Bài viết tiến hành nghiên cứu xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril - đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm và tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương* Đào Văn Đơn*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TĨM TẮT Nghiên cứu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcumin piperin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, mm), detector UV 340 nm tốc độ dòng 0,8 ml/phút Cả chất tách hoàn toàn thời gian 10 phút Giới hạn định lượng curcumin piperin 0,06 0,08 µg/ml Diện tích pic nồng độ chất có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ Phương pháp có độ xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2% Tỷ lệ thu hồi chất từ 93 - 100% Phương pháp sử dụng để định lượng curcumin piperin chế phẩm chứa curcumin piperin * Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements was validated Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes The quantitation limits of curcumin and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml The calibration curve of each analyte had a correlation coefficient close to The precisions were all less than 2% The recovery rates of extraction were 93 - 100% for both curcumin and piperine * Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin hoạt chất Nghệ vàng (Curcuma longa L.) [1] Curcumin có tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế phát triển khối u, tăng khả miễn dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn, chống viêm… Curcumin tan nước (độ tan 0,001%) sinh khả dụng đạt - 3% Các nghiên cứu cho thấy: piperin làm tăng sinh khả dụng curcumin lên * Học viện Quân y ** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 17/07/2014 Ngày báo đăng: 28/07/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 20 lần [2, 3] Hiện nay, thị trường Việt Nam xuất sản phẩm kết hợp curcumin piperin (tỷ lệ khoảng 100:1) chưa có phương pháp định lượng đồng thời chất Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời curcumin piperin phương pháp HPLC NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu * Hóa chất, nguyên liệu: - Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%, Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich) - Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin piperin - Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck) - Dung mơi, hóa chất khác: KH2PO4, H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích * Thiết bị dụng cụ phân tích: - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm) - Cân phân tích Sartorius độ xác ± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH, dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ xác phù hợp Phƣơng pháp nghiên cứu - Khảo sát quy trình định lượng + Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [5, 6], lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau: Cân xác lượng bột tương đương với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng 40 ml MeOH, lắc Chiết siêu âm 20 phút Để nguội, chuyển toàn dịch chiết vào bình định mức 50 ml Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc Lọc lấy dịch lọc Lấy ml dịch lọc đem bốc nhiệt độ phòng tới cắn Hòa tan cắn 10 ml pha động Lọc qua màng lọc 0,45 µl trước phân tích HPLC + Điều kiện sắc ký [5, 6]: Cố định điều kiện: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm); detector PDA; thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng 0,8 ml/phút Khảo sát pha động với hệ dung môi MeOH:nước đệm KH2PO4:ACN - Thẩm định quy trình định lượng Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn Bộ Y tế [4] gồm tiêu: tính tương thích hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ xác, độ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký ghi sắc ký đồ Phân tích kết lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời curcumin piperin sau: cột sắc ký: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector PDA, ghi phổ 340 nm Pha động: hỗn hợp dung môi acetonitril dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh đến pH = 3,5 axít phosphoric) tỷ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích: 10 phút TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Thẩm định quy trình định lƣợng - Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lần mẫu chuẩn hỗn hợp chất curcumin piperin có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện lựa chọn Kết thời gian lưu diện tích pic trình bày bảng Bảng 1: Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký STT tR (phút) Spic(µV.s) tR (phút) Spic(µV.s) 8,155 523508 8,931 1374756 8,156 526881 8.973 1375616 8,149 534524 8,948 1372662 8,154 523406 8,961 1378233 8,144 521094 8,950 1375421 8,143 520245 8,950 1375634 X 8,150 524943 8,950 1375387 RSD (%) 0,07 0,99 0,15 0,13 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic chất < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, ứng dụng để phân tích chất mẫu - Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp curcumin, piperin có nồng độ 10 µg/ml, mẫu trắng mẫu thử (a) PI CUR (b) (c) CUR PI Hình 1: Sắc ký đồ curcumin piperin mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) mẫu thử (c) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Trên sắc ký đồ mẫu trắng, vị trí tương ứng với thời gian lưu curcumin piperin không xuất pic mẫu chuẩn Các pic chất phân tích mẫu thử tách hồn tồn khỏi pic tạp Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt độ đặc hiệu cao - Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Bảng 2: Kết khảo sát mối tương quan nồng độ diện tích pic curcumin piperin (µg/ml) Diện tích pic (μV.s) 610060 3120758 6203550 Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88 Piperin 9380402 12407214 R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) 0,52 1,04 2,08 5,2 10,4 Diện tích pic (μV.s) 29006 52082 96523 219847 452053 Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994 Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ curcumin Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ piperin Kết cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ piperin curcumin khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ - Giới hạn phát giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường mẫu trắng đường chuẩn để ngoại suy giới hạn phát giới hạn định lượng curcumin piperin Tiến hành pha thử - nồng độ quanh điểm dự kiến Kết cho thấy: giới hạn phát curcumin 0,01 µg/ml piperin 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng curcumin 0,04 µg/ml piperin 0,08 µg/ml 10 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 - Độ xác: Cân 20 viên mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại lần) Xử lý mẫu tiến hành sắc ký, kết thể bảng Bảng 3: Kết xác định độ xác phương pháp HPLC (mg) Diện tích pic (V.s) Hàm l-ợng tìm thấy (mg/viờn) Diện tích pic (V.s) Hàm l-ợng tìm thấy (mg/viờn) 125,6 5205871 171,86 23014 1,34 124,8 5058579 168,94 22635 1,31 125,6 5247484 175,25 22887 1,33 124,9 4996609 166,87 22761 1,32 125,1 5064267 169,13 221295 1,27 X 169,89 RSD (%) 1,85 1,31 1,89 Độ lệch chuẩn tương đối < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ xác tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích - Độ đúng: Cân 20 viên mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, nghiền thành bột mịn Cân xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với lần cân khác Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, 10 mg chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên Xử lý mẫu tiến hành sắc ký Bảng 4: Kết xác định độ phương pháp HPLC C h Ê t Curcumin pepirin STT l - ỵ n g 10 mg) L - î n g (mg) T û 9,58 95,8 10,1 9,41 93,2 10,2 10,12 99,2 10 9,67 96,7 9,9 9,42 95,2 10,3 10,12 98,3 0,1 0,097 97 0,1 0,095 95 0,1 0,093 93 0,1 0,094 94 0,1 0,097 97 0,1 0,095 95 (%) X = 96,41 SD = 2,1 RSD = 2,2% X = 95 SD = 1,6 RSD = 1,7% Tỷ lệ thu hồi curcumin piperin từ 93 - 99% nằm giới hạn cho phép (92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ cao 11 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcumin piperin phương pháp HPLC Quy trình xử lý mẫu: chiết cách thuỷ MeOH; dịch chiết để bốc đến cắn hoà tan cắn pha động để phân tích HPLC Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV, pha động ACN:KH2PO4 50 mM (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl Quy trình định lượng thẩm định ứng dụng để định lượng đồng thời curcumin piperin chế phẩm thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 2002 12 Bộ Y tế Hướng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích Phụ lục - Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định đăng ký thuốc 2009 P Anand, A.B Kunnunmakkaram Bioavailability of curcumin: proplems and promises, Molecular Pharmaceutics 2007, (6), pp.807-818 P Anand et al Biological activities of curcumin and its analogues (Congeners) made by man and Mother Nature Biochemical Pharmacology 2008, 76, pp.1.590-1.611 Krishna Veni Nagappan, Meyyanathan S N, Rajinikanth B Raja and Elango Kannan A liquid chromatography method for the simultaneous determination of curcumin and piperine in food products using diode array detection Asian J Research Chem 2009, (2), April.-June Zhong Ming-Yuan, Quan Shan-Cong, Hu Jin-Hong Simultaneous determination of curcumin and piperine in turmeric capsule by HPLC method, Pharmaceutical Care and Research 2006, (1), pp.54-56 ... kết hợp curcumin piperin (tỷ lệ khoảng 100:1) chưa có phương pháp định lượng đồng thời chất Vì vậy, thực nghiên cứu nhằm: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời curcumin piperin phương pháp HPLC... hạn định lượng, độ xác, độ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký ghi sắc ký đồ Phân tích kết lựa chọn điều kiện sắc. .. đệm KH2PO4:ACN - Thẩm định quy trình định lượng Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn Bộ Y tế [4] gồm tiêu: tính tương thích hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến