Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5 mg đã được khoa dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” đã được thực hiện.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLONIDIN TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Dạng thuốc dán hấp thu qua da với dược chất clonidin phát triển với tên thương mại Catapres Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin có Dược điển Mỹ Trên giới có vài cơng trình cơng bố qui trình định lượng clonidin phóng thích từ thuốc dán Catapres huyết tương thỏ phương pháp LC-MS Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 7,5 mg Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công Bước đề tài tiến hành xác định sinh khả dụng thuốc Vì đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ phương pháp HPLC với đầu dò PDA” thực Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn phương pháp tủa protein chiết pha rắn Thăm dò điều kiện sắc ký pha động: khơng có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào tác nhân tạo cặp ion Kết quả: Đã xác định điều kiện thích hợp để chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn với hiệu suất chiết khoảng 70% có độ lặp lại cao Đã xác định điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng clonidin huyết tương thỏ Qui trình định lượng thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn FDA Hoa Kỳ Cuối cùng, qui trình ứng dụng để định lượng clonidin số mẫu huyết tương thỏ sau dán thuốc thử nghiệm Kết luận: Đề tài xây dựng thành cơng qui trình HPLC-PDA định lượng clonidin huyết tương thỏ Qui trình tiếp tục ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng in vivo thuốc huyết tương thỏ Từ khóa: Clonidin, huyết tương thỏ, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDINE IN RABBIT PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Truong Quoc Ky, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 14 - 20 Introduction - Aims: Transdermal patches containing clonidine have been launched into global market under trade name Catapres–TTS (Transdermal Therapeutic System) for a long time So far, there’s only TTS monograph clonidine in USP Liquid chromatography coupled with mass spectrometry has recently been applied for measurement of clonidine in rabbit plasma In Vietnam, transdermal therapeutic system of clonidine 2.5 mg and 7.5 mg has been successfully prepared by Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City Therefore, the aim of this study was to develop a simple HPLC-PDA method for quantitative determination of clonidine in rabbit plasma Subjects and Methods: Protein precipitation and solid phase extraction were applied for clonidine extraction from rabbit plasma Several chromatographic conditions such as mobile phase including buffer, without * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com 14 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học buffer, or added to one ion pair agent, were investigated Results: The protein precipitation was successfully applied for clonidine extraction from rabbit plasma with recovery of 70% and high repeatability The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of clonidine from rabbit plasma The liquid chromatographic method was validated and satisfied all requirements under the guidance of US FDA Finally, the validated method could be a reliable statement concerning quantitative determination of clonidine in rabbit plasma Conclusion: A simple HPLC-PDA method was successfully developed for quantitative determination of clonidine in rabbit plasma The method can be further applied for clonidine quantitation in in vivo bioavailability study of transdermal patches Key words: Clonidine, rabbit plasma, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Dạng thuốc dán hấp thu qua da (Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày quan tâm phát triển rộng rãi có nhiều ưu điểm so với thuốc viên Thuốc dán điều trị tăng huyết áp đời chế phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin có Dược điển Mỹ(3) Trên giới có cơng trình cơng bố qui trình định lượng clonidin phóng thích từ thuốc dán Catapres huyết tương thỏ phương pháp LC-MS(2) Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 7,5mg Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành cơng Bước đề tài tiến hành xác định sinh khả dụng thuốc Vì đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA” thực Hóa chất, dung môi Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng (Merck) Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 Cân phân tích Sartorius CP 224D Máy đo pH Metrohm 744 Bể siêu âm Elma Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện sắc ký Clonidin chất có tính base, phân cực nên kỹ thuật sắc ký pha đảo lựa chọn Qua tham khảo tài liệu(3,2,1) định lượng clonidin huyết tương, điều kiện sắc ký ban đầu đề nghị sau: Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; µm) Tốc độ dòng: ml/phút ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đầu dò PDA: bước sóng phát 210 nm Đối tượng nghiên cứu Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Thuốc dán Clonidin 2,5 mg 7,5 mg Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Chất đối chiếu thuốc đối chiếu Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng 04/2014 Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 7,5 mg/10,5 cm2, hạn dùng tháng 05/2013 công ty Boehringer Ingelhem, Đức Chuyên Đề Dược Học Pha động A (không có dung dịch đệm): methanol – nước (40:60) điều chỉnh đến pH acid phosphoric Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH KOH 30% Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21 g 15 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 natri 1-heptansulfonat ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH KOH 30% Khảo sát hệ pha động để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thoả mãn yêu cầu sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác (nếu có) có hệ số đối xứng nằm khoảng 0,8 – 1,5 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân xác 11,8 mg clonidin HCl chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan bổ sung dung dịch KOH 0,0025% đến vạch, lắc Dung dịch sau pha bảo quản – 4oC Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước để dung dịch chuẩn nồng độ từ – 13 µg/ml Tủa protein huyết tương dung môi hữu Trước tiên, chọn phương pháp tủa protein để xử lý mẫu phương pháp đơn giản, khơng đòi hỏi trang thiết bị đại, thời gian xử lý nhanh Do clonidin tan tốt methanol nên dung môi lựa chọn để tủa protein Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung mơi/huyết tương để tủa hồn tồn protein Áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) Dựa theo tài liệu tham khảo(2), dùng cột SPE nhồi sẵn 500 mg silicagel C18, thể tích ml Hoạt hóa cột ml methanol, ml nước Cho 0,04 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,36 ml huyết tương trắng, lắc rung phút Cho qua cột SPE, để yên phút Rửa cột với ml nước ml methanol 5% Rửa giải cột với 0,8 ml methanol Tủa protein huyết tương acid percloric Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung phút Thêm tiếp 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung phút Tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung phút Ly tâm 14000 vòng/phút 10 phút 16 Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn US FDA(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ xác, độ đúng, tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết), giới hạn định lượng (LLOQ), độ ổn định Ứng dụng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ Thử nghiệm thuốc dán chứa clonidin 7,5 mg/17,28 cm2 Khoa Dược, ĐHYD Tp HCM bào chế thuốc dán đối chiếu Catapres – TTS chứa clonidin 7,5 mg/10,5 cm2 Mỗi loại thuốc dán thử nghiệm thỏ Lấy miếng thuốc dán dán lên vùng thử nghiệm da thỏ Lấy ml máu thỏ qua tĩnh mạch vành tai thỏ vào thời điểm 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 78 Mẫu máu đem ly tâm, xử lý tiến hành định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký Kết khảo sát điều kiện sắc ký thể qua hình Với pha động A, pic clonidin xuất sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58 phút bị kéo Pha động C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 11,4 – 12,8 phút, pic clonidin tách hồn tồn pic tạp có hệ số đối xứng nằm khoảng 0,8 – 1,5 Vì pha động C lựa chọn Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương Phương pháp kết tủa protein huyết tương dung mơi hữu có ưu điểm xử lý mẫu nhanh, sau tuần khảo sát, tỷ lệ methanol/ huyết tương để tủa hoàn toàn protein 3:1 Tuy nhiên nồng độ clonidin bị loãng đi, lẫn nhiều tạp chất tiến hành sắc ký pic clonidin khơng tách khỏi hồn tồn pic tạp (hình 2) Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học (a) (b) (c) (d) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C mẫu huyết tương trắng thêm dung dịch chuẩn: (d) với pha động C Phương pháp chiết pha rắn có thời gian xử lý mẫu lâu hơn, sau tiến hành sắc ký thấy nhiều tạp pic clonidin lẫn với pic tạp khác (hình 3) Phương pháp tủa protein với acid percloric dù nhiều tạp pic clonidin tách hồn tồn khỏi pic tạp phát với nồng độ mẫu thấp (hình 1d) Clonidin HCl Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn xử lý cách tủa protein với methanol Clonidin HCl Hình 3: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn xử lý phương pháp chiết pha rắn Do phương pháp xử lý mẫu huyết tương acid percloric lựa chọn Chuyên Đề Dược Học Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Kết phân tích lặp lại lần mẫu huyết tương thêm chuẩn clonidin trình bày bảng Bảng 1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6) Diện tích Thời gian Hệ số lưu đối xứng pic (µAu x giây) (As) (phút) TB 334818 12,014 1,2 RSD 1,03% 0,27% 0,87% Số đĩa lý Độ phân thuyết giải (Rs) (N) 26891 4,25 1,92% 0,92% Nhận xét: RSD thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý thuyết, độ phân giải có RSD < 2%, chứng tỏ qui trình có tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu huyết tương thêm chuẩn mẫu huyết tương trắng theo điều kiện sắc ký chọn Kết cho thấy: phổ UV-Vis thời gian lưu pic clonidin mẫu huyết tương thêm chuẩn mẫu chuẩn giống (hình 4), thời gian lưu pic mẫu huyết tương thêm chuẩn (hình 1d) tương đương với thời gian lưu pic clonidin mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu huyết tương trắng (hình 5) khơng có pic trùng với pic 17 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 clonidin, sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic cho thấy pic clonidin mẫu huyết tương thêm chuẩn tinh khiết (hình 6) Do (a) đó, khẳng định qui trình phân tích có tính đặc hiệu (b) Hình 4: Phổ UV-Vis thời gian lưu pic clonidin mẫu chuẩn (a) mẫu huyết tương thêm chuẩn (b) Hình 5: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 6: Đồ thị minh họa độ tinh khiết pic clonidin HCl mẫu huyết tương thêm chuẩn Khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ xác, độ đúng, hiệu suất chiết, độ ổn định Bảng 2: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ xác, độ đúng, hiệu suất chiết độ ổn định Chỉ tiêu thẩm định Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính (ng/ml) Giới hạn định lượng (ng/ml) Hiệu suất chiết* Độ xác ngày khác ngày* (RSD, n= 18) Độ ngày khác ngày* (tỷ lệ hồi phục, n=18) Độ ổn định* Clonidin HCl Ŷ = 472,9X; R = 0,9999 45 – 800 45 73,1% - 77,0% ; RSD = 0,65% - 5,20% 2,42% - 18,25% 92,80% - 115,85% Dung dịch chuẩn gốc ổn định sau ngày bảo quản – o C Mẫu huyết tương chứa clonidin bảo quản nhiệt o độ phòng 24 giờ, bảo quản -70 C khoảng tháng, ổn định sau chu kỳ đông, rã đông sau xử lý mẫu 12 tiếng nhiệt độ phòng * Được thực nồng độ khác 45 ng/ml, 400 ng/ml 800 ng/ml Nhận xét: Bằng kết thực nghiệm thu được, phương pháp định lượng clonidin huyết tương thỏ đạt u cầu thẩm định quy trình phân tích thuốc dịch sinh học tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, hiệu suất chiết, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ độ xác, độ ổn định theo hướng dẫn FDA Hoa Kỳ(4) 18 Tóm tắt qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân xác 11,8 mg chuẩn clonidin HCl, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan bổ sung dung dịch KOH 0,0025% (g/ml) đến vạch, lắc Pha loãng dung dịch thu với nước để thu dung dịch chuẩn mức Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 nồng độ cho nồng độ clonidin sau xử lý mẫu huyết tương 45 ng/ml, 400 ng/ml 800 ng/ml Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung (vortex) phút, thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung phút, tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung phút Ly tâm 14000 vòng/phút 10 phút, lọc dịch qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký Chuẩn bị mẫu thử Lấy 0,5 ml huyết tương thỏ, thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung phút, thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung phút Nghiên cứu Y học Ly tâm 14000 vòng/phút 10 phút, lọc dịch qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký Điều kiện sắc ký Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; µm) Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 260C Pha động: hòa tan 1,21 g natri heptansulfonat 600 ml nước, thêm 400 ml methanol ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH = dung dịch KOH 30% Tốc độ dòng: ml/ phút Đầu dò PDA: bước sóng phát 210 nm Thể tích tiêm mẫu: 100 µl Nờng đợ clonidin (ng/ml) Ứng dụng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ Thời gian (Giờ) Hình 7: Đồ thị biểu diễn thay đổi nồng độ clonidin huyết tương thỏ theo thời gian sau dán thuốc dán clonidin 7,5 mg thuốc dán Catapres 7,5 mg ứng dụng cho nghiên cứu sinh khả Nhận xét: dụng thỏ Thuốc dán Catapres 7,5 mg clonidin 7,5 mg có nồng độ nồng độ clonidin cực đại huyết tương thỏ tương đương sau dán thuốc 36 Không phát clonidin sau dán thuốc (0 giờ) nồng độ clonidin huyết tương thỏ nhỏ giới hạn định lượng sau dán thuốc 6, 60, 72 78 Phương pháp HPLC-PDA có độ nhạy khơng phương pháp LC-MS/MS giá trị giới hạn định lượng chấp nhận để định lượng hoạt chất huyết tương Các kết định lượng ban đầu cho thấy qui trình Chun Đề Dược Học KẾT LUẬN Đề tài xây dựng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ phương pháp HPLC với đầu dò PDA Qui trình định lượng clonidin thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ xác, độ đúng, tỷ lệ hồi phục độ ổn định Qui trình ứng dụng để định lượng clonidin huyết tương thỏ sau dán thuốc thử nghiệm tiếp tục ứng dụng để 19 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 đánh giá sinh khả dụng in vivo thuốc huyết tương thỏ TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 Chux LC, Bayne WF, Tao FT, Schmitt LG, Shaw JE (1979) Determination of submicrogram quantities of clonidin in biological fluids, Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(1), 72-74 Mote M, Inamdar S, Ghosh C, Chakraborty B (2009) A sensitive, selective, precise and accurate LC-MS method for determination of clonidine in human plasma, Chromatography, 69, 11-12 United States Pharmacopoeia 32, NF27 (2009) The United States Pharmacopeial Convention 557-563 US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (2001) Guidance for Industry: Bioanalytical method validation, – 15 Ngày nhận báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 22.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... Chuyên Đề Dược Học KẾT LUẬN Đề tài xây dựng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ phương pháp HPLC với đầu dò PDA Qui trình định lượng clonidin thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính chọn... 72 78 Phương pháp HPLC- PDA có độ nhạy khơng phương pháp LC-MS/MS giá trị giới hạn định lượng chấp nhận để định lượng hoạt chất huyết tương Các kết định lượng ban đầu cho thấy qui trình Chuyên... tiến hành xác định sinh khả dụng thuốc Vì đề tài Xây dựng qui trình định lượng clonidin huyết tương thỏ kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò PDA thực Hóa chất, dung mơi Acid hydrocloric, acid