Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE – c4d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C4D) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ TRANG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHƠNG TIẾP XÚC (CE-C4D) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Nguyễn Thị Ánh Hường Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo PGS.TS Tạ Thị Thảo cô giáo TS Nguyễn Thị Ánh Hƣờng giao đề tài, nhiệt tình hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Hóa Phân tích nói riêng khoa Hóa học nói chung dạy dỗ, bảo động viên em suốt thời gian em học tập trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Em xin gửi tới Ban lãnh đạo toàn thể nhân viên trung tâm Chống độc – bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt anh chị phòng xét nghiệm độc chất lời cảm ơn sâu sắc nhất, cảm ơn anh chị giúp đỡ, động viên em nhiều trình thực đề tài trung tâm Em xin chân thành cảm ơn Công ty 3SAnalysis (http://www.3sanalysis.vn/) hỗ trợ trang thiết bị nhƣ tƣ vấn kỹ thuật trình thực nghiên cứu Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, anh chị bạn sinh viên Bộ mơn Hóa phân tích ln động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 09 tháng 02 năm 2018 Học viên Đỗ Thị Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan paraquat .3 1.1.1 Công thức hóa học, tính chất lý hố học paraquat 1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat .4 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 1.1.4 Dƣợc động học paraquat 1.2 Các phƣơng pháp xác định paraquat 1.2.1 Phƣơng pháp quang phổ 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) .8 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng .9 1.2.4 Phƣơng pháp điện di mao quản (CE) 12 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu sinh học (huyết tƣơng, nƣớc tiểu) nhằm phân tích paraquat 15 1.3.1 Phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng 15 1.3.2 Phƣơng pháp chiết pha rắn 17 1.4 Kết luận chung phần tổng quan 20 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 22 2.1 Trang thiết bị, hóa chất .22 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 22 2.1.2 Chất chuẩn 24 2.1.3 Hóa chất, dung mơi .24 2.1.4 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 25 2.2 Nội dung đối tƣợng nghiên cứu 26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 31 2.5 Ƣớc lƣợng độ không đảm bảo đo .35 2.5.1 Độ không đảm bảo đo đƣờng chuẩn 35 2.5.2 Độ không đảm bảo đo tổng hợp 37 2.6 Phân tích PQ huyết tƣơng bệnh nhân ngộ độc PQ 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 3.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu tách paraquat phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D) 39 3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng hệ đệm 39 3.1.2 Khảo sát cation ảnh hƣởng đến trình phân tách PQ .45 3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn PQ từ dung dịch chuẩn 46 3.1.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) thiết bị (IDL) 48 3.1.5 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) thiết bị .49 3.2 Nghiên cứu quy trình tách chiết PQ mẫu huyết tƣơng phƣơng pháp chiết pha rắn .50 3.2.1 Khảo sát khả loại bỏ cation cột C18 50 3.2.2 Khảo sát khả tách PQ sử dụng không sử dụng EDTA 10-3M 51 3.2.3 Khảo sát nồng độ EDTA bƣớc tiền xử lý mẫu huyết tƣơng 53 3.2.4 Khảo sát pH mẫu 54 3.2.5 Khảo sát loại chất hoạt động bề mặt 55 3.2.6 Khảo sát thành phần, tỉ lệ dung dịch rửa tạp .57 3.2.7 Khảo sát dung dịch rửa giải .59 3.2.8 Khảo sát tỉ lệ axit acetic dung dịch rửa giải .62 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 63 3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc 63 3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn PQ mẫu huyết tƣơng .64 3.3.3 Đánh giá phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn .66 3.3.4 Đánh giá độ xác phƣơng pháp 66 3.3.5 Xác định giới hạn phát phƣơng pháp 68 3.4 Phân tích mẫu thực tế đối chứng kết phân tích phƣơng pháp CE – C4D với phƣơng pháp HPLC 69 3.4.1 Định lƣợng nồng độ PQ mẫu huyết tƣơng bệnh nhân phƣơng pháp CE – C4D 69 3.4.2 Đối chứng kết phân tích với phƣơng pháp HPLC 72 KẾT LUẬN 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học paraquat Hình 1.2 Cơng thức hóa học dạng muối paraquat Hình 1.3 Cơ chế gây độc paraquat Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE – C4D sử dụng nghiên cứu 23 Hình 3.1 Điện di đồ ảnh hƣởng pH đến phân tách PQ 40 Hình 3.2 Điện di đồ ảnh hƣởng thành phần dung dịch điện di đến khả phân tách PQ 42 Hình 3.3 Điện di đồ ảnh hƣởng nồng độ đệm điện di đến khả phân tách PQ 44 Hình 3.4 Điện di đồ ảnh hƣởng cation đến tín hiệu PQ 45 Hình 3.5 Đƣờng chuẩn PQ dung dịch chuẩn 47 Hình 3.6 Điện di đồ minh chứng loại bỏ cation Na+ 140 mM cột C18 51 Hình 3.7 Điện di đồ minh chứng loại bỏ cation Ca2+ mM cột C18 51 Hình 3.8 Điện di đồ minh chứng hiệu sử dụng EDTA đến phân tách PQ 52 Hình 3.9 Điện di đồ ảnh hƣởng nồng độ EDTA đến phân tách PQ .54 Hình 3.10 Điện di đồ phân tích mẫu SPE điều kiện pH khác 55 Hình 3.11 Điện di đồ ảnh hƣởng chất HĐBM trình SPE đến khả phân tách PQ 56 Hình 3.12 Kết phân tích điện di sau chiết pha rắn sử dụng loại dung dịch rửa tạp khác .57 Hình 3.13 Điện di đồ ảnh hƣởng tỉ lệ dung dịch rửa tạp đến khả phân tách PQ .58 Hình 3.14 Điện di đồ ảnh hƣởng thành phần dung dịch rửa giải đến khả phân tách PQ 60 Hình 3.15 Kết ảnh hƣởng HCl dung dịch rửa giải đến tín hiệu PQ 61 Hình 3.16 Đồ thị thể phụ thuộc diện tích pic PQ vào thể tích HCl thêm vào dung dịch rửa giải 61 Hình 3.17 Điện di đồ thể ảnh hƣởng tỉ lệ axit acetic dung dịch rửa giải đến PQ 62 Hình 3.18 Quy trình chiết dung dịch mẫu cột C18 sử dụng chất tạo cặp ion 63 Hình 3.19 Độ chọn lọc phƣơng pháp 64 Hình 3.20 Đƣờng chuẩn PQ huyết tƣơng .65 Hình 3.21 Điện di đồ thể nồng độ PQ vào viện bệnh nhân ngộ độc PQ 71 Hình 3.22 Điện di đồ thể nồng độ PQ từ lúc vào viện đến sau lọc hấp phụ lần bệnh nhân điển hình 71 Hình 3.23 Đồ thị thể mối quan hệ nồng độ PQ huyết tƣơng phƣơng pháp CE – C4D HPLC 74 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn gốc 35 Bảng 2.2 Cách pha dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml .36 Bảng 2.3 Cách pha đƣờng chuẩn độ không đảm bảo đo .36 Bảng 3.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng pH đến diện tích pic (Spic) thời gian di chuyển (tdc) PQ chuẩn 40 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng thành phần dung dịch đệm điện di đến diện tích pic (Spic)và thời gian di chuyển (tdc) PQ chuẩn .42 Bảng 3.3 Kết khảo sát phụ thuộc diện tích pic (Spic) thời gian di chuyển (tdc ) PQ vào nồng độ dung dịch đệm điện di .44 Bảng 3.4 Điều kiện tối ƣu cho phân tích PQ phƣơng pháp CE – C4D 46 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ dung dịch PQ chuẩn 47 Bảng 3.6 Giới hạn phát PQ xác định phƣơng pháp điện di mao quản CE – C4D 48 Bảng 3.7 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) PQ xác định phƣơng pháp điện di mao quản CE – C4D 49 Bảng 3.8 Kết xác định độ chụm thiết bị CE – C4D phân tích định lƣợng PQ 49 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nồng độ EDTA đến hiệu suất thu hồi PQ huyết tƣơng 53 Bảng 3.10 Kết hiệu suất thu hồi PQ pH khác 55 Bảng 3.11 Kết hiệu suất thu hồi PQ sử dụngchất HĐBM khác SPE 56 Bảng 3.12 Kết hiệu suất thu hồi PQ sử dụng loại dung dịch rửa tạp khác 58 Bảng 3.13 Kết hiệu suất thu hồi PQ tỉ lệ dung dịch rửa tạp khác 59 Bảng 3.14 Kết hiệu suất thu hồi PQ sử dụng dung dịch rửa giải khác 60 Bảng 3.15 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PQ mẫu huyết tƣơng 64 Bảng 16 Kết khảo sát độ phƣơng pháp thêm chuẩn PQ .66 Bảng 3.17 Kết xác định độ lặp lại phƣơng pháp chiết pha rắn định lƣợng PQ huyết tƣơng mẫu thực 67 Bảng 3.18 Kết xác định độ tái lặp phƣơng pháp 68 Bảng 3.19 Kết xác định giới hạn phát phƣơng pháp (MDL) 69 Bảng 3.20 Cách pha dung dịch chuẩn gốc .35 Bảng 3.21 Cách pha dung dịch chuẩn trung gian 40 μg/ml .36 Bảng 3.22 Cách pha đƣờng chuẩn độ không đảm bảo đo 36 Bảng 3.23 Kết định lƣợng PQ 50 bệnh nhân .70 Bảng 3.24 Kết đối chứng nồng độ PQ huyết tƣơng phƣơng pháp HPLC .72 29 Lê Văn T 0,82 1,10 -21,90 30 Dƣơng Văn T 17,52 18,70 -6,30 Ghi chú: + Giới hạn phát (LOD) CE- C4D 0,5 µg/ml + Giới hạn phát HPLC 0,04 µg/ml 140 120 100 Y=A+B*X HPLC 80 Thơng sô Giá tri Sai sô -A 0.3603 0.23966 B 0.98327 0.00695 60 40 20 R SD N P -0.9993 1.10263 30