Nghiên cứu định lượng diltiazem trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC-MS/MS

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - khối phổ (HPLCMS/MS) để định lượng diltiazem (DIL) trong huyết tương chó. Phương pháp: chiết DIL từ huyết tương chó bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng.

Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG DILTIAZEM TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS Nguyễn Văn Bạch*; Tạ Mạnh Hùng** TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - khối phổ (HPLCMS/MS) để định lượng diltiazem (DIL) huyết tương chó Phương pháp: chiết DIL từ huyết tương chó phương pháp chiết lỏng-lỏng Khảo sát điều kiện sắc ký; lựa chọn nội chuẩn; thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết, nội chuẩn độ ổn định DIL theo tiêu chí FDA Kết quả: chiết DIL từ huyết tương chó phương pháp chiết lỏng-lỏng với hệ dung môi diethyleter-cloroform, nội chuẩn felodipin (FELO); xác định điều kiện sắc ký như: cột, pha động, tốc độ dòng, detector Phương pháp thẩm định đạt tiêu chí theo quy định FDA Kết luận: sử dụng phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL huyết tương chó đánh giá sinh khả dụng DIL chó thực nghiệm * Từ khóa: Diltiazem; Huyết tương chó; HPLC-MS/MS Quantitative Determination of Diltiazem in Dogs Plasma by HPLCMS/MS Summary Objectives: To determine diltiazem (DIL) in dog plasma by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS/MS) Methods: A liquid-liquid extraction technique was used to extract DIL in dog plasma Chromatographic conditions were studied; selection of internal standard; essessment of the specificity, selectivity, the linear range, lower limit of quantification, extraction efficiency, internal standard and stability of DIL following the guidance of FDA Results: DIL in dog plasma was performed by liquid-liquid extraction with solvent mixtures diethyl ether-chloroform, felodipin as internal standard; chromatographic conditions were established, including: column, mobile phase, a flow-rate, detector The method has been evaluated and achieved the FDA’s regulations Conclusion: The HPLC-MS/MS method can be used to determine the DIL in dog plasma, which would evaluate bioavailability of the DIL in experimental dogs * Key words: Diltiazem; Dog plasma; HPLC-MS/MS ĐẶT VẤN ĐỀ Diltiazem dược chất có tác dụng chẹn kênh canxi, làm giãn động mạch vành, mạch ngoại vi, làm giảm co bóp tim, làm chậm nhịp tim, sử dụng dự phòng điều trị đau thắt ngực [6] * Học viện Quân y ** Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Bạch (bachhvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 04/04/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 01/09/2016 Ngày bỏo c ng: 20/09/2016 29 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 8-2016 Một số chức hệ tim mạch có nhịp sinh học, nên bệnh tim mạch có nhịp sinh học Chúng tơi bào chế thành công viên nén DIL 60 mg giải phóng theo nhịp để đáp ứng yêu cầu “nhịp sinh học” loại bệnh Chế phẩm đạt tiêu chuẩn sở theo tiêu chí viên nén Dược điển Việt Nam IV dạng thuốc giải phóng theo nhịp Việc xác định sinh khả dụng tương đương sinh học dựa vào thông số dược động học viên nén DIL 60 mg giải phóng theo nhịp mà chúng tơi bào chế cần thiết [4] Nhằm mục đích đánh giá sinh khả dụng chó thực nghiệm, chúng tơi tiến hành: Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL huyết tương chó [2] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị * Nguyên liệu hóa chất: - Diltiazem hydroclorid chuẩn: hàm lượng 99,9% (do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cấp) - Felodipin chuẩn (nội chuẩn): hàm lượng 99,8% (do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cấp) - Viên nén DIL 60 mg giải phóng theo nhịp (tự bào chế) đạt tiêu chuẩn sở - Huyết tương chó trắng: Ban Cung cấp Động vât thí nghiệm, Học viện Quân y cấp đạt tiêu chuẩn thử thuốc - Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho HPLC tinh khiết phân tích * Thiết bị: Máy HPLC-MS/MS TSQ Quantum Ultra (Thermo Scientific); máy lắc GPL 3006 (Đức); cân phân tích Meller Toledo 30 có độ xác 0,1 mg dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phân tích Phương pháp nghiên cứu * Xây dựng phương pháp: - Xử lý mẫu huyết tương chó phương pháp chiết lỏng-lỏng Cụ thể: lấy ml huyết tương chó chứa ng DIL 250 ng FELO chuẩn cho vào ống nghiệm chiết Thêm 1,0 ml dung dịch amoniac 0,1 M ml hỗn hợp dung môi diethylethercloroform (7:3) Lắc khoảng 10 phút, ly tâm, lấy lớp dung mơi Bốc dung mơi dòng khí nitơ, thu lấy cắn Hòa tan cắn ml pha động Sau lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào cột sắc ký 10 µl - Điều kiện sắc ký: dựa vào tài liệu [1, 5], khảo sát điều kiện sắc ký phương pháp HPLC-MS/MS gồm: cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu kiểu phổ khối * Thẩm định phương pháp định lượng DIL huyết tương: Theo hướng dẫn FDA gồm phương pháp: thẩm định mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu kiểm chứng Đánh giá tiêu chí: độ đặc hiệu, độ chọn lọc, đường chuẩn khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ lặp lại ngày khác ngày, hiệu suất chiết độ ổn định mẫu huyết tương [3] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng DIL huyết tương chó * Xây dựng phương pháp: - Xử lý mẫu: so với phương pháp tủa protein, phương pháp chiết lỏng-lỏng có T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 kiu ph khi: MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+) nhiều ưu điểm như: tiến hành đơn giản, dễ triển khai giảm sai số tiến hành phân tích Vì vậy, chúng tơi chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng * Thẩm định phương pháp: - Độ đặc hiệu chọn lọc: - Điều kiện sắc ký: định lượng DIL theo phương pháp HPLC-MS/MS với điều kiện sau: Xác định độ thích hợp hệ thống HPLC-MS/MS: tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn DIL có nồng độ khoảng 400 ng/ml chứa FELO với nồng độ khoảng 250 ng/ml (mẫu spike) Xác định thời gian lưu (TR), diện tích píc DIL FELO sắc đồ Cột: C18 (50 x mm; 2,1 µm); nhiệt độ cột: 40°C; pha động: methanol-amoni acetat mM (90:10, v/v); tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 10 µl; Bảng 1: Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống HPLC-MS/MS (n = 6) DIL FELO STT TR (phút) Diện tích (mAU.S) TR (phút) Diện tích (mAU.S) 1,47 55693143 1,63 23936463 1,47 53010711 1,62 23615459 1,45 54899222 1,64 24236487 1,46 52599837 1,62 22777336 1,48 54263361 163 23849527 1,45 56275337 1,62 24586267 X 1,46 54456935 1,63 23833590 RSD (%) 0,83 2,7 0,50 2,6 Hệ thống HPLC-MS/MS hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt Giá trị RSD (%) thời gian lưu diện tích píc DIL FELO nhỏ 1,0% 5,0% (giá trị RSD cao TR 0,83% diện tích píc 2,7%) - Độ đặc hiệu chọn lọc phương pháp: phân tích mẫu huyết tương trắng mẫu huyết tương tự tạo chứa FELO với nồng độ 250 ng/ml DIL chuẩn với nồng độ ng/ml (bằng khoảng 1/30 đến 1/20 Cmax uống liều đơn 60 mg DIL) 31 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 Hỡnh 1: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương tự tạo chứa DIL (nồng độ ng/ml) FELO (nồng độ 250 ng/ml) Kết cho thấy thời điểm 1,49 1,63 phút, khơng xuất píc có mảnh phổ khối m/z = 414,5 177,8 (DIL) m/z = 383,4 338,1 (FELO) Diện tích píc mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu DIL FELO Các píc DIL FELO mẫu LLOQ có tỷ lệ S/N > 500 Vì vậy, phương pháp phân tích 32 DIL đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu chọn lọc theo hướng dẫn FDA - Đường chuẩn khoảng tuyến tính: Pha mẫu DIL chuẩn huyết tương chó trắng có nồng độ khoảng 478 ng/ml Xác định mối tương quan nồng độ DIL với tỷ lệ diện tích píc DIL/ FELO sắc ký Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 Bảng 2: Sự phụ thuộc tỷ lệ diện tích píc DIL/FELO nồng độ DIL chuẩn huyết tương chó Nồng độ (ng/ml) 4,8 9,6 23,9 Diện tích píc DIL (mAU.S) 1753805 3596455 9583909 Diện tích píc FELO (mAU.S) 28882780 29652473 31765544 27376294 27197079 29306286 Tỷ lệ diện tích píc DIL/FELO 0,061 0,121 0,302 0,563 1,137 8,2 6,8 6,5 5,4 5,6 RSD (%) 47,9 95,7 191,5 383,0 478,7 15399556 30915949 58709102 106649051 128309847 27769163 28178456 2,003 3,841 4,553 4,7 3,5 2,8 95,7 92,0 95,9 Y = 0,0096 X + 0,097 Phương trình hồi quy R = 0,9975 Độ (%) 94,4 105,4 111,5 105,8 108,1 y = 0.0096x + 0.097 R = 0.9975 TỷlệdiệntichpicDIL/FELO 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ DIL (ng/ml) Hình 3: Đồ thị đường chuẩn DIL huyết tương chó Trong khoảng nồng độ 4,8 - 478,7 ng/ml, có tương quan tuyến tính nồng độ DIL với tỷ lệ diện tích píc DIL/FELO với hệ số tương quan xấp xỉ (R2 = 0,9975) Độ đạt tỷ lệ cao (từ 94,4 - 111,5%), độ lặp lại tốt (2,8 - 8,2%) nằm giới hạn cho phép theo quy định FDA (±20% nồng độ thấp ±15% nồng độ lại) - Giới hạn định lượng (LLOQ): Phân tích mẫu huyết tương trắng mẫu huyết tương chứa DIL nồng độ 4,8 ng/ml (nồng độ thấp khoảng tuyến tính) Xác định đáp ứng đỉnh mẫu chuẩn tính nồng độ DIL mẫu chuẩn 33 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 Bng 3: Kết xác định giá trị LLOQ phương pháp (n = 6) Mẫu trắng Mẫu chuẩn LLOQ (4,8 ng/ml) STT Diện tích píc vị trí trùng thời gian lưu với DIL (mAU.S) Diện tích píc DIL (mAU.S) Diện tích píc FELO (mAU.S) Nồng độ tính từ phương trình hồi quy (ng/ ml) Độ so với lý thuyết (%) 1389355 22658790 4,1 95,5 1405503 23555350 3,9 92,3 1511875 22526934 4,6 106,7 1370366 22819364 4,0 93,1 1438183 22319586 4,4 101,5 1777471 30354462 3,8 90,2 X 1482126 24039081 4,1 96,6 7,2 7,2 RSD (%) Tại vị trí có thời gian lưu (1,6 phút), đáp ứng mẫu chuẩn có nồng độ 4,8 ng/ml lớn lần đáp ứng mẫu trắng Độ lặp lại với giá trị RSD < 10,0% độ từ 90,2 - 106,7% (nằm giới hạn 80 - 120%) Như vậy, mẫu chứa DIL có nồng độ 4,8 ng/ml đáp ứng yêu cầu LLOQ phương pháp phân tích dịch sinh học - Độ - độ lặp lại ngày khác ngày: Pha mẫu LQC (13,8 ng/ml), MQC (230,7 ng/ml) HQC (323,0 ng/ml) Xác định nồng độ DIL phương pháp đường chuẩn tỷ lệ (%) nồng độ xác định từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết Kết xác định độ đúng, lặp lại ngày khác ngày (3 ngày phân tích khác nhau) phương pháp sau Bảng 4: Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày (n = 6) LQC (13,8 ng/ml) MQC (230,7 ng/ml) Tỷ lệ diện tích DIL/FELO Nồng độ xác định (ng/ml) Độ (%) Tỷ lệ diện tích DIL/FELO Nồng độ xác định a (ng/ml) 0,161 13,8 100,0 2,327 0,156 13,3 96,1 0,148 12,5 0,160 STT 34 HQC (323,0 ng/ml) (%) Tỷ lệ diện tích DIL/FELO Nồng độ xác định a (ng/ml) Độ (%) 212,9 92,3 3,236 296,6 91,8 2,245 205,4 89,0 3,280 300,6 93,1 90,5 2,265 207,3 89,8 3,125 286,3 88,6 13,7 98,8 2,309 211,3 91,6 3,205 293,7 90,9 0,152 13,0 93,6 2,275 208,2 90,2 3,206 293,8 91,0 0,180 15,5 112,0 2,289 209,4 90,8 3,354 307,4 95,2 Độ X 98,4 90,6 91,8 RSD (%) 7,6 1,3 2,4 Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 Bảng 5: Kết thẩm định độ độ lặp lại khác ngày (n = 6) LQC (13,8 ng/ml) Ngày I II III MQC (230,7 ng/ml) HQC (323,0 ng/ml) Nồng độ xác định (ng/ml) Độ (%) Nồng độ xác định (ng/ml) Độ (%) Nồng độ xác định (ng/ml) Độ (%) 13,8 99,5 212,9 92,3 296,6 91,8 13,3 96,1 205,4 89,0 300,6 93,1 12,5 90,5 207,3 89,8 286,3 88,6 13,7 98,8 211,3 91,6 293,7 90,9 13,0 93,6 208,2 90,2 293,8 91,0 15,5 112,0 209,4 90,8 307,4 95.2 14,6 101,5 262,0 109,0 286,9 85,3 15,1 104,9 261,4 108,8 349,6 103,9 16,1 111,3 257,8 107,3 360,2 107,1 16,1 111,6 254,8 106,1 343,8 102,2 15,6 108,1 257,9 107,3 369,4 109,8 15,8 109,8 268,9 111,9 347,6 103,3 15,1 104,7 240,6 100,1 340,1 101,1 15,8 109,5 237,8 98,9 301,5 89,6 15,5 107,4 235,4 98,0 319,3 94,9 15,2 105,2 235,2 97,9 316,3 94,0 14,5 100,3 240,1 99,9 310,1 92,2 13,4 92,8 229,6 95,6 312,9 93,0 X 103,2 99,1 96,0 RSD (%) 6,7 7,7 7,2 Ở nồng độ, phương pháp cho độ ngày khác ngày cao (90,6 - 103,2%) độ lặp lại ngày khác ngày với giá trị RSD < 10% (1,3 - 7,6% độ lặp lại ngày từ 6,7 - 7,7% độ lặp lại khác ngày) Điều chứng tỏ: phương pháp phân tích có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích chất dịch sinh học - Hiệu suất chiết phương pháp: + Hiệu suất chiết FELO (nội chuẩn): phân tích mẫu huyết tương trắng chó chứa FELO (nồng độ 250 ng/ml) theo quy trình lựa chọn Xác định diện tích píc FELO Song song với mẫu trên, xác định diện tích píc dung dịch chuẩn FELO có nồng độ pha huyết tương chó xử lý 35 Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 Bảng 6: Hiệu suất chiết nội chuẩn FELO (n = 6) STT Diện tích píc FELO (mAU.S) Hiệu suất chiết (%) Mẫu huyết tương (có chiết) Mẫu spike (khơng chiết) 22764320 33476941 68,00 23557488 34162547 68,95 24427925 33172556 73,64 22628958 32278905 70,10 22428570 34564121 64,89 24333856 34264278 71,02 X 23356852,83 33653224,7 69,40 RSD 3,8 2,5 4,2 Hiệu suất chiết FELO xấp xỉ 70% (69,4%), độ lặp lại phương pháp chiết tốt (RSD < 5%) Như vậy, quy trình xử lý mẫu huyết tương chó nghiên cứu thích hợp để chiết tách FELO Hiệu suất chiết DIL: phân tích mẫu LQC, MQC, HQC DIL có nồng độ 13,8; 230,7 323,0 ng/ml huyết tương chó Song song với mẫu trên, phân tích dung dịch chuẩn DIL huyết tương chó xử lý có nồng độ DIL tương ứng Bảng 7: Hiệu suất chiết DIL (n = 6) Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Mẫu MQC (230,7 ng/ml) Mẫu HQC (320,0 ng/ml) STT Mẫu có chiết Mẫu spike Hiệu suất (%) Mẫu có chiết Mẫu spike Hiệu suất (%) Mẫu có chiết Mẫu spike Hiệu suất (%) 10,5 13,6 77,0 168,9 228,3 74,0 253,4 320,8 79,0 10,5 13,5 78,1 160,8 225,9 71,2 249,1 319,4 78,0 9,5 12,9 74,0 167,0 222,6 75,0 252,6 319,8 79,0 10,6 14,1 75,1 164,5 218,7 75,2 249,8 320,3 78,0 10,7 13,3 80,0 162,5 224,8 72,3 256,4 320,5 80,0 9,8 13,0 76,0 175,2 225,2 77,8 247,8 319,7 77,5 X 76,7 74,1 78,6 SD 2,16 2,30 0,92 RSD (%) 2,8 3,1 1,1 Ở nồng độ, phương pháp cho hiệu suất chiết cao (74,1 - 78,6%) với độ lặp lại tốt (các giá trị RSD < 5%) Do đó, phương pháp xử lý mẫu xây dựng phù hợp để chiết tách DIL từ huyt tng 36 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2016 - Độ ổn định mẫu huyết tương: + Độ ổn định mẫu sau chu kỳ đơng rã đơng: phân tích mẫu LQC HQC theo phương pháp xây dựng Xác định nồng độ DIL có mẫu Kết so sánh nồng độ DIL mẫu LQC HQC sau pha (nồng độ ban đầu) với bảo quản sau chu kỳ đông - rã đông sau: Bảng 8: Độ ổn định DIL mẫu huyết tương chó sau chu kỳ đơng - rã đông (n = 5) Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Mẫu HQC (323,0 ng/ml) Nồng độ ban đầu (ng/ml) Nồng độ sau đông-rã (ng/ml) Nồng độ ban đầu (ng/ml) Nồng độ sau đông- rã (ng/ml) (1) (2) (1) (2) 13,8 13,3 320,2 318,6 13,5 13,6 321,3 315,8 14,1 13,4 328,8 320,7 14,3 12,7 317,7 312,6 13,6 14,0 312,9 310,5 X 13,86 13,4 320,2 315,6 RSD (%) 2,4 3,5 1,8 1,3 STT p1,2 0,114 (> 0,05) 0,194 (> 0,05) Nồng độ ban đầu sau chu kỳ đông - rã DIL hai lô mẫu khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, DIL mẫu huyết tương ổn định qua chu kỳ đông - rã đông Độ ổn định dài ngày: so sánh nồng độ DIL mẫu LQC, HQC thời điểm sau pha sau 10, 20 30 ngày bảo quản mẫu nhiệt độ -350C Bảng Kết độ ổn định dài ngày DIL huyết tương chó (n = 5) Kết định lượng DIL Giai đoạn STT Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Nồng độ (ng/ml) Mẫu ban đầu 13,8 13,5 14,1 14,3 13,6 Thông số thống kê Mẫu HQC (323,0 ng/ml) Nồng độ (ng/ml) Thông số thống kê 320,2 321,3 = 13,86 RSD = 2,4% X 328,8 317,7 = 320,2 RSD = 1,8% X 312,9 37 Tạp chí y - dợc học quân sè 8-2016 Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày 13,9 311,5 14,2 13,7 12,8 13,6 304,1 14,2 312,8 15,1 14,7 13,2 13,9 316,3 13,4 310,8 14,1 12,4 13,5 12,9 X = 13,64 RSD = 3,8% p = 0,451 (> 0,05) = 14,32 RSD = 4% p = 0,162 (> 0,05) X = 13,26 RSD = 4,8% p = 0,101 (> 0,05) X 317,8 305,7 318,2 324,5 309,7 311,9 320,7 302,4 315,9 X = 311,46 RSD = 2,1% p = 0,056 (> 0,05) = 315,03 RSD = 1,8% p = 0,199 (> 0,05) X = 311,3 RSD = 2,3% p = 0,065 (> 0,05) X 306,7 Nồng độ DIL mẫu bảo quản nhiệt độ -350C vòng 10, 20 30 ngày so với nồng độ DIL mẫu định lượng pha khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Điều chứng tỏ: DIL ổn định huyết tương 30 ngày bảo quản nhiệt độ -350C KẾT LUẬN - Đã xây dựng phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL huyết tương chó Chiết DIL từ huyết tương chó phương pháp chiết lỏnglỏng với hỗn hợp dung môi dietyletercloroform (tỷ lệ 7:3) Các điều kiện sắc ký gồm: xột C18 (50 x mm; 2,1 µm), nhiệt độ cột 40oC; pha động methanol-amoni acetat mM (tỷ lệ 90:10); tốc độ dòng 0,3 ml/phút, detector khối phổ chuẩn nội FELO - Đã thẩm định độ đặc hiệu chọn lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết độ ổn định DIL 38 huyết tương chó Quy trình đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học theo quy định FDA Phương pháp áp dụng để định lượng DIL huyết tương chó nghiên cứu sinh khả dụng xác định thông số dược động học viên nén DIL 60 mg giải phóng theo nhịp chó thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Bialer M et al Pharmacokinetic analysis of two new sustained-release products of diltiazem designed for twice- and once-daily treatment Biopharm Drug Dispos 1994, 15, pp.45-52 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 8-2016 Center for Drug Evaluation and Research Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, FDA, U.S Department of Health and Human Services 2001 Food and Drug Administration USA Guidance for Industry: Q1A(R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products 2003 Gaoo J Bioanalytical method validation for studies on pharmacokinetics, bioavailability and bioequivalence: Highlights of the fda’s guidance Asian J Drug Metab Pharmacokinet 2004, (1), pp.5-13 Shivram K, Shah AC, Newalkar BL, Kamath BV Stability indicating high-performance liquid chromatographic method for the assay of diltiazem hydrochloride in tablets J Liq Chromatogr 1992, 15, pp.2417-2422 Sista S, Lai JC, Eradiri O, Albert KS Pharmacokinetics of a novel diltiazem HCl extended-release tablet formulation for evening administration J Clin Pharmacol 2003, 43 (10), pp.1149-1157 39 ... ổn định mẫu huyết tương [3] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng DIL huyết tương chó * Xây dựng phương pháp: - Xử lý mẫu: so với phương pháp tủa protein, phương. .. thẩm định phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL huyết tương chó [2] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị * Nguyên liệu hóa chất: - Diltiazem hydroclorid chuẩn: hàm lượng. .. ký phương pháp HPLC-MS/MS gồm: cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu kiểu phổ khối * Thẩm định phương pháp định lượng DIL huyết tương: Theo hướng dẫn FDA gồm phương pháp: