Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học tạo điều kiện tốt cho trình học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô, anh chị Bộ môn Hóa Phân tích- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Bộ môn Hóa Phân tích & Độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giúp đỡ trình học tập làm thực nghiệm Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân động viên, khích lệ, giúp đỡ tận tình suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu thuốc điều trị HIV 1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV Việt Nam giới 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1.3.1.Các phương pháp sắc ký 1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 1.4 Giới thiệu chung phương pháp điện di mao quản 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản .9 1.4.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản 10 1.4.3 Các trình xảy mao quản .11 1.4.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phương pháp điện di mao quản 12 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) .12 1.4.6 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13 1.4.7 Phân tích định lượng theo điện di mao quản 23 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Điều kiện nghiên cứu 24 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Nội dung nghiên cứu .26 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP AZT 29 3.1.1 Chọn bước sóng phát chất 29 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản 31 3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu 32 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng .33 3.1.5 Lựa chọn chế tách 34 3.1.6 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di 36 3.1.7 Ảnh hưởng thành phần dung dịch đệm 39 3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tạo mixen SDS 39 3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm 41 3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu .43 3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng điện di 45 3.1.12 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mao quản 46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu 47 3.1.14 Định tính 3TC, AZT NVP điều kiện điện di thiết lập 47 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 50 3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống .50 3.2.2 Tính đặc hiệu 50 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 52 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 3.2.5 Độ lặp lại phương pháp 57 3.2.6 Độ phương pháp 3.2.7 Kết định lượng chế phẩm 3.3 Ưu nhược điểm phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 3.4 Hướng phát triển đề tài .64 KẾT LUẬN .65 DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng MEKC 19 3.1 Tổng kết điều kiện điện di tối ưu 47 3.2 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic điện di đồ nồng độ 3TC tương ứng 52 3.4 Diện tích pic điện di đồ nồng độ AZT tương ứng 54 3.5 Diện tích pic điện di đồ nồng độ NVP tương ứng 55 3.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 57 Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng 3TC Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng AZT Kết xác định độ lặp lại MEKC định lượng NVP Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn 3TC Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn AZT Kết khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn NVP 57 3.13 Kết định lượng viên nén Avocomb-N 61 3.14 Kết định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 62 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 58 58 59 60 60 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách chất CZE 13 1.3 Cấu trúc Mixen dòng EOF MEKC 15 1.4 Cấu trúc không gian β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22 3.1 Phổ hấp thụ 3TC, AZT NVP 31 3.2 Khảo sát chế tách CZE, MEKC 35 3.3 Điện di đồ pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 37 3.4 Điện di đồ nồng độ SDS 25mM; 50mM 75mM 40 3.5 Điện di đồ nồng độ đệm 5mM; 10mM 20mM 42 3.6 Điện di đồ thời gian bơm mẫu 3s, 5s 7s 44 3.7 Điện di đồ điện di 15kV; 20kV 22 kV 46 3.8 Điện di đồ 3TC, AZT NVP điều kiện tối ưu 48 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm 3TC điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm AZT điều kiện tối ưu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm NVP điều kiện tối ưu 48 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP 51 3.9 3.10 3.11 3.12 49 49 49 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP 51 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP thêm hỗn hợp chuẩn Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ 3TC Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ AZT Đường chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ NVP 52 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb-N 62 3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 63 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 53 54 55 DANH MỤC VIẾT TẮT ARV Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người (Acquired immunodeficiency syndrome) Thuốc kháng virut USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) HIV AIDS CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Spic Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow) Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic chromatography) Diện tích pic tm Thời gian di chuyển (Migration times) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) HPLC MEKC RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine Hay S= (-8,29 ±8,22) + (0,439 ±0,025)C Đánh giá phương trình hồi quy đường chuẩn : Kiểm tra giá trị a với giá trị dựa vào chuẩn thống kê Fisher Thay số vào ta có: Sy2= 3,6781 ; S’y2= 18,7884 Ft= S’y2/ Sy2= 5,108 F(0,95;4;5)= 6,5914 Như Ft< F(0,95;3;4) khác phương sai phương trình ý nghĩa thống kê Hay xem a=0 tức sai số hệ thống không đổi Bảng 3.5 Diện tích pic điện di đồ nồng độ NVP tương ứng Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic 99,25 58,6 158,8 93,7 198,5 119,48 218,3 136,7 238,2 148,6 297,7 188,4 (mAU.s) Phương trình hồi quy tuyến tính : S= (-9,05 ±8,36) + (0,661 ±0,039)C Hệ số tương quan : r = 0,998 Scatterplot of Dien tich NVP (mAU.s) vs nong NVP(µg/ml) 200 Dien tich NVP (mAU.s) 175 150 125 100 75 50 100 150 200 nong NVP(µg/ml) 250 300 Hình 3.19 Đường chuẩn biểu thị quan hệ diện tích pic nồng độ NVP Kết bảng phân tích phương sai cho thấy giá trị P value< 0,05 số a,b < 0,05 chứng tỏ nồng độ AZT diện tích AZT có quan hệ tuyến tính Trị số P 55 kết phương trình hồi quy (chuẩn F) [...]... Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc ở nước ta Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản 2 CHƯƠNG 1 - TỔNG... xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 2.1 10 Hình 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 1.4.3 Các quá trình xảy ra trong mao quản Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là: 1 Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản 2 Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 µA) 3 Xuất hiện dòng điện. .. dụng rất nhiều trong kiểm nghiệm để định tính, định lượng các đồng phân quang học của một số dược chất trong các kỹ thuật sắc ký và điện di Việc sử dụng các CD và các dẫn xuất CD vào CE liên tục được nghiên cứu 1.4.7 Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát... 2009[11] 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 1.3.1 Các phương pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại... tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản. .. nhiều kỹ thuật khác nhau 1.4.6 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) [8,15] Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation... ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố K i xác định, trong những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan X i sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó Nếu các Ki của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích Đối... Cụ thể các kiểu đó là: 1 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE) 2 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-Kenetic:MEK hay MCEK) 3 Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), 4 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF) 5 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary... 2,0 mg / ml, tương ứng Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và Zidovudine trong huyết tương Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên thuốc và trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25] 1.4 Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản 1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 9 Nguyên tắc của sự... của hoạt chất cần phân tích Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu Hai kỹ thuật được lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện