Nội dung bài viết trình bày về việc nghiên cứu bào chế viên nang cứng Ukata với tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư. Sản phẩm có thành phần tam thất với hoạt chất chính là các ginsenosid. Đây là những hoạt chất chính góp phần tạo ra tác dụng của sản phẩm. Vì vậy, chỉ tiêu định lượng này cần được đánh giá để đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng tốt, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID RG1, RE, RB1 VÀ RD TRONG VIÊN NANG UKATA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Chu Huy*; Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương* Nguyễn Văn Bạch*; Đào Văn Đơn* TĨM TẮT Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang cứng Ukata xây dựng thẩm định Pha động gåm acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, mm), detector UV 203 nm tốc độ dòng 1,5 ml/phút Các ginsenosid tách hồn tồn thời gian 50 phút Giới hạn định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd nằm khoảng 6,0 - 8,0 µg/ml Diện tích pic nồng độ ginsenosid có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ≈ Phương pháp có độ xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2% Tỷ lệ thu hồi ginsenosid từ 93 - 100% Phương pháp sử dụng để định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang cứng Ukata sản phẩm khác có chứa tam thất * Từ khóa: Ginsenosid; Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC SIMULTANEOUS DETERMINATION OF GINSENOSIDE RG1, RE, RB1 AND RD IN UKATA CAPSULES BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata capsules was validated Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, µm) column, UV detection at 203 nm and flow at 1.5 ml/min, the ginsenosides were separated satisfactorily within 50 minutes The quantitation limits of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd were about 6.0 to 8.0 µg/ml The calibration curve of each ginsenoside had a correlation coefficient close to The precisions were all less than 2% The recovery rates of extraction were 93 - 100% for all ginsenosides This method should be used to detemine ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata capsules and other products containing Panax pseudoginseng * Key words: Ginsenoside, Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, thuốc chống ung thư chủ yếu có nguồn gốc hóa dược, phải nhập với giá thành cao, khơng chủ động nguồn nguyên liệu, phụ thuộc nhiều vào hãng dược phẩm nước ngồi, nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có Việt Nam chưa tận dụng Thực trạng cho thấy, cần phải nghiên cứu sản xuất thuốc * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/10/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/11/2013 Ngày báo đăng: 12/12/2013 42 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu nước, tạo sản phẩm chất lượng tốt, giá hợp lý, phù hợp điều kiện kinh tế Việt Nam Xuất phát từ vấn đề trên, Học viện Quân y tiến hành nghiên cứu bào chế viên nang cứng Ukata với tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư Sản phẩm có thành phần tam thất với hoạt chất ginsenosid [1] Đây hoạt chất góp phần tạo tác dụng sản phẩm Vì vậy, tiêu định lượng cần đánh giá để đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng tốt, góp phần bảo vệ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Viên nang cứng Ukata (lô 0812, NSX 08.08.2012, HSD 08.08.2014) sản xuất Học viện Quân y, đạt TCCS - Thành phần viên nang cứng Ukata: cao khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100 mg; cao khô tam thất 80 mg, tá dược (talc, magnesi stearat) vừa đủ viên - Mẫu trắng: mẫu tự tạo không chứa tam thất * Dung mơi, hố chất: - Chất chuẩn: ginsenosid Rg1 (98,5%), Rb1 (99,0%), Re (99,2%), Rd (99,3%) SigmaAldrich - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn HPLC - Các hố chất, dung mơi khác: ethanol, methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether, H2SO4 đặc đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích * Thiết bị dụng cụ phân tích: Tất thiết bị phân tích chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005, bao gồm: - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, kênh dung mơi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA (203 nm), cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm) Phần mềm xử lý số liệu Empower® - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích Sartorius độ xác ± 0,1 mg, dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ xác phù hợp Phƣơng pháp nghiên cứu * Khảo sát quy trình định lượng: Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2, 3, 4], chúng tơi lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau: Lấy 20 viên nang cứng Ukata, bóc bỏ vỏ nang, trộn Xác định khối lượng trung bình viên Cân xác 1,0 gam bột viên nang, thêm 15 ml MeOH, hòa tan máy siêu âm Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút Hút lấy dịch Cắn tiếp tục hòa tan thêm lần (10 ml x lần) Tập trung dịch dịch chiết, bốc chân khơng tới cắn, hòa tan cắn 10 ml MeOH Lọc qua màng lọc 0,45 µm, đem dịch lọc phân tích HPLC - Điều kiện sắc ký [2, 3, 4]: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector PDA ghi phổ 200 - 400 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl Tiến hành khảo sát pha động ACN:H2O chạy theo chương trình gradient * Thẩm định quy trình định lượng: Thẩm định quy trình định lượng theo ICH gồm tiêu: tính tương thích hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ xác, độ 43 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu, ghi sắc ký đồ phân tích kết Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời ginsenosid sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm) Detector PDA 203nm; tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl Pha động ACN:nước chạy theo chương trình sau: - > 20 phút: 19 - > 20% ACN; 20 - > 30 phút: 20 - > 32% ACN; 30 - > 40 phút: 32 - > 36% ACN; 40 - > 50 phút: 36 - > 38% ACN Thẩm định quy trình định lƣợng * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp Rg1, Re, Rb1 Rd có nồng độ 50 µg/ml, tiến hành phân tích sắc ký HPLC lần liên điều kiện lựa chọn Bảng 1: Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký (m/s) TT Rg1 Re Rb1 Rd Rg1 Re Rb1 Rd 26,91 27,34 39,01 44,03 121094 148579 89957 95763 27,02 27,11 38,05 43,89 120634 147556 90238 94613 26,93 26,45 39,55 44,93 119234 146867 91078 93971 26,94 27,31 38,46 44,02 121154 149668 91555 94722 27,03 27,33 39,12 44,78 119134 147578 91473 93587 X 26,97 27,11 38,84 44,33 120250 148050 90860 94531 RSD 0,22 1,4 1,52 1,11 0,8 0,7 0,8 0,9 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu thời gian lưu diện tích pic ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd nhỏ 2% Như vậy, hệ thống sắc ký hoàn toàn đáp ứng yêu cầu để phân tích ginsenosid * Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd MeOH nồng độ 50 µg/ml mẫu thử 44 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (a) Rb1 Rd Rg1 Re (b) Rg1 Rb1 (c) Rd Re Hình 1: Sắc ký đồ ginsenosid mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) mẫu thử (c) Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid mẫu thử Ukata cho thấy: thời điểm xuất pic ginsenosid mẫu chuẩn, không xuất pic tương ứng mẫu trắng Đồng thời, thời điểm sắc ký đồ mẫu thử xuất đáp ứng pic tách hoàn toàn khỏi pic tạp, pic ginsenosid mẫu chuẩn mẫu thử sắc nét, cân đối Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu cao * Khoảng nồng độ tuyến tính: Chuẩn bị dãy chuẩn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd với nồng độ khoảng từ 20 500 µg/ml Tiến hành phân tích HPLC theo điều kiện lựa chọn Bảng 2: Kết xác định mối tương quan nồng độ diện tích pic ginsenosid C (µg/ml) 20 50 100 200 500 Spic (Rg1) (μV.s) 51063 118994 227967 475735 1181541 Spic (Re) (μV.s) 57892 144456 305441 609638 1495955 Spic (Rb1) (μV.s) 38869 89671 175917 382500 918084 Spic (Rd) (μV.s) 41201 91709 196457 386913 961521 y(Rg1) = 2363 x - 126; R² = 0,9999 Phương trình hồi quy tuyến tính y(Re) = 2997x + 1203,1; R² = 0,9999 y(Rb1) = 1842,1x + 479,92; R² = 0,9994 y(Rd) = 1922,3x + 1086,9; R² = 0,9999 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ ginsenosid Có phụ thuộc tuyến tính diện tích pic nồng độ ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ≈ * Giới hạn phát giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường mẫu trắng đường chuẩn để ngoại suy giới hạn phát giới hạn định lượng ginsenosid Từ đó, tiến hành pha thử - nồng độ quanh điểm dự kiến, kết cho thấy: giới hạn phát Rg1 (2 µg/ml), Re (2 µg/ml), Rb1 (3 µg/ml), Rd (3 µg/ml); giới hạn định lượng ginsenosid Rg1 (6 µg/ml), Re (6 µg/ml), Rb1 (8 µg/ml), Rd (8 µg/ml) * Độ xác: Pha mẫu LQC (40 µg/ml), MQC (120 µg/ml) HQC (400 µg/ml), nồng độ pha mẫu độc lập Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Bảng 3: Diện tích pic ginsenosid nồng độ LQC, MQC HQC Rg1 G i n s e n o sDTi d (àVìs) Re RSD (%) 950833 MQC (120 µg/ml) 948694 RSD (%) 1214364 949253 HQC (400 µg/ml) DT (µV×s) Rb1 1225750 RSD (%) 734467 1225814 0,3 DT (àVìs) Rd 732739 768187 0,2 767627 947301 1217309 736812 772956 953879 1213870 733982 770945 285441 356824 223100 232148 282874 355099 226715 229407 284072 282104 279924 0,7 356059 350338 354366 0,7 221572 RSD (%) 770817 734067 0,5 DT (àVìs) 0,9 230729 222634 230637 223487 231432 0,3 0,4 46 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 (1) LQC (40 µg/ml) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 92138 115736 77738 82402 91954 117294 76468 79468 89316 1,8 117446 1,4 78068 1,6 80714 93781 118945 78093 80563 93089 120034 75245 81249 (9) 1,3 Với nồng độ mẫu kiểm soát LQC, MQC, HQC tiến hành phân tích ngày cho kết có độ lặp lại cao với RSD < 2% Như vậy, quy trình phân tích có độ lặp lại cao * Độ đúng: Độ xác định phương pháp thêm chuẩn (0,4 mg; 1,2 mg; mg) Tiến hành xử lý mẫu phân tích HPLC theo điều kiện sắc ký lựa chọn Bảng 4: Tỷ lệ thu hồi ginsenosid viên nang Ukata L ự O n g L Ư ợ n g T û (mg) (%) c h u È n v o 0,4 mg RSD (%) 1,2 mg RSD (%) mg RSD (%) Rg1 Re Rb1 Rd Rg1 Re Rb1 Rd 0,401 0,393 0,387 0,388 100,0 98,3 96,8 97,0 0,388 0,384 0,375 0,377 97,0 96,0 93,8 94,3 0,397 0,38 0,376 0,373 99,3 95,0 94,0 93,3 1,6 1,7 1,8 2,0 1,6 1,8 1,8 2,0 1,191 1,186 1,161 1,161 99,3 98,8 96,8 96,8 1,161 1,155 1,155 1,171 96,8 96,3 96,3 97,6 1,177 1,165 1,161 1,177 98,1 97,1 96,8 98,1 1,3 1,4 0,3 0,7 1,3 1,3 0,3 0,7 3,969 3,932 3,955 3,943 99,2 98,3 98,9 98,6 3,916 3,961 3,978 3,969 97,9 99,0 99,5 99,2 3,929 3,981 3,920 3,982 98,2 99,5 98,0 99,6 0,7 0,6 0,7 0,5 0,7 0,6 0,7 0,5 Tỷ lệ thu hồi ginsensosid Rg1, Re, Rb1 Rd đạt 93% - 100% Điều cho thấy phương pháp chiết lựa chọn cho phép chiết gần hoàn toàn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Định lƣợng ginsenosid viên nang Ukata 5,9 mg/viên; 0,68 mg/viên; 5,2 mg/viên 1,3 mg/viên Ukata lô 0812, NSX 08.08.2012 định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd theo quy trình xây dựng thẩm định Phân tích mẫu: TÀI LIỆU THAM KHẢO Bảng 5: Hàm lượng ginsenosid viên nang cứng Ukata H µ m g i n s e n o Rsg1 i d (mg/viên) X ± SD (n=5) Re Rb1 Rd 5,914 0,681 5,157 1,318 ± 0,084 ± 0,012 ± 0,097 ± 0,022 Hàm lượng hoạt chất viên nang Ukata sau: Rg1 = 5,914 ± 0,084 mg/viên; Re = 0,681 ± 0,012 mg/viên; Rb1 = 5,157 ± 0,097 mg/viên; Rd = 1,318 ± 0,022 mg/viên Kết định lượng sở để đề xuất tiêu chuẩn hàm lượng hoạt chất viên nang Ukata tiêu chuẩn sở Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 2002 Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Đào Văn Đơn, Hồng Văn Lương, Trịnh Văn Lẩu Nghiên cứu định lượng số ginsenosid sinh khối sâm Ngọc Linh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tạp chí Dược học 2008, số 390, tr.41-43 Aik-Jiang Lau , Soo-On Woo , Hwee-Ling Koh Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection Journal of Chromatography A 2003, pp 77-87 Lie Li, Jin-lan Zhang, Yu-xin Sheng, De-an Guo, Qiao Wang, Hong-zhu Guo Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by high - performance liquid chromatography - UV method Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005, 38, pp.45-51 KẾT LUẬN Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang Ukata xây dựng thẩm định Hoạt chất ginsenosid mẫu chiết siêu âm dung môi MeOH Điều kiện HPLC: pha động sử dụng acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, mm), detector UV 203 nm tốc độ dòng 1,5 ml/phút Quy trình thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn FDA Hàm lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd 48 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 49 ... lƣợng ginsenosid viên nang Ukata 5,9 mg /viên; 0,68 mg /viên; 5,2 mg /viên 1,3 mg /viên Ukata lô 0812, NSX 08.08.2012 định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd theo quy trình xây dựng thẩm định Phân tích... Analysis 2005, 38, pp.45-51 KẾT LUẬN Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 Rd viên nang Ukata xây dựng thẩm định Hoạt chất ginsenosid mẫu chiết siêu âm dung môi MeOH Điều kiện... Hàm lượng ginsenosid viên nang cứng Ukata H µ m g i n s e n o Rsg1 i d (mg /viên) X ± SD (n=5) Re Rb1 Rd 5,914 0,681 5,157 1,318 ± 0,084 ± 0,012 ± 0,097 ± 0,022 Hàm lượng hoạt chất viên nang Ukata