Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben và propyl paraben trong vỏ nang mềm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò PDA.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METHYL PARABEN VÀ PROPYL PARABEN TRONG VỎ NANG MỀM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DỊ PDA Trương Quốc Kỳ*, Võ Hồng Nam**, Nguyễn An Cơng**, Đặng Minh Đức** TĨM TẮT Mở đầu: Parabens tên gọi chung nhóm chất bảo quản sử dụng phổ biến dược phẩm mỹ phẩm Các hợp chất chủ yếu sử dụng khả diệt khuẩn diệt nấm chúng Methyl paraben propyl paraben thường sử dụng làm chất bảo quản vỏ nang mềm Trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) V khơng có quy định giới hạn vỏ viên nang mềm, USP 41 giới hạn quy định phải 120% Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben propyl paraben vỏ nang mềm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với đầu dò PDA Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Vỏ viên nang mềm có chứa đồng thời hai chất bảo quản methyl paraben propyl paraben Các chất bảo quản chiết định lượng kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò PDA Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến tách tốc độ chọn lọc phương pháp khảo sát tốc độ dòng, thành phần tỷ lệ dung môi pha động Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben propyl paraben vỏ viên nang mềm phương pháp HPLC, sử dụng cột Luna C18 (150 x 4,6 mm; µm), pha động gồm methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt), bước sóng phát 272 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút nhiệt độ cột 40 0C Kết định lượng cho thấy quy trình có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính từ 3,94 – 13,80 µg/ml cho methyl paraben từ 1,98 – 6,94 µg/ml cho propyl paraben, độ thể qua tỷ lệ phục hồi nằm khoảng 98% - 102% RSD < 2% độ xác Kết luận: Đề tài xây dựng thành công quy trình HPLC định lượng đồng thời methyl paraben propyl paraben vỏ nang mềm Quy trình áp dụng để định lượng methyl paraben propyl paraben vỏ nang mềm viên Vitar C viên Cetiboston Từ khóa: methyl paraben, propyl paraben, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), vỏ nang mềm ABSTRACT SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF METHYL PARABEN AND PROPYL PARABEN IN SOFT CAPSULE SHELL BY HPLC WITH PDA DETECTOR Truong Quoc Ky, Vo Hoang Nam, Nguyen An Cong, Dang Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019: 378-383 Background: Parabens are a class of preservatives that are widely used in cosmetic and pharmaceutical products These compounds are mainly used for their bactericidal and fungicidal properties Methyl paraben and propyl paraben are commonly used as preservatives in soft capsule shell In Vietnamese pharmacopoeia V, regulation of parabens in the soft capsule shell is not yet available In USP 41, Limited of parabens should be below 120% *Bộ mơn hóa chun ngành, Khoa Dược, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch **Công ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam Tác giả liên lạc: TS DS Trương Quốc Kỳ ĐT: 0936723672 Email: quockypharma7@gmail.com 378 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Objectives: The aim of study was to develop a HPLC-PDA method for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in soft capsule shell Methods and Subject: The subject of this study was a soft capsule shell containing methyl paraben and propyl paraben These parabens were extracted and determined by HPLC with PDA detector Several chromatographic conditions such as mobile phase and flow rate were investigated to improve the column efficiency and selectivity Results: The appropriate chromatographic condition were found out for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben, using a Luna C18 (150 × 4.6 mm; µm), mixture of methanol and phosphate buffer (55:45, tt/tt) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection wavelength of 272 nm and column temperature of 40 0C The method was shown high selectivity, wide linearity range from 3.94 – 13.80 µg/ml for methyl paraben and from 1.98 – 6.94 µg/ml for propyl paraben Intra-day standard devitation was below 2% and the recovery range was 98% - 102% Conclusion: A simple liquid chromatographic method was successfully develop for simultaneous quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule shell The validated method was applied for quantitative determination of methyl paraben and propyl paraben in the soft capsule of Vitar C and the soft capsule of Cetiboston Keyword: methyl paraben, propyl paraben, HPLC, soft capsule shell quy trình phân tích định lượng methyl ĐẶT VẤN ĐỀ paraben propyl paraben vỏ nang mềm Parabens tên gọi chung nhóm chất bảo ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU quản hóa học, sử dụng phổ biến lâu đời Đối tượng nghiên cứu Về mặt hóa học, parabens loạt este acid parahydroxybenzoic hay gọi acid 4-hydroxybenzoic Các hợp chất chủ yếu sử dụng khả diệt khuẩn diệt nấm chúng(1) hạn chế phân hủy hoạt chất dẫn đến giảm hiệu dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm Methyl paraben propyl paraben sử dụng làm chất bảo quản vỏ nang mềm Gần có nhiều nghiên cứu cho thấy, hợp chất parabens hoạt động tương tự hormone oestrogen tế bào thể Các hoạt động có liên quan định đến bệnh ung thư vú(2) Trong Dược điển Việt Nam (DĐVN) V quy định giới hạn vỏ viên nang mềm, USP 41 giới hạn quy định phải 120%(3) Vì lý trên, việc kiểm soát chất bảo quản parabens vỏ nang mềm cần thiết Đề tài thực nhằm mục đích đưa Vỏ nang mềm có chứa chất bảo quản methyl paraben propyl paraben Trang thiết bị, hóa chất, dung mơi Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-20AD với đầu PDA Máy đo pH Shott 850 Cân phân tích Sartorius BP221S Bể siêu âm Elma Và Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu xác dùng phân tích Hóa chất dung mơi Chuẩn methyl paraben (viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh) hàm lượng 99,90% propyl paraben (viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh) hàm lượng 99,90% Methanol đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký lỏng (Scharlau) Ethanol, kali dihydrophosphat, acid hydrocloric, natri hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc parabens tham khảo Dược điển Mỹ (USP 41)(3), kỹ thuật sắc ký Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 379 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 lỏng pha đảo áp dụng với pha động bao gồm dung dịch đệm phosphate methanol, sắc ký đồ ghi bước sóng 272 nm với tốc độ dòng 1,0 ml/phút với nhiệt độ cột 40 0C Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp khảo sát dung môi pha động tỉ lệ pha động khảo sát tối ưu để có hệ số bất đối As từ 0,8 – 1,5 có hệ số phân giải Rs ≥1,5 Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định theo hướng dẫn ICH(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ xác, độ Sau thẩm định, quy trình ứng dụng để định lượng số vỏ nang chế phẩm viên nang mềm thị trường có chứa chất bảo quản Mức chất lượng áp dụng theo USP 41 Chuẩn bị mẫu dung dịch đệm Dung dịch đệm Dung dịch đệm kali dihydrophosphat: cân xác khoảng 6,8 g kali dihydrophosphat hòa tan 1000 ml nước Dung dịch chuẩn hỗn hợp Lấy xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl paraben lấy xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc propyl paraben vào bình định mức 100 ml thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí Dung dịch thử Cân 20 viên, loại bỏ dịch thuốc nang, lau vỏ nang, xác định khối lượng trung bình vỏ nang mềm, cắt nhỏ vỏ nang Cân xác khoảng 240,0 mg vỏ nang mềm (tương ứng 1/2 nang) cắt nhỏ cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 30 ml nước, thêm ml acid hydrocloric đậm đặc, đun cách thủy 60 oC khoảng 15 phút, lắc, để nguội, thêm ml dung dịch natri hydroxyd M bổ sung vừa đủ đến vạch ethanol 96%, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm Mẫu trắng Chuẩn bị mẫu Dung môi pha mẫu Dung môi pha mẫu Ethanol – nước (70: 30, tt/tt) Dung dịch gốc Dung dịch chuẩn gốc methyl paraben: Cân xác khoảng 49,5 mg chuẩn methyl paraben vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Lấy xác 10,0 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch dung môi pha mẫu, lắc Dung dịch chuẩn gốc propyl paraben: Cân xác khoảng 50,0 mg chuẩn propyl paraben vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hồn tồn, để nguội thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc Lấy xác 10,0 ml 380 dung dịch vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch dung môi pha mẫu, lắc Mẫu placebo Vỏ nang khơng có chất bảo quản methyl paraben propyl paraben chuẩn bị tương tự mẫu thử KẾT QUẢ Điều kiện sắc ký Với điều kiện HPLC Pha động: methanol – dung dịch đệm kali dihydrophosphat (55:45, tt/tt) Cột sắc ký: Luna C18 (150 x 4,6 mm; μm) Nhiệt độ cột: 40 0C Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích bơm mẫu: 50 μl Bước sóng phát hiện: 272 nm Thì phù hợp cho việc định lượng đồng thời methyl paraben propyl paraben vỏ Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 nang mềm có hệ số bất đối pic nằm khoảng từ 0,8 – 1,5 có hệ số phân giải Rs ≥1,5 Kết thông số sắc ký pic ghi Bảng Bảng Các thông số sắc ký pic methyl paraben propyl paraben Thông số Chất Methyl paraben Propyl paraben Thời gian lưu (tR) (phút) 4,037 9,267 Diện tích píc (S) 614248 271694 AS Rs 1,15 3,62 1,16 10,31 Khảo sát tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ methyl paraben propyl paraben tương ứng 9,86 μg/ml 4,96 μg/ml Bảng Tính phù hợp hệ thống 0,22 0,28 RSD% số đĩa lý thuyết (N) 1,16 3,61 0,30 0,20 0,25 1,16 10,33 Thông số RSD% RSD% thời gian diện tích AS lưu (tR) píc (S) Chất Methyl paraben Propyl paraben Rs 0,72 Các số liệu thu cho thấy: RSD (%) diện tích pic methyl paraben, propyl paraben nhỏ 2,0% Hệ số bất đối pic methyl paraben, pic propyl paraben nhỏ 0,8 đến 1,5 Độ phân giải hai pic methyl paraben propyl paraben 10,33 Như điều kiện sắc ký phù hợp cho việc định tính, định lượng Nghiên cứu Y học methyl paraben propyl paraben vỏ viên nang mềm có chứa hoạt chất Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký, mẫu trắng (pha động), mẫu placebo, mẫu chuẩn mẫu thử, thu sắc ký đồ Hình Từ sắc ký đồ Hình Hình cho thấy thời điểm 4,0 phút (thời gian lưu pic methyl paraben), thời điểm 9,2 phút (thời gian lưu pic propyl paraben), mẫu trắng, mẫu placebo khơng có pic xuất hiện, mẫu chuẩn mẫu thử cho pic tách rõ ràng (có độ tinh khiết pic lớn 0,999), có thời gian lưu tương ứng Phổ UV pic sắc ký đồ thu từ dung dịch thử có cực đại hình dạng tương tự phổ UV pic sắc ký đồ thu từ dung dịch chuẩn Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính từ 40 – 140% nồng độ định lượng methyl paraben propyl paraben Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ khoảng từ 3,94 đến 13,80 g/ml cho methyl paraben từ 1,98 đến 6,94 g/ml cho propyl paraben Tiến hành sắc ký điều kiện khảo sát thu diện tích píc tương ứng với nồng độ Xử lý liệu excel 2007 cho thấy tương quan tuyến tính nồng độ diện tích đỉnh Với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999 Kết thể Bảng A B C D Hình Sắc ký đồ mẫu trắng (A), mẫu placebo (B), mẫu chuẩn (C) mẫu thử (D) Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 381 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 A B C D E F Hình Phổ UV-Vis chuẩn methyl paraben (A), chuẩn propyl paraben (B), phổ UV-Vis thử methyl paraben (C), thử propyl para (D) Phổ tính tinh khiết pic methyl paraben mẫu thử (E), pic propyl para mẫu thử (E) Quy trình đạt tính tuyến tính Methyl paraben Propyl paraben Lơ Lô Lô Lô Lô Lô Vitar C 99,6% 98,7% 99,3% 100,4% 100,1% 96.4% Cetiboston 99,8% 95,4% 101,2% 100,5% 97,3% 98,8% Độ độ xác Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ xác tính tuyến tính Tên thuốc Giá trị thống kê Methyl paraben Propyl paraben Phương trình hồi y = 61401 x + 3787 y = 54888 x – 375 2 qui R = 0,9997 R = 0,9999 Khoảng tuyến tính 3,94 -13,80 g/ml 1,98 - 6,94 g/ml Độ lặp lại (n=6) 0,81% 0,56% Độ 99,12 – 99,73% 99,12 – 99,80% Quy trình phân tích sau thẩm định ứng dụng để định lượng methyl paraben propyl paraben vỏ nang mềm chế phẩm viên nang mềm Vitar C viên nang mềm Cetiboston Mỗi chế phẩm định lượng lô pilot Theo quy định USP 41 (không 120% so với lượng dùng nang, tính theo khối lượng trung bình vỏ nang mềm) Chỉ tiêu thẩm định Độ phục hồi trung bình methyl paraben từ 99,12 – 99,73% từ 99,12 – 99,80% cho propyl paraben, độ phục hồi phương pháp nằm khoảng cho phép từ 98 – 102% có RSD ≤ 2,0%, quy trình có độ xác cao (RSD ≤ 2,0%) Từ kết Bảng ta thấy quy trình đạt độ độ xác cao Ứng dụng quy trình để định lượng có vỏ nang chứa chất bảo quản methyl paraben propyl para viên nang mềm lưu hành thị trường Bảng Kết định lượng methyl paraben propyl paraben chế phẩm 382 Kết phân tích lô ta thấy hàm lượng chất bảo quản methyl paraben propyl paraben giới hạn cho phép USP 41 chế phẩm đạt tiêu chuẩn chất bảo quản vỏ viên nang mềm BÀN LUẬN Định lượng đồng thời methyl paraben propyl paraben vỏ viên nang mềm HPLC với đầu dò PDA phương pháp xác có độ nhạy cao, khoảng xác định rộng Với phương pháp giúp cho việc kiểm soát Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học hàm lượng chất bảo quản sử dụng với mục đích diệt khuẩn diệt nấm để bảo quản vỏ nang mềm cách xác tin cậy Ngồi việc kiểm sốt hàm lượng góp phần kiểm sốt tác dụng dược lý khơng mong muốn chất bảo quản giúp bảo vệ sức khỏe người sử dụng thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Các kết thực nghiệm cho thấy phương pháp HPLC xây dựng cho phép thử định lượng methyl paraben propyl paraben vỏ nang viên nang mềm Phương pháp thẩm định có tính đặc hiệu, độ xác cao, độ tốt, đạt Khoảng tuyến tính phù hợp nồng độ định lượng thành phẩm với độ tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích pic khoảng nồng độ khảo sát Doron S, Friedman M, Falach M, Sadovnic E, Zvia H (2001) Short communication Antibacterial effect of parabens against lanktonic and biofilm Streptococcus sobrinus International Journal of Antimicrobial Agents, 18:pp.575– 578 Byford JR, Shaw LE, Drew MG, Pope GS, Sauer MJ, Darbre PD (2002) Oestrogenic activity of parabens in MCF7 human breast cancer cells Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 80:pp.49 – 60 The United States Pharmacopeial Convention (2018) The United States Pharmacopoeia 41 - National Formulary 36 (USP 41-NF 36), https://www.uspnf.com/purchase-usp-nf ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, pp.1-13 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: 31/01/2019 12/02/2019 Ngày báo đăng: 20/04/2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 383 ... Keyword: methyl paraben, propyl paraben, HPLC, soft capsule shell quy trình phân tích định lượng methyl ĐẶT VẤN ĐỀ paraben propyl paraben vỏ nang mềm Parabens tên gọi chung nhóm chất bảo ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG... – 99,80% Quy trình phân tích sau thẩm định ứng dụng để định lượng methyl paraben propyl paraben vỏ nang mềm chế phẩm viên nang mềm Vitar C viên nang mềm Cetiboston Mỗi chế phẩm định lượng lô... KẾT LUẬN Các kết thực nghiệm cho thấy phương pháp HPLC xây dựng cho phép thử định lượng methyl paraben propyl paraben vỏ nang viên nang mềm Phương pháp thẩm định có tính đặc hiệu, độ xác cao, độ