Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ
PIPERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương* Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương**
TÓM TẮT
Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Pha động sử dụng acetonitril - đệm KH 2 PO 4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm
và tốc độ dòng 0,8 ml/phút Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút Giới hạn định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml Diện tích pic và nồng độ các chất có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1 Phương pháp có độ chính xác cao,
độ lặp lại tốt với RSD < 2% Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100% Phương pháp này được sử dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin
* Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng
SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND
PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC SUMMARY
A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements was validated Using acetonitrile and buffer KH 2 PO 4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes The quantitation limits of curcumin and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml The calibration curve of each analyte had a correlation coefficient close to 1 The precisions were all less than 2% The recovery rates of extraction were
93 - 100% for both curcumin and piperine
* Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification
ĐẶT VẤN ĐỀ
Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ
vàng (Curcuma longa L.) [1] Curcumin có
tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự
phát triển của khối u, tăng khả năng miễn
dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một
số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn, chống viêm… Curcumin rất kém tan trong nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt
2 - 3% Các nghiên cứu cho thấy: piperin làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên
* Học viện Quân y
** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com)
Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014
Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014
Trang 220 lần [2, 3] Hiện nay, trên thị trường Việt
Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp
curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1)
nhưng vẫn chưa có phương pháp định
lượng đồng thời 2 chất trên Vì vậy, chúng
tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng
quy trình định lượng đồng thời curcumin
và piperin bằng phương pháp HPLC
NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên
cứu
* Hóa chất, nguyên liệu:
- Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%,
Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin
chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich)
- Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và
piperin
- Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn
HPLC (Merck)
- Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4,
H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích
* Thiết bị và dụng cụ phân tích:
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,
4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có
buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc
ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)
- Cân phân tích Sartorius độ chính xác
± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH,
các dụng cụ thủy tinh, bình định mức,
pipet có độ chính xác phù hợp
2 Phương pháp nghiên cứu
- Khảo sát quy trình định lượng
+ Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu
[5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý
mẫu như sau:
Cân chính xác lượng bột tương đương với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng
40 ml MeOH, lắc đều Chiết siêu âm trong
20 phút Để nguội, chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 50 ml Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc lấy dịch lọc Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở nhiệt độ phòng tới cắn Hòa tan cắn trong
10 ml pha động Lọc qua màng lọc 0,45 µl trước khi phân tích bằng HPLC
+ Điều kiện sắc ký [5, 6]:
Cố định các điều kiện: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA; thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng 0,8 ml/phút Khảo sát pha động với hệ dung môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN
- Thẩm định quy trình định lượng
Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc
ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng
độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đúng
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Khảo sát quy trình định lượng
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ Phân tích kết quả và lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời curcumin và piperin như sau: cột sắc ký: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector PDA, ghi phổ ở 340 nm Pha động: hỗn hợp dung môi acetonitril và dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích:
10 phút
Trang 32 Thẩm định quy trình định lƣợng
- Tính tương thích hệ thống sắc ký:
Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin
đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn Kết quả về thời gian lưu và diện
tích pic được trình bày trong bảng 1
Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký
STT
t R (phút) S pic (µV.s) t R (phút) S pic (µV.s)
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%,
chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất
trên trong các mẫu
- Độ chọn lọc - đặc hiệu:
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml,
mẫu trắng và mẫu thử
Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và
piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c)
CUR
PI
CUR
PI
(a)
(b)
(c)
Trang 4Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và
piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn Các pic của chất phân tích trong
mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ
đặc hiệu cao
- Khoảng nồng độ tuyến tính:
Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin
có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn
Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin
và piperin
(µg/ml)
Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88 R² = 0,9999
Piperin
Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994
Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin
Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin
Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin
và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin Tiến hành pha thử 4 - 5
nồng độ quanh điểm dự kiến Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là
0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml
và piperin là 0,08 µg/ml
Trang 5- Độ chính xác:
Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại
6 lần) Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3
Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC
(mg) DiÖn tÝch pic
(μV.s)
Hµm l-îng t×m thÊy (mg/viên)
DiÖn tÝch pic (μV.s) Hµm l-îng t×m thÊy
(mg/viên)
Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt,
đáp ứng yêu cầu phân tích
- Độ đúng:
Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân
khác nhau Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg
chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký
Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC
Curcumin
SD = 2,1 RSD = 2,2%
pepirin
SD = 1,6 RSD = 1,7%
Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép
(92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao
Trang 6KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định
được quy trình định lượng đồng thời curcumin
và piperin bằng phương pháp HPLC Quy
trình xử lý mẫu: chiết cách thuỷ bằng MeOH;
dịch chiết để bốc hơi đến cắn và hoà tan
cắn trong pha động để phân tích bằng
HPLC Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha
động ACN:KH2PO4 50 mM (60:40, v/v), tốc
độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50
µl Quy trình định lượng này đã được
thẩm định và có thể ứng dụng để định
lượng đồng thời curcumin và piperin trong
các chế phẩm trên thị trường
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Viện Dược liệu Cây thuốc và động vật
làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học và
Kỹ thuật 2002
2 Bộ Y tế Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích Phụ lục 7 - Thông tư
22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc
2009
3 P Anand, A.B Kunnunmakkaram Bioavailability
of curcumin: proplems and promises, Molecular Pharmaceutics 2007, 4 (6), pp.807-818
4 P Anand et al Biological activities of
curcumin and its analogues (Congeners) made
by man and Mother Nature Biochemical Pharmacology 2008, 76, pp.1.590-1.611
5 Krishna Veni Nagappan, Meyyanathan S
N, Rajinikanth B Raja and Elango Kannan A
liquid chromatography method for the simultaneous determination of curcumin and piperine in food products using diode array detection Asian J Research Chem 2009, 2 (2), April.-June
6 Zhong Ming-Yuan, Quan Shan-Cong, Hu Jin-Hong Simultaneous determination
of curcumin and piperine in turmeric capsule
by HPLC method, Pharmaceutical Care and
Research 2006, 6 (1), pp.54-56