NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG NEGUNDOSIDE TRONG LÁ NGŨ TRẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC Hà Thị Hồng NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG NEGUNDOSIDE TRONG LÁ NGŨ TRẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Hóa Dược ( Chương trình đào tạo chuẩn) Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lịng kính trọng lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Thị Hương Giang (Khoa hóa học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên) TS Nguyễn Văn Tài (Trưởng Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu Trung Ương) giao đề tài hướng dẫn tận tình giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giảng dạy Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên trang bị cho em kiến thức quý giá năm học Em xin chân thành cảm ơn chị Phan Thị Trang, … anh chị khoa Hóa thực vật, Viện Dược Liệu hướng dẫn, bố sung thêm kiến thức cho em, tạo môi trường thuận lợi để em thực thí nghiệm suốt thời gian em hoàn thành nghiên cứu báo cáo Đồng thời em xin cảm ơn tất bạn bè, anh chị em đồng hành, giúp đỡ em quãng thời gian vừa qua Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ ln chăm sóc, động viên cho có tinh thần sức khỏe tốt để hồn thành báo cáo khóa luận ngày hôm Hà Nội, tháng năm 2018 Sinh viên Hà Thị Hồng MỤC LỤC Contents PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc Giới thiệu .4 Phân bố .4 Thành phần hóa học 3.1 Alkaloid .5 3.2 Flavonoid 3.3 Iridoid Các nghiên cứu liên quan đến Ngũ trảo Tổng quan Negundoside .12 5.1 Công thức Negundoside 12 5.2 Tác dụng dược lý 13 1.3 Tổng quan phương pháp HPLC 17 1.3.1 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 17 1.3.2 Pha tĩnh kỹ thuật HPLC 19 1.3.3 Pha động HPLC .19 1.3.4 Các loại detector dung HPLC 20 1.3.5 Nguyên tắc 20 1.3.6 Cơ sở lý thuyết 20 1.3.7 Các thông số đặc trưng trình sắc ký .21 1.3.8 Cách đánh giá pic .24 1.4 Một số phương pháp định lượng negundoside HPLC .24 PHẦN II: THỰC NGHIỆM 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Cách pha dung dịch chuẩn dung dịch pha động 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 2.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 26 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Khảo sát phương pháp chiết 27 3.2 Khảo sát dung môi chiết 27 3.3 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 27 3.3.1 Xác định bước song phát chất phân tích với detector UV-VIS 27 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu bơm vào cột 28 3.3.3 Khảo sát thành phần pha động 28 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ pha động 28 3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 29 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống .29 3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp .30 3.4.3 Khảo sát độ tuyến tính xây dựng đường chuẩn Negundoside 31 3.5 Phân tích mẫu thực tế 32 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng với 12.000 loài thuộc 2.256 chi, 305 họ Kết điều tra Viện Dược liệu ghi nhận 3948 loài thực vật có cơng dụng làm thuốc Việc tăng cường nghiên cứu, khai thác phát triển nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc định hướng lớn chiến lược phát triển ngành công nghiệp dược nâng cao sức khỏe cộng đồng Từ năm đầu kỷ XIX, lĩnh vực y dược học, việc kết hợp phương pháp khoa học kỹ thuật loại thực vật xuất phát từ thiên nhiên đưa người đến bước lớn việc phát minh nhiều loại thuốc có khả chữa bệnh Cây Ngũ trảo từ lâu biết đến thảo dược quý Đặc biệt Ngũ trảo sử dụng y học cổ truyền khu vực Châu Á để làm chất kháng viêm như: có tác dụng dự phòng phát triển sưng khớp viêm khớp, giảm ho mạnh, tăng tác dụng thuốc chống co giật, giúp làm giảm liều lượng tác dụng phụ thuốc chống co giật, chống lại độc tính tế bào gan,… Trong nghiên cứu gần Châu Á phát nhiều hợp chất Negundoside có hoạt tính sinh học cao chiết xuất từ Ngũ trảo Tuy nhiên, Việt Nam, nghiên cứu hàm lượng tác dụng dược lý, hoạt tính sinh học Ngũ trảo cịn hạn chế Với mong muốn góp phần tìm hiểu thành phần hóa học Ngũ trảo, em thực đề tài: “Nghiên cứu định lượng Negundoside Ngũ trảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Theo hướng nghiên cứu này, khóa luận tốt nghiệp có nhiệm vụ sau: - Nghiên cứu khảo sát điều kiện thực nghiệm để xây dựng đường chuẩn Negundoside hoa ngũ trảo - Khảo sát quy trình xử lý mẫu - Xác định hàm lượng Negundoside Ngũ trảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc Giới thiệu Cây Ngũ trảo (còn gọi Ngũ trảo, Quan Âm, Mẫu Kinh, Ngũ Trảo phong, Chân Chim) có tên khoa học Vitex negundo L (tên đồng nghĩa Vitex paniculata Lamk., V Arborea Desf., V Spicata Lour.) thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Ngũ trảo loại gỗ nhỏ, cao từ - 5m, cành non hình vng có lơng mịn màu xám Lá mọc đối, - chét, hình trái xoan mũi mác, mặt nhẵn màu lục sẫm, mặt có lơng mịn màu trắng bạc, khía phần đầu Cụm hoa mọc đầu cành, có màu tím nhạt lam tía, mùa hoa tháng 11 Quả hạch hình cầu, có đài tồn bao bọc Mùa từ tháng đến tháng 7, thường mọc hoang trồng làm hàng rào, làm cảnh đẹp, thơm, dùng làm thuốc Phân bố Cây Ngũ trảo mộc nhiều Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, đảo Philippines… Ở Việt Nam, mọc hoang trồng Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Nghệ An, Quảng Bình, Quảng Nam, Bình Định.[1] Thành phần hóa học a Alkaloid Alkaloid nhóm chức lớn thường gặp thực vật Các alkaloid thông thường dẫn xuất axid amin phần nhiều số chúng có vị đắng Là hợp chất có chứa nito, đa số có nhân dị vịng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật đơi có động vật, thường có dược tính mạnh cho phản ứng hóa học với số thước thử chung alkaloid Công dụng alkaloid đa dạng phong phú, tùy theo loại mà tác dụng lên hệ thần kinh (strychnine, caffeine, morphin Codeine,… ), hạ huyết áp (reserpine, serpentin), chống ung thư (taxol, vinblastine, vincristine), diệt kí sinh trùng, diệt khuẩn (quinine, berberine, arecoline, emetine),… Từ phần chiết mẫu Ngũ trảo phân lập alkaloid bao gồm: luteolin (1), Isoorientin (2), casticin (3),acubin (4) (1) (2) (3) (4) b Flavonoid Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Các dẫn chất flavonoid có khả dập tắt gốc tự HO-, ROO- Các gốc tự cạnh tranh với DNA gây ảnh hưởng nguy hại gây biến dị , hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh lão hóa Flavonoid với acid ascorbic tham gia vào trình hoạt động enzyme oxy-hóa khử Flavonoid cịn ức chế tác động hyaluronidase Flavonoid thể tác dụng chống co thắt tổ chức nhẵn; tác dụng chống viêm; dùng để điều trị ban đỏ, viêm da, viêm gan, xơ gan, tổn thương da màng trường hợp xạ trị Một số flavonoid rutin, quercetin, myricetin, catechin có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tăng thẻ tích phút tim Trên hệ thần kinh, số C-flavon glycoside có tác dụng an thần Các flavonoid chiết xuất từ Ngũ trảo là: 5,6,7,8,3’,4’,5’- heptamethoxyflavon (5), 5-hydroxyl-6,7,8,3’-pentamethoxyflavon (6), 5-hydroxyl6,7,8,3’,4’,5’-hexamethoxyflavon (7); 5-hydroxy-6,7,8,4’-tetramethoxyflavon (8); 5hydroxyl-7,3’,4’,5’-tetramethoxyflavon (9)… (5) (6) (7) (8) (9) 3.3 Iridoid Một lượng lớn iridoid phân lập từ Ngũ trảo, thành phần iridoid glycoside, có vị đắng có hoạt tính chống nấm, hoạt động ức chế sinh trưởng chống lại côn trùng năm số phân lập xác định cấu trúc aucubin (10), agnuside (11), negundoside (12), 6’-p-hydroxybenzoyl axit mussaenosidic (13) nishindmal [10,11] (10) (11) (12) (13) Các nghiên cứu liên quan đến Ngũ trảo - Theo Nghiên cứu Sanjay M Jachak cộng năm 2013 định lượng hàm lượng Negundoside ba mẫu Ngũ trảo thu hái ba vùng khác Ấn Độ phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng Negundoside (0,32-0,76%) lá.[12] Một nghiên cứu khác nhóm tác giả người Ấn Độ năm 2016 xác định  Giới hạn phát giới hạn định lượng - Giới hạn phát (LOD) LOD xem nồng độ thấp (xL) chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu Giới hạn phát hiện: Sb độ lệch chuẩn tín hiệu mẫu trắng; k đại lượng số học chọn theo độ tin cậy mong muốn Trong trường hợp khơng phân tích mẫu trắng xem độ lệch chuẩn mẫu trắng Sb sai số phương trình hồi quy, tức Sb = Sy tín hiệu phân tích mẫu yb = a Khi đó, tín hiệu thu ứng với nồng độ phát YLOD = a + k.Sy Với độ tin cậy 95%, k = Sau dùng phương trình hồi quy tìm LOD - Giới hạn định lượng (LOQ): LOQ xem nồng độ thấp (xQ) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu Cơng thức tính giới hạn định lượng: LOQ = 3.33 LOD 1.3.8 Cách đánh giá pic - Cách đánh giá diện tích pic: Diện tích chất tương ứng với tổng lượng chất Để tính diện tích pic, người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0.5%) máy phân tích học (sai số 1.3%) Phương pháp dùng cho pic khơng bị trơi đường pic có đường trơi Phương pháp cần điểm đầu, điểm cuối pic nhận xác cho kết tốt với nồng độ vừa, trung bình cao - Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng khơng đổi chiều cao pic (khoảng cách đường đỉnh pic) đại lượng tỉ lệ với diện tích pic dùng để đánh giá phổ Phương pháp áp dụng số k’ định - Với pic có đường bị nhiễu bị hẹp việc xác định chiều cao pic dễ dàng xác việc xác định diện tích pic 1.4 Một số phương pháp định lượng negundoside HPLC PHẦN II: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị Đối tượng nghiên cứu: Ngũ trảo Hóa chất: - Chất chuẩn Negundoside tinh khiết (≥ 98%) - Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu cao (MeOH, acid acetic) Trung Quốc - Nước cất sử dụng nước cất lần deion hóa lọc Dụng cụ: - Bình định mức: 10.00ml; 25.00ml; 50.00ml (Merck) Pipet: 1.00ml; 2.00ml; 3.00ml; 5.00ml Bình nón, cốc cân Màng lọc 0.45µm Ống đong, giấy lọc Bộ chiết soxhlet Thiết bị: - Máy HPLC (….), gồm: bơm, tiêm mẫu tự động, detector UV-VIS, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh số liệu máy HPLC - Cân phân tích Precisab XT 220A, độ xác 0.0001g Cân kỹ thuật - Máy siêu âm, có gia nhiệt 23 ang Power Sonic 405; máy cô quay, tủ sấy, bếp đun cách thủy 2.2 Nội dung nghiên cứu Xây dựng phương pháp định lượng Negundoside dược liệu phương pháp HPLC-UV Định lượng hàm lượng Negundoside dược liệu Trong đó:      HL (%) hàm lượng % Negundoside mẫu X nồng độ Negundoside tính theo đường chuẩn (ppm) m khối lượng dược liệu A hàm lượng độ ẩm (%) D độ pha loãng 2.3 Cách pha dung dịch chuẩn dung dịch pha động Dung dịch chuẩn Negundoside 620 ppm: Cân xác 0.0062g chất chuẩn Negundoside vào bình định mức 10ml cân phân tích, thêm MeOH lắc cho tan chất chuẩn Negundoside, sau thêm MeOH đến vạch định mức, lắc siêu âm khoảng phút Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ pha lỗng từ dung dịch chuẩn gốc MeOH Kênh A: Hút 0.5ml acid acetic vào bình định mức 500ml, định mức nước cất lần đến vạch, lắc siêu âm khoảng phút Kênh B: MeOH sử dụng HPLC 2.4 Phương pháp nghiên cứu Các mẫu dược liệu định lượng thể cụ thể thời gian địa điểm lấy mẫu theo bảng sau: STT Tên khoa học Tên thường Bộ phận Địa điểm lấy Thời gian mẫu Xử lý mẫu: Ngũ trảo sau thu hái xác định tên khoa học, rửa sạch, sấy khơ sau xay nhỏ đến kích thước 0.5 – mm Xác định độ ẩm nguyên liệu Lấy 2.0015g mẫu cho vào bình chiết soxhlet hồi lưu với dung môi khác Lọc dịch lọc, cạn bớt sau hịa dịch chiết MeOH lọc qua màng lọc 0.45µm tiêm vào hệ thống sắc ký Phương pháp phân tích HPLC:    Máy sắc ký Shimazud LC20 Cột phân tích: Luna C18 (250mm ì 4.6mm, 5àm) Detector UV-VIS Kho sỏt cỏc ảnh hưởng đến phương pháp phân tích 2.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê Một số đặc trưng thống kê sử dụng: - Giá trị trung bình: - Độ lệch chuẩn: - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): - Sai số chuẩn: - Sai số tương đối: - Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx tn(n-1) 100 Trong đó: xi kết xác định lần thứ nhất; n số lần xác định + Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ xác hay độ lặp lại phương pháp thí nghiệm khác nhau: Ftn= ; S1 ˃ S2  Ftn ˃ Flt: độ xác hay độ lặp lại hai phương pháp khác có ý nghĩa thống kê  Ftn ˂ Flt: độ xác hay độ lặp lại hai phương pháp khác khơng có ý nghĩa thống kê  Flt tra bảng mức độ tin cậy 95% bậc tự K=n-1 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát phương pháp chiết 3.2 Khảo sát dung mơi chiết 3.3 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.3.1 Xác định bước song phát chất phân tích với detector UV-VIS Negundoside chất có tính hấp phụ quang tốt vùng UV Từ đó, chúng tơi chọn phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS để định lượng hàm lượng Negundoside Trong trình nghiên cứu, kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng dải bước song từ 200 đến 400nm máy quang phổ UV-VIS Negundoside pha dung môi Methanol với nồng độ 327ppm Mẫu trắng Methanol Kết biểu diễn: Nhận xét: Quan sát phổ UV-VIS Negundoside bước sóng hấp thụ cực đại Negundoside 254nm Do đó, để tăng độ nhạy phương pháp nên chọn bước sóng hấp phụ cực đại làm bước sóng xác định chất phương pháp HPLC cường độ hấp phụ quang bước sóng lớn Từ đó, chúng tơi lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại 254nm để thực tiếp khảo sát 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu bơm vào cột 3.3.3 Khảo sát thành phần pha động Khảo sát pha động ảnh hưởng lớn đến hiệu tách chất Pha động ảnh hưởng tới vấn đề sau phép tách sắc ký:      Độ chọn lọc hệ pha Thời gian lưu chất tan Hiệu lực cột tách (đại lượng Nef) Độ phân giải chất pha tĩnh Độ rộng pic sắc ký 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ pha động Tốc độ pha động ảnh hưởng đến hiệu tách sắc ký liên quan đến trình thiết lập cân chất tan pha tĩnh pha động Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích muộn, gây doãng pic, giảm độ nhạy Khi tốc độ pha động q lớn, làm cho chất phân tích chưa tách khỏi bị đẩy khỏi cột dẫn đến tượng chồng pic, gây áp suất lớn bơm tốn dung môi Chúng khảo sát tốc độ pha động từ 0.6 ÷ 1.2 ml/phút Bảng ; Ảnh hưởng tốc độ pha động đến thời gian lưu diện tích pic Tốc độ dịng (ml/phút) 0.6 1.2 Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAu) Kết thu cho thấy, tăng tốc độ dịng thời gian lưu giảm dần Tốc độ pha động 0.6 ml/phút thời gian lưu dài dẫn đến tượng dỗng pic, pic bị dính chân chồng pic Khi tốc độ pha động 1.2 ml/phút thời gian lưu ngắn, bị dâng, độ phân giải (R˂1) Còn tốc độ pha động ml/phút pic tách đẹp, cân đối, độ phân giải cao (R>1.5), thời gian lưu vừa phải Do đó, chúng tơi chọn tốc độ pha động ml/phút cho q trình phân tích Tóm lại: Điều kiện tối ưu trình tách hệ thống HPLC với mẫu Ngũ trảo sau:        Cột tách: Cột Vertisep C18 (250mm ì 4.6mm; 5àm) Detector: UV-VIS Bc súng hấp thụ: 254nm Nhiệt độ cột: 30ºC Tốc độ dòng: 1ml/phút Pha động: Thể tích bơm mẫu: 20µl 3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống Độ thích hợp hệ thống xác định từ lần bơm mẫu lặp lại dung dịch chuẩn có nồng độ 372ppm Kết phân tích độ thích hợp hệ thống thơng qua hệ số phân giải hệ số bất đối xứng tính tốn trình bày bảng … STT Trung bình Áp dụng cơng thức: tR (phút) 15.401 15,283 15.272 15.272 15.292 15.293 15.302 S (mV, min) 16836800 16885894 17008497 17067780 17310492 17479281 17098124 Từ công thức trên, suy RSD(%)= 1.46% ˂ 2% Vì vậy, kết thí nghiệm cho thấy độ phân giải hệ số đối xứng peak đáp ứng yêu cầu cho phép định lượng 3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp Hiệu suất thu hồi phương pháp xử lý mẫu lượng quan trọng để đánh giá hiệu phương pháp Nó cho biết lượng chất bị trình xử lý mẫu Đánh giá hiệu suất thu hồi đánh giá độ tin cậy phương pháp, sử dụng phương pháp thêm chuẩn Các chất chuẩn thêm vào mẫu thực mẫu dược liệu… Quá trình đánh giá tiến hành hai mức thêm chuẩn khác nhau: - Mức 1: Không thêm chuẩn vào 2.0015g mẫu thực Mức 2: Thêm 0.0066g mẫu chuẩn vào 2.0015g mẫu thực Kết thu được trình bày bảng sau: Mức Mức Nồng độ (ppm) Nồng độ thu hồi (ppm) Hiệu suất thu hồi (%) Kết thu hồi Negundoside cao, hiệu suất trung bình % Vì vậy, kết luận phương pháp xử lý mẫu đáng tin cậy 3.4.3 Khảo sát độ tuyến tính xây dựng đường chuẩn Negundoside Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn pha vào hệ thống sắc ký theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao, nồng độ tiêm lặp lại lần STT Nồng độ (ppm) 14.88 74.4 124 186 372 620 Diện tích Peak trung bình (mV, min) 496173.5 3406485 5754643 8470962 16836800 28713050 35000000 30000000 f(x) = 46305.48x - 124295.19 R² = 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 100 200 300 400 500 Phương trình đường chuẩn (y=ax+b): y= 46305x-12429 Hệ số tương quan: R2=0.999 600 700 Độ dốc phương trình quy hồi: b=46305  Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Pha dung dịch chuẩn 14.88ppm, sau pha lỗng đến dung dịch chuẩn khơng có đáp ứng Tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký lựa chọn, nồng độ 4.464ppm khơng có peak đáp ứng nên nồng độ 1.488ppm coi giới hạn phát LOD phương pháp Nồng độ (ppm) Diện tích pic 4.464 147489 2.976 110846 1.488 59027 (mV.min) Như vậy, giới hạn định lượng LOQ=3.33 × 1.488=4.955 (ppm) Vì vậy, giới hạn phát giới hạn định lượng trên, xử lý mẫu thực cần pha loãng cho phù hợp để q trình tính tốn kết phù hợp  Đánh giá phương trình đường chuẩn 3.5 Phân tích mẫu thực tế CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại sử dụng rộng rãi phân tích kiểm nghiệm dược phẩm Ưu điểm chung phương pháp HPLC có ổn định độ chọn lọc, tiến hành nhanh chóng áp dụng để định tính định lượng hoạt chất mà không cần phải tách chiết riêng biệt Trên sở tham khảo số tài liệu , khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp để định tính định lượng Negundoside Ngũ trảo Từ kết thực nghiệm thu được, đạt mục tiêu đề xây dựng phương pháp HPLC định tính định lượng Negundoside Ngũ trảo đủ tin cậy, nhanh chóng thuận tiện Các kết thu sau: Khảo sát điều kiện tách sắc ký thu điều kiện tách sau:  Cột tỏch: Ct Vertisep C18 (250mm ì 4.6mm; 5àm) Detector: UV-VIS  Bước sóng hấp thụ: 254nm  Nhiệt độ cột: 30ºC  Tốc độ dòng: 1ml/phút  Pha động:  Thể tích bơm mẫu: 20µl Khoảng tuyến tính từ 14.88 ÷ 620ppm với LOD= 1.488ppm Độ lặp lại thiết bị phương pháp RSD < 2% Đánh giá độ thu hồi phương pháp …% Khảo sát quy trình xử lý mẫu Kết phân tích mẫu Ngũ trảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Võ Văn Chi “ Từ điển thuốc Việt Nam” Nhà xuất Y học 1999, tr 564-565 [2] Banerji, A., Chadha, M.S and Malshet, V.G (1969) “Isolation of 5-hydroxy3,6,7,3’,4’pentamethoxyflavone from Vitex negundo”, Phytochemistry.8, 511-512 [3] Sehgal, C.K., Taneja, S.C., Dhar, K.L and Atal, C.K (1982) “2’-p-hydroxybenzoyl mussaenosidic acid, a new iridoid glucoside from Vitex negundo”, Phytochemistry 21, 363-366 [4] Sehgal, C.K., Taneja, S.C., Dhar, K.L and Atal, C.K (1983) “6’-p-hydroxybenzoyl mussaenosidic acid, an iridoid glucoside from Vitex negundo”, Phytochemistry 22, 10361038 [5] Achari, B., Chowdhuri, U.S., Dutta, P.K and Pakrashi, S.C (1984) “Two isomeric flavones from Vitex negundo”,Phytochemistry 23, 703-704 [6] Singh, V., Dayal, R and Bartley, J (1999) “Volatile constituents of Vitex negundo leaves”, Planta medica 65, 580 [7] Chandramu, C., Rao, D.M., Krupanandam, D.G.L and Reddy, D.V (2003) “Isolation, characterization and biological activity of betulinic acid and ursolic acid from Vitex negundo L.”,PhytotherapyResearch.17,129-134 [8] Surveswaran, S., Cai, Y., Corke, H and Sun, M (2007) “Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants”, Food Chemistry 102, 938-953 [9] Khare, C.P (2004) Encyclopedia of Indian Medicinal Plants, Springer, Berlin, 2004 [10] 16 Sehgal CK, Taneja SC, Dhar KL, Atal CK (1982) 2’-p- Hydroxybenzoylmussaenosidic Acid, a new iridoid glucoside from Vitex negundo Phytochemistry 21: 363-366 [11] Datta PK, Chowdhury US (1983) Studies on indian medicinal plants-part LXXV Nishindaside, a novel iridoid glycoside from Vitex negundo Tetrahedron 39: 3067-3072 [12] Sanjay M Jachak et.al Analysis of flavonoids and Iridoids in Vitex negundo by HPLC-PDA and method validation, 2013, NPC, Vol.8, No.9 1241-1244 [13] Rattan L Sharma et.al (2010); A new iridoid glycoside from Vitex negundo Linn (Verbenacea), Natutal product research formerly natural product letters [14] Neelam Shanmaa et al (2016); Protective effect of a Standardized fraction from Vitex negundo Linn.Against acetaminophen and Galactosamine Induced Hepatotoxicity in Rodents; Biochem Anal biochem [15] Sanjay M.Jachak et al (2013); Analysis of flavonoids and iridoids in vitex negundo Linn by HPLC-PDA and method validation, Vol.8, No.9, 1241-1244 [16]R.Sundaram et al (2012):”Antihyperglycemic effect of iridoid glucoside, isolated from the leaves of Vitex negundo in streptozotocin-induced diabetic rats with special reference to glycoprotein components.” Phytomedicine 19, 211-216 [17] Vishnoi, S.P., Shoeb, A., Kapil, R.S and Popli, S.P (1983) “A furanoeremophilane from Vitexnegundo”,Phytochemistry.22,597-598 [18] 20Tandon, V.R and Gupta, R.K (2006) “Anti-inflammatory Activity and Mechanism of Action of Vitex negundo Linn.” International Journal of Pharmacology, 2, 303 - 308 [19] Telang, R.S., Chatterjee, S and Varshneya, C (1999) “Studies on analgesic and anti-inflammatory activities of Vitex negundo Linn” Indian journal of pharmacology, 31, 363 - 366 [20] Khổng Thanh, Trần Quân (2011) “Nghiên cứu tác dụng kháng viêm giảm đau chiết xuất từ phận khác từ Hồng Kinh Ethylacetate (CH3COOC2H5)” Tạp chí Quốc y quốc dược Thời Trân, kỳ 4, 285 [21] M.G Dharmasiri, J.R.A.C Jayakody, G Galhena, S.S.P Liyanage, W.D Ratnasooriya, (2003) mature leaves fresh “Anti of - Vitex inflammatory negundo.” and Journal analgesic of activities of Ethnopharmacology, 87 (2 - 3), 199 - 206 [22] Khổng Tĩnh, Phùng Học, Trần Quân, Bùi Thế Thành (2010) “Nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau rễ Hồng Kinh” Tạp chí Trung y dược Nội Mông, 34 - 35 149 [23].Triệu Sương Sương (2013) “Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm khớp dạng thấp hoạt chất triết xuất từ hạt hoàng kinh,” Luận văn cao học, Đại học Sư phạm Hoa Đông [24] Anjall Pandey et.al (2012), Anti-arthritic activity of agnuside mediated through the down-regulation of inflammatory mediators and cytokines, original research paper [26] James A Duke, Mary Jo Bogenschutz- Godwin, Judi duCellier, PeggyAnn k.Duke (2002) Handbook of Medicinal Herbs, Crc press, 303 [27] Lã Nguyên Linh, Vương Hồng Tân (2002) “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết Hồng Kinh.” Tạp chí Chất phụ gia thực phẩm Trung Quốc, kỳ 3, 36 [28] Viện Dược liệu (2006) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Tập I, Tập II [29] Vishal R Tandon, V Khajuria, B Kapoor, D Kour, S Gup (2008) “Hepatoprotective activity of Vitex negundo leaf extract against antitubercular drugs induced hepatotoxicity” Fitoterapia, 79 (7), 533 - 538 [30] Thanh Sơn (2011) “Thành phần hoạt chất hịa tan mỡ hạt Hồng Kinh tác dụng chống ung thư”, Luận văn cao học, Đại học Trung Nam [31] Hàn Gia Khải, Tiêu Đông Hiểu, Tào Kiến Quốc, Phong Bình, Lưu Tân Phúc (2008) “Nghiên cứu tác dụng triết xuất từ hạt Hoàng Kinh tế bào ung thư dày SGC-7901” Tạp chí Dược lý học Trung Quốc [32] Diaz F Chavez D, Lee D, et al “Cytotoxic Flavone Analouges of Vitexicarpin, a constituent of the leaves of Vitex negundo” Journal of Natural Product 2003; 66(6):865867 [33].Om Prakash Tiwari, Yamini B Tripathi (2007) “Antioxidant properties of different fractions of Vitex negundo Linn.” Food Chemistry, 100(3), 1170 – 1176 [34] Devani, U., Pandita, N and Kachwala, Y (2013) “Evaluation of Inhibitory Activity of Vitex nigundo and Terminaliachebula by Alpha Amylase Inhibition Assay in Management of Diabetes” Asian Journal of Plant Science and Research, 3, 6-14 [35] Liu, C., Tseng, A and Yang, S (2005) Chinese herbal medicine: Modern applications of traditionalformulas, CRC Press, 2005 [36] Joshi, A.R and Joshi, K (2000) “Indigenous knowledge and uses of medicinal plants by local communities of the Kali Gandaki watershed area, Nepal”, Journal of Ethnopharmacology.73,175-183 [37] Hamayun, M (2005) “Ethnobotanical studies of some useful shrubs and trees of district Buner, NWFP, Pakistan”, Ethnobotanical Leaflets.9 [38] Graham, J.G., Quinn, M.L., Fabricant, D.S and Farnsworth, N.R (2000) “Plants used against cancer–an extension of the work of Jonathan Hartwell”, Journal of Ethnopharmacology 73, 347-377 [39] Shah, G.M and Khan, M.A (2006) “Common medicinal folk recipes of Siran Valley, Mansehra, Pakistan”, Ethnobotanical Leaflets 10, 49-62 [40] Nguyễn Thị Thanh Tú “Nghiên cứu tinh an toàn tác dụng viên nang cứng Hoàng kinh điều trị viêm khớp dạng thấp”, luận án tiến sỹ y học, năm 2015, Trường đại học Y Hà Nội [41] Nguyễn Tiến Tiệp “Nghiên cứu thành phần hóa học độc tính dược liệu Hoàng kinh (Vitex negundo L.)”, Luận văn thạc sỹ , Đại học Dược Hà Nội, 2013 ... tín hiệu Sắc ký lỏng hiệu cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký trao đổi ion, sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản, sắc ký phân bố lỏng- lỏng, sắc ký. .. hoa ngũ trảo - Khảo sát quy trình xử lý mẫu - Xác định hàm lượng Negundoside Ngũ trảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc Giới thiệu Cây Ngũ trảo (còn gọi Ngũ. .. Đã có nhiều nghiên cứu giới phương pháp định lượng hàm lượng Negundoside dược liệu Ngũ trảo - Theo Snjay M.Jachak cộng đưa phương pháp phân tích định lượng flavonoid iridoid mẫu Ngũ trảo thu hái