.010 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Minutes 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 0.010 b 0.008 AU 0.006 0.004 0.002 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Minutes 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 0.010 BE PR c TR DA AU 0.005 0.000 -0.005 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Minutes 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 Hình 2: Sắc ký đồ PR, BE, TR DA mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng (a Mẫu chuẩn hỗn hợp PR, BE, TR DA pha MeOH; b Mẫu trắng khơng có chất phân tích; c Mẫu thử có chất phân tích) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Trên sắc ký đồ mẫu trắng, vị trí tương ứng với thời gian lưu PR, BE, TR DA không xuất pic mẫu chuẩn Các pic chất phân tích mẫu thử cân đối tách hồn tồn khỏi pic tạp Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt độ đặc hiệu cao * Khoảng tuyến tính: Pha dãy dung dịch chuẩn PR, BE, TR DA nồng độ khoảng - 50 µg/ml, tiến hành sắc ký Bảng 2: Kết xác định mối tương quan nồng độ diện tích pic PR, BE, TR DA LOẠI GC DUNG DỊCH Nồng độ (µg/ml) PR Diện tích pic (μV.s) 1,04 2,08 5,20 10,40 20,80 52,00 27.135 59.340 155.850 305.741 598.679 151.4761 Phương trình hồi quy: y = 30274x - 401 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) BE Diện tích pic (μV.s) 1,02 2,04 5,1 10,2 20,4 51,00 24.188 52.139 124.989 263.733 515.347 1.286.017 Phương trình hồi quy: y = 25733x + 322 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) TR Diện tích pic (μV.s) 1,00 2,00 5,00 10,00 20,00 50,00 22.397 47.102 103.730 232.912 452.023 1.131.057 Phương trình hồi quy: y = 22642x - 550 Hệ số tương quan: R² = 0,9998 Nồng độ (µg/ml) DA Diện tích pic (μV.s) 0,96 1,92 4,80 9,60 19,20 48,00 24.621 46.506 126.078 259.029 520.997 1.280.242 Phương trình hồi quy: y = 25677x - 350 Hệ số tương quan: R² = 0,9999 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Hình 3: Đường biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PR, BE, TR, DA Diện tích pic nồng độ PR, BE, TR DA khoảng khảo sát có tương quan chặt chẽ với R2 ≈ * Độ lặp lại: Cân xác g mẫu thử (với lần cân khác nhau) xử lý theo quy trình xử lý mẫu Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Bảng 3: Kết xác định độ lặp lại phương pháp HPLC HÀM LƯỢNG CỦA TỪNG GC TÌM THẤY TRONG MẪU TỰ TẠO (mg/100 g) STT PR BE TR DA 48,72 48,93 48,23 47,92 47,53 48,52 46,56 47,03 47,12 46,91 47,91 48,26 47,23 48,52 45,24 49,35 46,89 47,28 46,08 47,79 45,57 46,65 48,02 46,34 X 47,18 47,80 47,01 47,78 SD 1,02 0,97 1,23 1,03 RSD (%) 2,16 2,03 2,62 2,16 Độ lệch chuẩn tương đối < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích * Độ đúng: Cân xác g mẫu thử (6 lần cân khác nhau) Thêm lượng xác chất chuẩn hỗn hợp PA, BE, TR DA (200 µg), trộn đều, tiến hành xử lý mẫu phân tích sắc ký theo điều kiện chọn TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 Bảng 4: Kết khảo sát độ phương pháp HPLC LOẠI CHẤT PR BE TR DA LƯỢNG THẤM VÀO (µg) LƯỢNG TÌM LẠI CỦA GC CHUẨN THẤM VÀO (µg) TỶ LỆ TÌM LẠI (%) 208 204,68 98 208 199,32 96 208 201,25 97 208 195,05 94 208 202,12 97 208 194,47 93 204 201,08 99 204 200,01 98 204 194,54 95 204 195,67 96 204 202,55 99 204 190,81 94 200 198,34 99 200 186,56 93 200 195,78 98 200 191,23 96 200 195,57 98 200 188,89 94 192 190,45 99 192 178,96 93 192 185,67 97 192 180,45 94 192 185,56 97 192 186,43 97 TÍNH TỐN THỐNG KÊ X (%) = 95,83 SD = 1,94 RSD (%) = 2,02 X (%) = 96,83 SD = 2,14 RSD (%) = 2,21 X (%) = 96,71 SD = 2,42 RSD (%) = 2,50 X (%) = 96,17 SD = 2,23 RSD (%) = 2,32 Tỷ lệ thu hồi PR, BE, TR DA cao (từ 95,83 - 96,83%) cho thấy: phương pháp chiết lựa chọn cho phép chiết gần hoàn toàn PR, BE, TR DA với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ cao * Giới hạn phát giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường mẫu trắng đường chuẩn, ngoại suy giới hạn định lượng PR, BE, TR DA 0,30 µg/ml; 0,36 µg/ml; 0,33 µg/ml 0,25 µg/ml Giới hạn phát PR, BE, TR DA tương ứng 0,09 µg/ml; 0,11 µg/ml; 0,10 µg/ml 0,08 µg/ml TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời PR, BE, TR DA phương pháp HPLC Quy trình xử lý mẫu: chiết MeOH (3 lần), lọc qua màng lọc 0,45 µm để phân tích HPLC Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV, pha động ACN:H2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl Quy trình định lượng thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn ICH ứng dụng để kiểm tra GC mỹ phẩm thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Hiệp định hệ thống hoà hợp quản lý mỹ phẩm (Agreement on the ASEAN harmonized Cosmetic Regulatory Scheme) ký ngày 2-9-2003 Asean Identification of dexamethasone, betamethasone, hydrocortisone acetate, betamethasone 17-valerate, and triamcinolone acetonide in cosmetic products by TLC and HPLC, ACM MAL 07 Nam Y S, I K Kwon et al Quantitative monitoring of corticosteroids in cosmetic products manufactured in Korea using LC-MS/MS Forensic Scient 2012, 220 (1-3), pp.23-28 Wu Da-nan, Zheng He-Hui, Wang Ping, Li Jie Determination of glucocorticoids in cosmetics by ultra performance liquid chromatography Chinese journal of health laboratory technology 2008 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2013 ... Hiệp định Hòa hợp ASEAN quản lý mỹ phẩm có quy định cấm trộn GC vào mỹ phẩm [1] Ở nước ta, nghiên cứu định lượng đồng thời nhiều GC mỹ phẩm hạn chế Thực tế, đòi hỏi cần có quy trình phân tích đồng. .. tích đồng thời nhiều GC mỹ phẩm Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời DA, BE, PR TR mỹ phẩm HPLC, góp phần đảm bảo chất lượng mỹ phẩm lưu hành... hiện, giới hạn định lượng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình định lượng ghi sắc ký đồ (hình 1)