Nghiên cứu định lượng levetiracetam trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HÀ THỊ LIÊN Mã sinh viên: 1101288 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HÀ THỊ LIÊN Mã sinh viên: 1101288 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy ThS Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tƣơng đƣơng sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học Ban giám hiệu nhà trường thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trường Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, khóa luận hoàn thành lúc xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Trước tiên, với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy Ths Tạ Mạnh Hùng- Giám đốc Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng Trung tâm Đánh giá Tƣơng đƣơng sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng tạo điều kiện cho thực đề tài Tôi xin tỏ lòng biết ơn đến toàn thể anh, chị Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học tạo điều kiện giúp đỡ, tận tình giải đáp thắc mắc công việc hết lòng giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình tôi, toàn thể bạn bè, người sát cánh, chia sẻ, động viên giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Sinh viên Hà Thị Liên MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ………………………………………………… 1.1.LEVETIRACETAM …………………………………………………… 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hóa………………………………… 1.1.2 Tác dụng dƣợc lý dƣợc động học………………………………… 1.1.3 Chỉ định - chống định……………………………………………… 1.1.4 Một số chế phẩm thị trƣờng……………………………………… 1.1.5 Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam………………………… 1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO…………………………………… 1.2.1 Khái niệm……………………………………………………………… 1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC…………………………………… 1.2.3 Một số thông số trình sắc ký………………………… 1.2.4 Cơ sở lý thuyết việc lựa chọn điều kiện sắc ký…………………… 11 1.2.5 Phƣơng pháp định lƣợng HPLC……………………………… 14 1.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 15 1.3.1 Khái niệm……………………………………………………………… 15 1.3.2 Các tiêu thẩm định………………………………………………… 15 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……………………………………… 19 2.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị…………………………………………… 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU…………………………………………… 20 2.2.1 Xây dựng phƣơng pháp HPLC định lƣợng LEVET huyết tƣơng………………………………………………………………………… 20 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích…………………………………… 21 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………… 21 2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng tự tạo chứa LEVET…………………… 21 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp phân tích…………………………………… 22 2.3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích………………………………… 23 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LEVET TRONG HT 28 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký nội chuẩn………………… 28 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện tách chiết Levetiracetam 32 3.1.3 Quy trình phân tích Levetiracetam huyết tƣơng……………… 33 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 34 3.2.1 Tính chọn lọc - đặc hiệu 34 3.2.2 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 36 3.2.3 Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ) 36 3.2.4 Độ - Độ xác………………………………………………… 37 3.2.5 Tỷ lệ thu hồi 38 3.2.6 Độ ổn định hoạt chất HT…………………………………… 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 KẾT LUẬN 44 4.2 KIẾN NGHỊ …………………………………………………………… 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, STT Ý nghĩa chữ viết tắt CV Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) DĐH Dược động học ĐVTN Động vật thí nghiệm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality ControlSample) HT Huyết tương IS Nội chuẩn (Internal Standard) LCMS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LLOQ Giới hạn định lượng (Lower Limit of Quantification) 10 LQC Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control sample) 11 MQC Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình 12 NTN Người tình nguyện 13 PA Tinh khiết phân tích (Pure Analysis) 14 QC Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control sample) 15 SKĐ Sắc ký đồ 16 SPE Chiết pha rắn (Solid-Phase Extration) 17 TKTW Thần kinh trung ương 18 TĐSH Tương đương sinh học 19 US-FDA Cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) 20 UV-VIS Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lượng LEVET HT 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 19 2.2 Các hóa chất dùng nghiên cứu 19 2.3 Các mẫu HT trắng dùng nghiên cứu 19 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu 20 2.5 Thiết bị HPLC 20 2.6 Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn HT 22 2.7 Cách chuẩn bị mẫu QC HT 22 2.8 Chuẩn bị mẫu QC xác định độ 24 3.1 Độ mẫu thuộc đường chuẩn 36 3.2 Kết xác định giá trị LLOQ 37 3.3 Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày 37 3.4 Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 38 3.5 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi LEVET 38 3.6 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi IS 39 3.7 Kết độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn 39 3.8 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn 40 3.9 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc nhiệt độ 2ºC - 8ºC 40 3.10 Kết độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông - rã 41 3.11 Kết độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài 42 3.12 Kết độ ổn định mẫu huyết tương sau xử lý (trong 43 autosampler) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức cấu tạo levetiracetam 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS LEVET 28 3.2 SKĐ LEVET nội chuẩn amoxicillin 29 3.3 SKĐ LEVET nội chuẩn atenolol 29 3.4 SKĐ LEVET nội chuẩn paracetamol 30 3.5 SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung 31 dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 15 : 85 (tt/tt) 3.6 SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung 31 dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ : 94 (tt/tt) 3.7 SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung 32 dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ : 96 (tt/tt) 3.8 SKĐ mẫu HT sau tủa protein ACN 32 3.9 SKĐ mẫu HT sau tủa protein acid HClO4 33 3.10 SKĐ mẫu HT sau chiết lỏng – lỏng với cloroform 33 3.11 SKĐ mẫu HT trắng 34 3.12 SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol 35 3.13 SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Động kinh tình trạng bệnh lý não nhiều nguyên nhân khác gây với bệnh cảnh phức tạp đa dạng Bệnh gặp tuổi, giới Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc bệnh động kinh giới khoảng 0,5% dân số, thay đổi tùy theo quốc gia, vùng, dân tộc Tại Việt Nam khoảng 2% dân số mắc bệnh có đến 60% số bệnh nhân trẻ em [8] [9] [12] [17] Tổ chức Y tế giới WHO Liên đoàn Quốc tế chống động kinh ILAE (International League Against Epilepsy) xác định: “Động kinh tình trạng tái diễn hai động kinh trở lên cách 24 giờ, sốt cao nguyên nhân cấp tính khác rối loạn chuyển hóa, ngừng thuốc hay rượu đột ngột gây nên” [17] [23].Bệnh động kinh xem vấn đề thời với chuyên ngành tâm thần thần kinh Mặc dù nhóm bệnh lý nặng hệ thần kinh nói chung, não nói riêng, nhiên điều trị sớm phù hợp, số trường hợp khỏi bệnh chiếm tỷ lệ cao [1] [4] [8] Trên giới, động kinh điều trị bằng thuốc kháng động kinh phẫu thuật số cá thể [12] Tại Việt Nam số lượng bệnh nhân động kinh điều trị thành công phương pháp phẫu thuật ít, hầu hết phải dùng thuốc kháng động kinh kéo dài Levetiracetam (C8H14N2O2, M =171,19 g/mol) dẫn chất pyrolidin, dùng để điều trị bệnh động kinh có hiệu Cơ quan quản lý Thuốc thực phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép đăng ký lưu hành năm 2008 Levetiracetam (LEVET) có cấu trúc hóa học không giống với thuốc điều trị động kinh khác có thuốc chống co giật thị trường Dược phẩm Việt Nam phí điều trị tương đối cao Để giảm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân cộng đồng, số doanh nghiệp dược nước nghiên cứu sản xuất thuốc generic chứa dược chất LEVET Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học thuốc cần thiết để chứng minh thuốc generic có hiệu điều trị tương đương với thuốc biệt dược gốc Dựa điều kiện trang thiết bị có tham khảo tài liệu [13] [14] [16] [22], tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam huyết tương người phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu cao” với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích LEVET huyết tương có đủ độ nhạy, độ xác phù hợp cho nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) tương đương sinh học (TĐSH) thuốc chứa hoạt chất levetiracetam Để đạt mục tiêu này, đề tài thực nội dung: Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng levetiracetam huyết tương phương pháp HPLC Thẩm định phương pháp xây dựng theo quy định US-FDA 34 Lắc xoáy Thêm mL cloroform Lắc học phút Ly tâm 3000 vòng/phút phút Hút mL lớp dung môi phía Bay dung môi dòng khí N2 40ºC thu lấy cắn Hòa tan cắn 0,5 mL pha động Tiêm sắc ký * Điều kiện sắc ký: + Cột Phenomenex, C18; 250 x 4,6 mm; µm Nhiệt độ cột 40oC + Pha động: acetonitril – dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6:94 (tt/tt) + Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút + Bước sóng phát hiện: 210 nm + Thể tích tiêm mẫu: 50 µL 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1 Tính chọn lọc - đặc hiệu Tiến hành phân tích mẫu HT trắng, mẫu HT có chuẩn nội mẫu HT chứa chuẩn LEVET phương pháp HPLC xây dựng theo nội dung phương pháp nghiên cứu trình bày mục 2.3.3.1 Kết thu được sau: Hình 3.11: SKĐ mẫu HT trắng 35 Hình 3.12: SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol Hình 3.13: SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS Nhận xét: - Hình 3.11: Trên SKĐ, khoảng thời gian từ - 10 phút mẫu HT trắng không xuất píc - Hình 3.12: Trên SKĐ xuất píc chuẩn nội có tR khoảng 7,6 phút - Hình 3.13: Trên SKĐ mẫu chuẩn LEVET chuẩn nồng độ 0,25 µg/mL khoảng thời gian từ - 10 phút xuất píc có thời gian lưu khoảng 7,6 phút (tương ứng với píc IS) píc có tR khoảng 9,1 phút Kết phân tích cho thấy, píc LEVET cân đối, rõ nét tách hoàn toàn với 36 píc IS, píc tạp Không có đáp ứng píc tạp mẫu trắng thời điểm trùng với thời gian lưu LEVET (9,1 phút) IS (7,6 phút) Do vậy, phương pháp đặc hiệu chọn lọc LEVET 3.2.2 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.2, xử lý mẫu theo quy trình xử lý mẫu xây dựng mục 3.1.3, thu kết sau: Bảng 3.1.Độ mẫu thuộc đường chuẩn Độ (%) Nồ ng̣ đô Đƣờng Đƣờng Đƣờng Đƣờng Đƣờng (µg/mL) chuẩn chuẩn chuẩn chuẩn chuẩn S1 0,25 98,4 100,7 102,3 102,0 98,3 S2 0,5 103,4 98,4 95,0 97,3 102,5 S3 1,0 98,4 101,5 100,6 98,3 101,8 S4 2,5 101,7 96,6 101,7 97,3 102,3 S5 5,0 103,8 100,3 96,8 101,2 98,3 S6 10,0 99,3 102,1 96,9 97,1 96,8 S7 17,5 96,4 100,1 103,4 101,5 98,0 S8 25,0 98,6 100,3 103,2 105,4 102,1 Mẫu Phƣơng trình A = 0,1292 A = 0,1342 A = 0,1301 A = 0,1316 A = 0,1300 hồi quy B = 0,0010 B= -0,0038 B = 0,0043 B = 0,0024 B = 0,0022 (y = Ax + B) r = 0,9995 r = 0,9998 r = 0,9993 r = 0,9994 r = 0,9996 Kết thẩm định cho thấy khoảng nồng độ từ 0,25 đến 25,0 µg/mL có tương quan tuyến tính nồng độ LEVET tỷ lệ diện tích píc LEVET/IS với hệ số tương quan xấp xỉ Nồng độ LEVET xác định từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết nằm giới hạn cho phép (85,0% - 115,0%) theo qui định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 3.2.3 Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ) Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.3, kết thu được trình bày bảng 3.2 37 Bảng 3.2 Kết xác định giá trị LLOQ Tỷ lệ diện tích píc LEVET/IS 0,031 Nồng độ xác định từ đƣờng chuẩn (µg/mL) 0,232 Độ so với nồng độ thực (%) 92,5 0,032 0,239 95,0 0,037 0,282 112,1 0,037 0,277 110,2 0,035 0,263 104,9 0,036 0,267 106,4 STT Trung bình (%) 103,5 CV (%) 7,8 Kết thẩm định cho thấy giá trị nồng độ LEVET xác định từ đường chuẩn so với nồng độ thực có mẫu nằm khoảng từ 80 - 120% CV < 20% đáp ứng yêu cầu giới hạn định lượng phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Như mẫu chuẩn chứa LEVET có nồng độ 0,25 µg/mL đáp ứng yêu cầu LLOQ độ đúng, độ xác phương pháp phân tích dịch sinh học 3.2.4 Độ - Độ xác Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.4, kết thu sau: Bảng 3.3 Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày LQC ( 0,75µg/mL) MQC ( 12,5 µg/mL) HQC ( 20,0 µg/mL) STT LEVET/ Nồng độ Độ LEVET/ Nồng độ Độ LEVET Nồng độ Độ đúng IS (µg/mL) IS (µg/mL) /IS (µg/mL) (%) (%) (%) 0,092 0,755 101,0 1,599 13,367 107,3 2,377 19,874 99,7 0,091 0,091 0,752 0,744 100,6 99,6 1,549 1,642 12,943 103,9 13,722 110,1 2,361 2,430 19,741 99,0 20,319 101,9 0,090 0,088 0,742 0,722 99,3 96,6 1,572 1,440 13,134 105,4 12,031 96,6 2,436 2,342 20,363 102,2 19,582 98,2 0,093 Trung bình 0,764 0,747 102,2 99,9 1,567 13,095 105,1 13,049 104,7 2,283 19,082 19,827 95,7 99,5 1,9 1,9 2,4 2,4 CV (%) 4,3 4,3 38 Bảng 3.4.Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày Mẫu LQC(0,75 Độ đúng, Độ lặp lại Khác ngày (n = 3) Mẫu MQC(12,5 µg/mL) Mẫu HQC(20,0 µg/mL) µg/mL) Độ Độ lặp lại Độ Độ lặp lại Độ Độ lặp lại (%) (CV%) (%) (CV%) (%) (CV%) 96,4 3,7 96,4 7,3 97,5 2,6 Các mẫu QC có độ nằm giới hạn 85% - 115% CV (%) < 15% (1,9% - 7,3%) Như vậy, phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu độ độ xác phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học ngày khác ngày 3.2.5 Tỷ lệ thu hồi Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.5, kết thu sau: Bảng 3.5: Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi LEVET STT LQC (0,75 µg/mL) MQC (12,5 µg/mL) HQC (20,0 µg/mL) Mẫu HT Mẫu DM Mẫu HT Mẫu DM Mẫu HT Mẫu DM 19273 27937 325934 463683 528470 763246 20020 27985 335104 462522 458520 763918 19771 28545 340850 464772 518652 763454 17922 28683 329801 464434 523040 762903 18665 29055 328657 462007 534157 766737 19360 28672 320428 459651 525389 760931 Trung bình 19169 28480 330129 462845 514705 763532 CV (%) 4,0 1,5 2,2 0,4 5,4 0,2 Tỷ lệ thu hồi 53,4% 56,6% 53,5% Kết thẩm định cho thấy, nồng độ tỷ lệ thu hồi LEVET tương đối cao từ 53,4 - 56,6 % có độ lặp lại tốt, giá trị CV < 15 % (0,2 % - 5,4 %) 39 Bảng 3.6 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi IS STT Diện tích píc IS (mAu.s) Trong huyết tƣơng 209840 Trong dung môi 2939368 218815 3029922 218289 2919341 198338 2888753 212205 2879483 208349 2956859 Trung bình 210973 2935621 3,57 1,86 CV (%) Tỷ lệ thu hồi 12,0% Kết thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi IS thấp, 12,0 % nhiên hiệu suất chiết lặp lại (CV < 5%), đồng thời tỷ số diện tích pic LEVET/IS lặp lại, độ – độ xác phương pháp đạt yêu cầu (mục 3.2.4) Do vậy, phương pháp xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu chiết tách LEVET IS HT 3.2.6 Độ ổn định hoạt chất HT 3.2.6.1 Độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu đượckết sau: Bảng 3.7 Kết độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn Mẫu Độ ổn định IS làm việc thời gian ngắn Diện tích píc ban đầu (mAu.s) Diện tích píc sau (mAu.s) 2765312 2769663 2766447 2766072 2766280 2768165 Trung bình 2766013 2767967 0,02 0,07 CV (%) Độ lệch (%) 0,1 Kết nồng độ LEVET sau bảo quản nhiệt độ phòng có độ lệch 0,1% so với ban đầu, giá trị CV = 0,1% đáp ứng yêu cầu độ lệch 2% CV 40 không 2% Mẫu chuẩn nội ổn định bảo quản nhiệt độ phòng 3.2.6.2 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu kết sau: Bảng 3.8 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn Mẫu Độ ổn định LEVET gốc thời gian ngắn Diện tích píc ban đầu Diện tích píc sau 1064623 1059836 1068545 1060875 1065794 1061663 Trung bình 1066321 1060791 CV (%) 0,2 Độ lệch (%) 0,1 - 0,5 Kết sau bảo quản nhiệt độ phòng nồng độ LEVET mẫu có độ lệch -0,5% so với ban đầu, giá trị CV = 0,1% đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 2% CV ≤ 2% Mẫu chuẩn gốc ổn định vòng bảo quản nhiệt độ phòng 3.2.6.3 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian dài Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu kết sau: Bảng 3.9 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc nhiệt độ 2ºC -8ºC Mẫu Trung bình CV (%) Độ lệch (%) Ban đầu 499,5 499,8 499,8 499,7 0,03 Nồng độ LEVET (µg/mL) Sau ngày Sau 17 ngày 492,2 491,7 492,4 491,7 492,0 492,0 492,2 491,8 0,04 0,04 -1,5 -1,6 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc nhiệt độ 2ºC - 8ºC có độ lệch so với nồng độ ban đầu -1,5% sau ngày -1,6% sau 17 ngày đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 2% CV ≤ 2% Mẫu chuẩn gốc ổn định sau 17 ngày bảo quản nhiệt độ 2ºC - 8ºC 41 3.2.6.4 Độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông - rã Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu kết sau: Bảng 3.10 Kết độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông - rã Ban đầu Số Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) TT Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) LEVET Nồng độ LEVET /IS (µg/mL) IS 22198 228395 0,097 0,719 585512 214265 2,733 20,409 21768 211880 0,103 0,760 580,805 210225 2,763 20,634 20895 216523 0,097 0,714 591059 213441 2,769 20,682 22297 224055 0,100 0,736 571065 213937 2,669 19,935 22435 221877 0,101 0,748 573349 212556 2,697 20,145 20931 Trung bình 209522 0,100 0,739 0,736 589287 218816 Trung bình 2,693 20,113 20,319 CV (%) 2,4 IS LEVET Nồng độ /IS (µg/mL) LEVET CV (%) 1,5 Sau ba chu kỳ đông rã Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) Số Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) 23646 LEVET Nồng độ LEVET Nồng độ LEVET IS /IS (µg/mL) /IS (µg/mL) 211643 0,112 0,702 591181 197998 2,986 19,127 22325 203092 0,110 0,690 612944 207162 2,959 18,954 22484 199644 0,113 0,707 585454 202485 2,891 18,522 22938 209281 0,110 0,688 604216 205370 2,942 18,847 20878 Trung bình 186423 0,112 0,703 0,698 584436 196683 Trung bình 2,971 19,035 18,897 TT LEVET IS CV (%) Độ lệch so với ban đầu 1,2 -5,1% CV (%) Độ lệch so với ban đầu 1,2 -7,0% Kết sau chu kỳ đông - rã đông, nồng độ LEVET mẫu LQC, HQC có độ lệch so với nồng độ ban đầu -5,1% (CV = 1,2%) -7,0 % (CV = 1,2%), đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 15% CV ≤ 15% Mẫu HT ổn định sau chu kỳ đông - rã đông 42 3.2.6.5 Độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu kết bảng sau: Bảng 3.11 Kết độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài Ban đầu Số Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) TT LEVET IS Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) LEVET Nồng độ LEVET /IS (µg/mL) IS LEVET /IS Nồng độ (µg/mL) 22198 228395 0,097 0,719 585512 214265 2,733 20,409 21768 211880 0,103 0,760 580805 210225 2,763 20,634 20895 216523 0,097 0,714 591059 213441 2,769 20,682 22297 224055 0,100 0,736 571065 213937 2,669 19,935 22435 221877 0,101 0,748 573349 212556 2,697 20,145 20931 209522 Trung bình 0,100 0,739 0,736 589287 218816 Trung bình 2,693 20,113 20,319 CV (%) 2,4 CV (%) 1,5 Sau 62 ngày Số TT Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) LEVET Nồng độ LEVET IS /IS (µg/mL) 20439 173761 0,118 0,720 570072 183642 21274 185716 0,115 0,701 548511 174814 3,138 19,785 22155 185616 0,119 0,731 580840 183778 3,161 19,929 21127 178172 0,119 0,726 582881 186846 3,120 19,671 21517 177583 0,121 0,743 581375 184749 3,147 19,843 22017 185259 Trung bình 0,119 0,728 0,725 582680 186715 Trung bình 3,121 19,678 19,747 LEVET IS CV (%) Độ lệch so với ban đầu 1,9 -1,5% LEVET /IS 3,104 Nồng độ (µg/mL) 19,574 CV (%) Độ lệch so với ban đầu (%) 0,7 -2,8% Kết sau bảo quản nhiệt độ -35 ± 5oC, nồng độ LEVET mẫu LQC, HQC có độ lệch so với nồng độ ban đầu -1,5 % (CV = 1,9%) -2,8 % (CV = 0,7%), đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 15% CV ≤ 15% Mẫu HT ổn định sau 62 ngày bảo quản nhiệt độ -35 ± 5oC 43 3.2.6.6 Độ ổn định mẫu HT sau xử lý (trong Autosampler) Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu kết sau: Bảng 3.12 Kết độ ổn định mẫu huyết tương sau xử lý Ban đầu Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) STT Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) 228395 LEVET /IS 0,097 Nồng độ (µg/mL) 0,719 585512 LEVET Nồng độ /IS (µg/mL) 214265 2,733 20,409 21768 211880 0,103 0,760 580805 210,25 2,763 20,634 20,895 216523 0,097 0,714 591059 213441 2,769 20,682 22297 224055 0,100 0,736 571065 213937 2,669 19,935 22435 221877 0,101 0,748 573349 212556 2,697 20,145 20931 209522 TB 0,100 0,739 0,736 589287 218816 TB 2,693 20,113 20,319 LEVET IS 22198 CV (%) LEVET 2,4 IS CV (%) 1,5 Sau 32 giờ/ nhiệt độ phòng Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) STT Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL) LEVET IS LEVET /IS Nồng độ (µg/mL) LEVET IS 22344 230618 0,097 0,753 584146 214100 2,728 20,489 22030 216070 0,102 0,791 578168 207554 2,786 20,918 20768 218740 0,095 0,739 588199 213208 2,759 20,717 22713 229753 0,099 0,768 562661 211291 2,663 19,998 22154 222198 0,100 0,774 600396 222857 2,694 20,232 20881 Trung bình 210842 0,099 0,769 0,766 579512 219167 Trung bình 2,644 19,857 20,369 CV (%) Độ lệch so với ban đầu 2,4 4,1% LEVET Nồng độ /IS (µg/mL) CV (%) Độ lệch so với ban đầu 2,0 0,2% Nồng độ LEVET sau xử lý bảo quản autosample sau 31 sai khác không 15% (4,1% 0,2%) so với nồng độ định lượng ban đầu giá trị CV nhỏ 15% (2,4% 2,0%) Mẫu HT ổn định sau xử lý bảo quản 31 autosampler 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận: Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích levetiracetam huyết tƣơng ngƣời với điều kiện nhƣ sau: - Quy trình xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để rã đông nhiệt độ phòng Lấy mL HT, thêm 50 µL dung dịch IS Lắc xoáy Thêm 0,25 mL dung dịch NH4OH 0,1 N Lắc xoáy Thêm mL cloroform Lắc học phút Ly tâm 3000 vòng/phút phút Hút mL lớp dung môi Bốc dung môi dòng khí N2 40ºC thu lấy cắn Hòa tan cắn 0,5 mL pha động Tiêm sắc ký - Điều kiện sắc ký: + Cột Phenomenex, C18; 250 x 4,6 mm; µm Nhiệt độ cột 40 oC + Pha động: acetonitril – dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (6:94) + Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút + Thể tích tiêm mẫu: 50 µL Đã tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng LEVET với tiêu: Độ đặc hiệu - chọn lọc, đường chuẩn, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ - độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định kết quả: - Phương pháp có độ đặc hiệu - chọn lọc với LEVET - Có tương quan tuyến tính chặt chẽ đáp ứng phân tích nồng độ LEVET khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,999 Khoảng tuyến tính từ 0,25 - 25,0µg/mL - Giới hạn định lượng dưới: LLOQ = 0,25 µg/mL - Phương pháp có độ tốt (95,7 - 107,3%), độ lặp lại với giá trị CV% ≤ 15% Đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ lặp lại ngày khác ngày - Tỷ lệ thu hồi LEVET tương đối cao (53,4 - 56,6 %) Độ lặp lại tốt (CV < 15 %) Phương pháp xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu chiết tách LEVET HT 45 - Phương pháp đáp ứng yêu cầu độ ổn định hoạt chất huyết tương Phương pháp đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích chất dịch sinh học theo tiêu chuẩn US - FDA 4.2 KIẾN NGHỊ Sau thực đề tài, có số kiến nghị sau: - Ứng dụng phương pháp phân tích để định lượng LEVET HT NTN nghiên cứu SKD đánh giá TĐSH chế phẩm chứa LEVET thị trường - Ứng dụng phương pháp phân tích để định lượng LEVET HT bệnh nhân động kinh sử dụng LEVET kéo dài để điều chỉnh liều hợp lý, đạt hiệu điều trị tối ưu - Tiến hành nghiên cứu định lượng đồng thời LEVET HT bệnh nhân sử dụng thuốc chống động kinh phối hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2010), Bệnh học, Nhà xuất Y học, tr.325 - 329 Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam, tr 887 - 888 Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, tr.125 - 126 Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược lý học, tập 1, Nhà xuất Y học, tr 117 - 121 Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất Y học, tr 123 - 141, tr 168 - 200 Bộ Y tế (2010), Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học đăng ký thuốc, Thông tư số 08/2010/TT-BYT Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 84 - 104 Lê Quang Cường (2005), Động kinh, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh: Aidan Neligan, Sander J.M (2011), The incidence and prevanlence of epilepsy - Chapter 1, UCL Institute of Neurology, London 10 Australian Government - Departmant of Health and Ageing, Therapeutic Goods Admistration (2004): Regulatory Guidelines for Prescription medicines, Appendix 15 - Biopharmaceutic studies 11 Dong M., Ahuja S (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, United Kingdom, p 19 - 45 12 International League Against Epilepsy (2006), “Guideline for the management of epilepsy in the elderly”, Actaneurol, pp 106-116 13 Jain DS, Subbaiah “Determination of G, Sanyal M, Pal levetiracetam in U, Shrivastav human plasma PS (2006), by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry and its application to bioequivalence studies”, Rapid Commun Mass Spectrom 20(17):2539 2547 14 Jens Martens-Lobenhoffer, Stefanie M Bode-Böger (2005), “Determination of levetiracetam in human plasma with minimal sample pretreatment”, Journal of Chromatography B, volume 819, issue 1, pages 197 – 200 15 Karakevich Y., Lobrutto R (2007), HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley & Sons p.139 - p.188, p.75 - p.132 16 Madhira V N S Ramprasad, B SyamaSundar (2004), “Development and validation of high performance liquid chromatographic Method for the Determination of Levetiracetam in Human Plasma by Electospray Ionization - Mass Spectrometry”, International Journal of Scientific & Engineering Research, Volume 5, Issue 17 Nation Institute for Health and Clinical Excellence (2012), The epilepsies: the diagnosis and management of the epilepsies in adults and children in primary and secondary care - NICE clinical guidelices 137 18 PDR Netword (2007), Physicians Desk Reference 61st ed., Thomson PDR Publisher, Montvale, NJ., p 3314 19 Riley C., Rosanske T (1996), Development and Validication of Analytical Methods, Elsevier Science Ltd., pp - 99, 249 - 282 20 U.S Department of Heath and Human Services, Food and Drug Administrion, Center for Drug evaluation and Research (2001): Guidance for industry - Bioanalytical Method Validation 21 United State Pharmacopeia (2012), USP 35/ NF 30, volume 3, pp 3659 3662 22 Vincenzo Pucci, Francesca Bugamelli, Roberto Mandrioli, Anna Ferranti, Ernst Kenndler, Maria Augusta Ragg (2004), “High-performance liquid Chromatographic determination of levetiracetam in human plasma: Comparison of Different sample clean-up Procedures”, Biomedical Chromatography 18: 37-44 23 World Health Organization(2001), Epilepsy, 165 (168), pp 3-79 Website: 24 http://vinapharm.com.vn 25 http://www.ema.europa.eu/docs/enGB/document_library/Scientificguidelin e/2011/08/WC500109686.pdf [...]... lựa chọn phương pháp này để định lượng LEVET trong HT người - Phương pháp 3: Phân tích bằng HPLC với detector UV, quy trình xử lý tương đối phức tạp gồm 2 kỹ thuật tủa protein với acid và chiết lỏng - lỏng bằng cyclohexan Tuy vậy, giới hạn định lượng của phương pháp không cao (1,0 µg/mL) không phù hợp để định lượng LEVET trong HT người tham gia các nghiên cứu SKD/TĐSH - Phương pháp 4: Phân tích bằng HPLC... hằng định Đo chiều cao của píc chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình 1.2.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương. .. tạp có trong mẫu, cho phép xác định được lượng LEVET trong mẫu với độ đúng độ chính xác đáp ứng các quy định của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [19], [20] 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo 6 chỉ tiêu như trong hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch... dựng phương pháp định lượng LEVET trong HT bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS bằng cách cải tiến các phương pháp HPLC đã được công bố của các tác giả Phương pháp xây dựng sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam 1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. .. thử [5], [7] 1.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 1.3.1 Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích... nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp... bố tuy nhiên có độ nhạy không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET Một số phương pháp định lượng LEVET trong HT người được trình bày ở Bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT người Phương pháp xử lý mẫu Chiết Điều kiện sắc ký lỏng - lỏng bằng - Cột Blue Orchid C18, 50 x 2 mm, 1,8 µm ethylacetat TLTK [16] - Pha động: Acetonitril : nước, tỷ lệ 20 : 80... phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tuy vậy, phương pháp LCMS kỹ thuật phân tích phức tạp, thiết bị phân tích có giá trị kinh tế cao không phổ biến tại nhiều phòng thí 6 nghiệm ở nước ta Do vậy, khó có thể áp dụng được Một số phương pháp HPLC định lượng LEVET trong dịch sinh học đã được công bố tuy nhiên có độ nhạy không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET Một số phương pháp. .. chạy sắc ký các mẫu trên Ghi lại săc ký đồ và đáp ứng píc Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ phân tích được với nồng độ thực có trong mẫu Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính độ lệch CV% giữa các nồng độ phân tích được của mỗi lô trong mẫu QC được phân tích trong. .. phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam Trong công thức cấu tạo của LEVET không có vòng thơm hay các nối đôi liên hợp, chỉ có một số dị tố (N, O), nên hấp thụ UV-VIS kém và không có phổ huỳnh quang Do vậy, định lượng LEVET trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với các detector phổ dụng như UV hoặc huỳnh quang gặp nhiều khó khăn Hiện nay, để định lượng LEVET trong dịch sinh học đa số các tác giả sử dụng phương