Nghiên cứu định lượng acyclovir trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục tiêu: Thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm định lượng acyclovir trong huyết tương chó. Đối tượng và phương pháp: Loại protein trong huyết tương chó bằng phương pháp tủa protein, sau đó định lượng acyclovir bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

tạp chí y - dợc học quân số 1-2020 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACYCLOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Lê Văn Thanh1; Vũ Thị Thu Giang2; Trần Cát Đông3 Tạ Mạnh Hùng4; Nguyễn Văn Bạch1 TÓM TẮT Mục tiêu: thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao nhằm định lượng acyclovir huyết tương chó Đối tượng phương pháp: loại protein huyết tương chó phương pháp tủa protein, sau định lượng acyclovir phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Khảo sát điều kiện sắc ký, thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết độ ổn định acyclovir theo tiêu chí FDA Kết quả: chiết acyclovir từ huyết tương chó phương pháp tủa protein với dung mơi gây tủa axít percloric 20%; xác định điều kiện sắc ký như: cột, pha động, tốc độ dòng, detector Phương pháp thẩm định đạt tiêu chí theo quy định FDA Kết luận: sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để định lượng acyclovir huyết tương chó đánh giá sinh khả dụng acyclovir chó thực nghiệm * Từ khóa: Acyclovir; Huyết tương chó; Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ĐẶT VẤN ĐỀ Acyclovir (ACV) dẫn chất tổng hợp axít nucleosid - guanosin, có tác dụng mạnh chọn lọc virut gây bệnh người, bao gồm virut Herpes simplex týp 2, virut VaricellaZoster, virut Epstien-barr cytomegalo Tuy nhiên, ACV có thời gian bán thải ngắn, hấp thu qua đường tiêu hóa chậm khơng hồn toàn Với liều nay, lượng thuốc hấp thu thấp (15 - 30%) thời gian lưu trú vùng hấp thu ngắn Kết quả, hầu hết thuốc đào thải qua phân (50 - 60%) dạng không hấp thu [1, 2] Để khắc phục nhược điểm trên, bào chế thành công viên nén ACV kết dính sinh học, chế phẩm đạt tiêu chuẩn sở theo tiêu chí viên nén Dược điển Việt Nam V dạng thuốc kết dính sinh học giải phóng kéo dài Việc xác định sinh khả dụng tương đương sinh học dựa vào thông số dược động học viên nén ACV kết dính sinh học cần thiết [3] Nhằm mục đích đánh giá sinh khả dụng chó thực nghiệm, tiến hành xây dựng thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để định lượng ACV huyết tương chó [4] Học viện Quân y Trường Đại học Dược Hà Nội Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Người phản hồi (Corresponding author): Lê Văn Thanh (levanthanh09091963@gmail.com) Ngày nhận bài: 04/09/2019; Ngày phản biện đánh giá báo: 03/10/2019 Ngày báo c ng: 02/01/2020 TạP CHí Y - dợc HọC QU¢N Sù Sè 1-2020 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.000 ml nước, chỉnh pH 3,0 axít photphoric) Nguyên liệu thiết bị + Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút * Ngun liệu hóa chất: + Detector: PDA 252 nm - ACV chuẩn: hàm lượng 99,9% (do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp) - Viên nén ACV khả dụng sinh học đường tiêu hóa (tự bào chế) đạt tiêu chuẩn sở - Huyết tương chó trắng đạt tiêu chuẩn thử thuốc - Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho HPLC tinh khiết phân tích * Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao SHIMADZU; máy ly tâm lạnh SARTORIUS (Đức), máy lắc xốy VELP (Italia); cân phân tích SARTORIUS (Đức) có độ xác 0,1 mg dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phân tích Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp định lượng: - Xử lý mẫu ACV huyết tương: mẫu huyết tương để rã đơng nhiệt độ phịng Lấy ml huyết tương, thêm 250 µl dung dịch axít percloric 20%, lắc xốy 15 giây, ly tâm 10.000 vịng 15 phút, sau hút lớp dung dịch phía trên, tiêm sắc ký Các mẫu huyết tương trắng có pha ACV chuẩn huyết tương chó sau uống thuốc chiết theo quy trình tiến hành định lượng + Thể tích tiêm: 100 µl + Nhiệt độ autosampler: 4oC * Thẩm định phương pháp định lượng ACV huyết tương chó: - Pha dung dịch ACV chuẩn huyết tương trắng: + Dung dịch chuẩn gốc: nồng độ xác 500 µg/ml ACV nước cất + Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với huyết tương trắng để thu mẫu ACV huyết tương có nồng độ µg/ml + Mẫu chuẩn: pha lỗng dãy dung dịch với huyết tương trắng để thu mẫu chuẩn có nồng độ ACV từ 0,1 - µg/ml Quy trình thẩm định phương pháp định lượng tiến hành theo hướng dẫn FDA [5]: - Tính chọn lọc: chuẩn bị mẫu huyết tương chó khác nồng độ giới hạn định lượng (LLOQ) dự kiến khoảng 0,1 µg/ml Phân tích mẫu phương pháp HPLC + Cột sắc ký: C18; 250 x 4,6 mm; µm Nhiệt độ cột 400C - Đường chuẩn khoảng tuyến tính: chuẩn bị mẫu huyết tương chó chứa ACV với nồng độ xác (0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 5,0 µg/ml), nồng độ mẫu độc lập (có điều chỉnh khối lượng ACV cân) Phân tích mẫu phương pháp HPLC Xây dựng đường chuẩn theo mơ hình hồi quy tuyến tính + Pha động: methanol:dung dịch đệm pH 3,0 (tỷ lệ 8:92) (dung dịch đệm pH 3,0 pha sau: 0,43 g natri octansulfonic - LLOQ: chuẩn bị mẫu huyết tương chó chứa ACV nồng độ xác (0,1 µg/ml) (có điều chỉnh khối lượng ACV cân) - iu kin sc ký: tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 1-2020 Chuẩn bị đường chuẩn điều kiện Phân tích mẫu phương pháp HPLC Xác định độ cách so sánh nồng độ tính từ đường chuẩn với nồng độ thực pha Xác định độ xác cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD - Độ đúng, độ xác (độ lặp lại ngày khác ngày): chuẩn bị lơ mẫu huyết tương chó chứa ACV, lô gồm mẫu độc lập: mẫu kiểm tra nồng độ thấp (LQC) khoảng 0,3 µg/ml Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (MQC) khoảng 2,5 µg/ml Mẫu kiểm tra nồng độ cao (HQC) khoảng 4,0 µg/ml Chuẩn bị đường chuẩn điều kiện Phân tích mẫu phương pháp HPLC Xác định độ phương pháp cách so sánh nồng độ phân tích mẫu kiểm tra so với nồng độ thực pha Xác định độ lặp lại ngày cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giá trị phân tích nồng độ Xác định độ lặp khác ngày cách lặp lại bước ngày Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giá trị phân tích nồng độ ngày đánh giá - Độ ổn định: chuẩn bị lơ mẫu huyết tương chó chứa ACV, lô gồm mẫu độc lập: mẫu kiểm tra LQC khoảng 0,3 µg/ml Mẫu kiểm tra HQC khoảng 4,0 µg/ml Phân tích mẫu phương pháp HPLC, xác định hàm lượng dược chất mẫu ban đầu Sau 24 giờ, phân tích lại mẫu phương pháp HPLC, xác định lại hàm lượng dược chất mẫu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tính tương thích hệ thống Xác định tính tương thích hệ thống HPLC: tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn ACV mẫu huyết tương tự tạo có nồng độ khoảng 2,5 µg/ml Xác định thời gian lưu (TR), diện tích píc ACV sắc ký đồ Bảng 1: Kết đánh giá tính tương thích hệ thống HPLC (n = 6) Mẫu Diện tích píc (mAU.s) Thời gian lưu (giây) Hệ số kéo đuôi 455080 7,575 1,381 451887 7,568 1,383 453141 7,567 1,377 452448 7,566 1,384 450325 7,555 1,384 452407 7,557 1,388 Trung bình 452548 7,565 1,383 CV (%) 0,3 0,1 0,3 Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt Hệ số biến thiên CV (%) thời gian lưu, diện tích píc hệ số kéo đuôi ACV < 2,0%, chứng tỏ hệ thống có tính phù hợp cao Phù hợp với việc phân tích dược chất dịch sinh hc TạP CHí Y - dợc HọC QUÂN Sự Sè 1-2020 Kết thẩm định tính chọn lọc Phân tích mẫu huyết tương trắng mẫu huyết tương tự tạo chứa ACV chuẩn có nồng độ 0,1 µg/ml (ở nồng độ LLOQ) Bảng 2: Đáp ứng píc mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu (tR ) ACV Mẫu Diện tích píc mẫu trắng (mAU.s) Diện tích píc mẫu chuẩn ACV nồng độ LLOQ (mAU.s) 2377 19615 2782 20542 2545 20007 1982 19669 2289 20808 2405 18366 Trung bình 2397 19835 Tỷ lệ đáp ứng píc (%) (a) 12,1 (b) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (a) sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn ACV nồng độ 0,1 µg/ml (b) Kết cho thấy, tỷ lệ diện tích píc mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu ACV 12,1% so với diện tích píc mẫu LLOQ nằm giới hạn cho phép (≤ 20%) Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng, khơng có píc xuất vị trí xuất píc ACV pha huyết tương trắng Vì vậy, phương pháp phân tích ACV đáp ứng yêu cầu độ chọn lọc theo hướng dẫn ca FDA tạp chí y - dợc học quân sù sè 1-2020 Kết thẩm định độ tuyến tính giới hạn định lượng Bảng 3: Tương quan nồng độ ACV huyết tương chó diện tích píc Tên mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Nồng độ thực (µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 Diện tích píc (mAU.s) 26639 45027 102556 200375 384079 587020 977053 Phương trình hồi quy (Y = aX+b) Y = 193848x + 5048,8 * R = 0,9999 Nồng độ xác định từ đường chuẩn (ng/ml) 0,110 0,210 0,503 1,008 1,9553 3,002 5,014 Nồng độ xác định từ đường chuẩn so với giá trị thực (%) 111,4 103,1 100,6 100,8 97,8 100,1 100,3 D iệ n tíc h p íc (m A U s ) 1200000 1000000 y = 193848x + 5048.8 R = 0.9999 800000 600000 400000 200000 0 Nồng độ (mcg/ml) Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ ACV huyết tương chó diện tích píc Tính lại nồng độ hoạt chất có mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy xây dựng Kết cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát, 100% số điểm đạt độ so với giá trị thực nằm giới hạn cho phép (85 - 115%), giá trị R2 = 0,9999 Như vậy, khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính nồng độ ACV huyết tương chó diện tích píc thu Khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng ACV huyết tương chó LLOQ: tiến hành khảo sát mẫu chuẩn ACV nồng khong 0,1 àg/ml TạP CHí Y - dợc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020 Bảng 4: Kết xác định LLOQ Mẫu Diện tích píc mẫu huyết tương trắng (mAU.s) Diện tích píc mẫu huyết tương có ACV (≈ 0,1 µg/ml) (mAU.s) Nồng độ tìm (a) thấy (µg/ml) 2377 19615 0,091 93,8 Đạt 2782 20542 0,096 99,0 Đạt 2545 20007 0,093 96,0 Đạt 1982 19669 0,091 94,1 Đạt 2289 20808 0,098 100,5 Đạt 2405 18366 0,084 86,7 Đạt Trung bình 2397 19835 0,092 95,0 5,1 5,1 RSD (%) Đáp ứng trung bình mẫu LLOQ/mẫu trắng (%) Độ (%) (b) Đạt/không đạt 8,3 (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) Độ tìm thấy nồng độ LLOQ cao 90% có chênh lệch không nhiều mẫu (RSD 5,1%), chứng tỏ LLOQ xác định phù hợp Độ đúng, độ lặp lại ngày khác ngày Chuẩn bị mẫu kiểm tra nồng độ huyết tương có nồng độ 0,3 µg/ml; 2,5 µg/ml 4,0 µg/ml, nồng độ chuẩn bị mẫu Bảng 5: Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml) Mẫu Nồng độ (µg/ml) Độ (%) Nồng độ (µg/ml) Độ (%) Nồng độ (µg/ml) Độ (%) 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3 Trung bình 0,283 97,4 2,463 101,5 3,958 102,0 3,0 3,0 3,5 3,5 2,0 2,0 RSD (%) a b a b (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) a b t¹p chÝ y - dợc học quân số 1-2020 Bng 6: Kt khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày LQC (≈ 0,3 µg/ml) Ngày a MQC (≈ 2,5 µg/ml) b a HQC (≈ 4,0 µg/ml) b a b Nồng độ (µg/ml) Độ (%) Nồng độ (µg/ml) Độ (%) Nồng độ (µg/ml) Độ (%) 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3 0,298 102,3 2,209 91,1 3,733 96,2 0,292 100,2 2,453 101,2 3,969 102,3 0,288 99,0 2,471 101,9 3,966 102,2 0,295 101,4 2,466 101,7 4,003 103,2 0,283 97,3 2,440 100,6 3,966 102,2 0,287 98,5 2,459 101,4 3,970 102,3 0,287 96,5 2,498 100,6 4,129 104,0 0,291 97,8 2,578 103,9 4,276 107,7 0,280 93,8 2,617 105,4 4,250 107,0 0,289 97,0 2,620 105,6 4,260 107,3 0,283 95,1 2,633 106,1 4,277 107,7 0,288 96,8 2,644 106,5 4,291 108,0 Trung bình 0,287 97,8 2,492 101,9 4,047 103,4 RSD (%) 2,3 2,6 4,5 3,8 4,1 3,1 I II III (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực) Ở nồng độ, phương pháp cho độ ngày khác ngày cao (trong khoảng 85 - 115%) độ lặp lại ngày khác ngày với giá trị RSD < 15%, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích chất dịch sinh hc TạP CHí Y - dợc HọC QUÂN Sự Sè 1-2020 Tỷ lệ thu hồi phương pháp Tiến hành sắc ký lô mẫu kiểm tra nồng độ bao gồm LQC 0,3 µg/ml, MQC 2,5 µg/ml HQC 4,0 µg/ml, lơ gồm mẫu độc lập Đồng thời tiến hành sắc ký mẫu chuẩn pha dung mơi pha mẫu có nồng độ tương ứng Bảng 7: Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi ACV LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml) Diện tích píc ACV huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV dung mơi (mAU.s) Diện tích píc ACV huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV dung mơi (mAU.s) Diện tích píc ACV huyết tương (mAU.s) Diện tích píc ACV dung môi (mAU.s) 61551 56215 447720 469120 738476 740886 60113 55721 477169 464937 767251 740639 60913 55531 486505 465630 773939 739433 57716 58111 489222 465148 773549 739792 57635 57280 489611 463732 780200 740734 58890 59172 489519 463607 778021 740505 59470 57005 479958 465362 768573 740332 2,8 2,5 3,4 0,4 2,0 0,1 Mẫu Trung bình RSD (%) Tỷ lệ thu hồi (%) 104,3 103,1 103,8 Quy trình chiết đạt tỷ lệ thu hồi cao ổn định Giá trị RSD% đáp ứng píc ACV mẫu ≤ 3,4% Tỷ lệ thu hồi khác nồng độ không ± 1,2% Do vậy, khẳng định phương pháp chiết tách, xử lý mẫu thích hợp, áp dụng thực nghiệm Độ ổn định mẫu huyết tương - Độ ổn định mẫu sau ba chu kỳ đơng - rã đơng: phân tích mẫu LQC HQC theo phương pháp xây dựng So sánh nồng độ ACV mẫu LQC HQC sau pha (nồng độ ban đầu) với bảo quản sau chu kỳ đông - rã đông Bảng 8: Độ ổn định ACV mẫu huyết tương chó sau chu kỳ đông - rã đông Nồng độ (µg/ml) Mẫu 10 Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml) Ban đầu Sau chu kỳ đơng rã đông Ban đầu Sau chu kỳ đông rã đông 0,335 0,310 4,140 4,189 0,330 0,311 4,181 4,156 0,319 0,312 4,274 4,223 t¹p chÝ y - dợc học quân số 1-2020 0,329 0,320 4,315 4,258 0,334 0,315 4,324 4,295 0,331 0,320 4,276 4,339 0,330 0,315 4,251 4,243 1,7 1,4 1,8 1,6 Trung bình RSD (%) Độ lệch (%) -4,5 -0,2 Sau chu kỳ đông - rã đông, nồng độ ACV ổn định, độ lệch nồng độ thời điểm ban đầu nồng độ sau chu kỳ đông - rã đông ≤ 4,5% (< 15%) kết định lượng nồng độ có RSD ≤ 1,8% (< 15%), đạt yêu cầu theo quy định để phân tích lại mẫu cần thiết - Độ ổn định dài ngày: bảo quản mẫu huyết tương nồng độ LQC HQC, nhiệt độ -350C ± 50C Phân tích mẫu thời điểm ban đầu sau khoảng thời gian bảo quản định (7 ngày, 22 ngày 44 ngày) Bảng 9: Kết độ ổn định dài ngày ACV huyết tương chó Nồng độ (µg/ml) Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml) Ban đầu Sau ngày Sau 22 ngày Sau 44 ngày Ban đầu Sau ngày Sau 22 ngày Sau 44 ngày 0,335 0,318 0,306 0,299 4,140 4,004 3,997 3,999 0,330 0,319 0,304 0,287 4,181 4,091 4,227 4,031 0,319 0,348 0,305 0,277 4,274 4,052 4,270 4,127 0,329 0,319 0,300 0,285 4,315 4,160 4,351 4,027 0,334 0,345 0,305 0,277 4,324 4,181 4,368 4,095 0,331 0,338 0,299 0,283 4,276 4,193 4,288 3,955 Trung bình 0,330 0,331 0,303 0,285 4,251 4,114 4,250 4,039 1,7 4,3 1,0 2,9 1,8 1,9 3,2 1,6 -0,3 -8,1 -13,7 2,4 0,0 -5,0 RSD (%) Độ lệch (%) Độ lệch nồng độ mẫu 44 ngày với nồng độ thời điểm ban đầu ≤ 13,7% (< 15%) kết định lượng nồng độ có RSD ≤ 4,3% (< 15%), đạt độ lệch chuẩn theo quy định, chứng tỏ mẫu ổn định sau 44 ngày bảo quản, đảm bảo phân tích hết mu 11 TạP CHí Y - dợc HọC QUÂN Sự Sè 1-2020 KẾT LUẬN Đã thẩm định độ chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết độ ổn định ACV huyết tương chó Quy trình đáp ứng u cầu phương pháp phân tích dịch sinh học theo quy định FDA Phương pháp áp dụng để định lượng ACV huyết tương chó nghiên cứu sinh khả dụng xác định thông số dược động học viên nén ACV 200 mg kết dính sinh học chó thực nghiệm 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược thư Quốc gia Việt Nam Nhà xuất Y học 2009, tr.36-40 Sweetman S.C et al Martindale Pharmaceutical Press 2009, pp.862-864, 911 Gaoo J Bioanalytical method validation for studies on pharmacokinetics, bioavailability and bioequivalence: Highlights of the FDA’s guidance Asian J Drug Metab Pharmacokinet 2004, (1), pp.5-13 Center for Drug Evaluation and Research Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, FDA, U.S Department of Health and Human Services 2001 Food and Drug Administration USA Guidance for Industry: Q1A (R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products 2003  ... khác đạt tiêu chuẩn phân tích Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp định lượng: - Xử lý mẫu ACV huyết tương: mẫu huyết tương để rã đông nhiệt độ phịng Lấy ml huyết tương, thêm 250 µl dung dịch... thẩm định độ chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết độ ổn định ACV huyết tương chó Quy trình đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học theo quy định FDA Phương. .. tích mẫu phương pháp HPLC, xác định hàm lượng dược chất mẫu ban đầu Sau 24 giờ, phân tích lại mẫu phương pháp HPLC, xác định lại hàm lượng dược chất mẫu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tính tương