Bài viết Xây dựng quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong dầu mù u - nghệ bằng phương pháp HPLC nhắm chế phẩm dầu mù u kết hợp với nghệ (dầu mù u - nghệ) là hướng nghiên cứu kế thừa từ những dữ liệu khoa học đã được chứng minh về tác dụng tương hỗ của dầu mù u và nghệ vàng cũng như giới thiệu và tiêu chuẩn hóa dạng sản phẩm mới.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My*, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Chế phẩm Dầu Mù u kết hợp với Nghệ (Dầu Mù u – Nghệ) l| hướng nghiên cứu kế thừa từ liệu khoa học chứng minh tác dụng tương hỗ dầu Mù u Nghệ v|ng giới thiệu tiêu chuẩn hóa dạng sản phẩm Trong nghiên cứu này, khảo s{t c{c điều kiện để xây dựng thẩm định phương ph{p HPLC để định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I dầu Mù u – Nghệ Đối tượng nghiên cứu: calophyllolid curcumin I Phương pháp nghiên cứu: khảo sát quy trình xử lý mẫu v| c{c điều kiện sắc ký để xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I mẫu dầu Mù u – Nghệ phương ph{p HPLC Kết quả: Quy trình xử lý mẫu: calophyllolid curcumin mẫu thử chiết dung môi hòa tan xử lý kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) Điều kiện sắc ký: Cột C18 Waters (250 x 4,6 mm; m); pha động: kỹ thuật rửa giải gradient với chương trình dung mơi acetonitril acid formic 0,1%; nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng: ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl; bước sóng phát hiện: 270 nm Kết thẩm định: Quy trình thẩm định với tiêu độ đặc hiệu, tính tuyến tính (curcumin I: y = 17386x, R2 = 0,9996, khoảng nồng độ khảo sát 1,0 – 16,0 ppm calophyllolid: y = 29309x, R2 = 0,9998, khoảng nồng độ khảo sát 5,0 – 80,0 ppm), độ lặp lại (curcumin I RSD% = 2,00 v| calophyllolid RSD% = 1,79), độ xác trung gian (curcumin I RSD% = 1,98 calophyllolid RSD% = 1,31) v| độ (tỷ lệ phục hồi curcumin I v| calophyllolid từ 98 – 102%; curcumin I RSD% = 1,34; calophyllolid RSD% = 1,28) với thông số sắc ký đạt yêu cầu quy trình định lượng Kết luận: Quy trình ph}n tích HPLC định lượng đồng thời calophyllolid v| curcumin I đạt yêu cầu thẩm định, l| sở để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dầu Mù u – Nghệ Từ khóa: dầu Mù u – Nghệ, calophyllolid, curcumin I, HPLC, SPE, Ho C ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF CALOPHYLLOLIDE AND CURCUMIN I IN TAMANU – TURMERIC OIL BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD Nguyen Hoang Thao My, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:229 - 234 Background – Objectives:The combination of Calophyllum inophyllum seed oil and Curcuma longa (also called tamanu – turmeric oil) is a study based on proven scientific data on the synergistic effects of tamanu oil and turmeric as well as introduce and standardize new product types The objectives of this study, we researched some conditions for development and validation the determination of calophyllolide and curcumin I in tamanu – turmeric oil by HPLC method *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 091.551.7890 Chuyên Đề Dƣợc Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com 229 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Methods: Finding out the sample processing and the suitable chromatographic conditions for determination of calophyllolide and curcumin I by HPLC method, after that it was validated in system suitability, selectivity, linearity range, precision and accuracy Results: The sample was processed by solid phase extraction (SPE) The suitable chromatographic conditions for separation of calophyllolide and curcumin I were obtained using: a stainless steel column (250 x 4.6 mm), packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mobile phase: a mixture of acetonitrile and formic acide 0.1% with gradient elution technique; flow rate ml per minute; injection volume 10 µl; column temperature 40 oC; 270 nm PDA detector The method were validated selectivity and showed linearity range of calophyllolide (5.0 – 80.0 ppm; ŷ = 29309x; R2 = 0.9998) and curcumin I (1.0 – 16.0 ppm; ŷ=17386x; R2 = 0.9996), respectively of calophyllolide and curcumin I, precision of both calophyllolide and curcumin I with RSD ≤ 2.0%; accuracy with recovery ratio in 98 – 102 % Conclusions: HPLC method was succeessfully determinated calophyllolide and curcumin I as well as validated this process, which is databased to construct the analytical standards of tamanu – turmeric oil Keywords: tamanu – turmetic oil, calophyllolide, curcumin I, HPLC, SPE ĐẶT VẤN ĐỀ Dầu Mù u – Nghệ phối hợp dầu Mù u với dầu Nghệ tạo dạng thành phẩm mang hoạt tính điều trị tốt nhờ vào tác dụng tƣơng hỗ củ h i dƣợc liệu Các nghiên cứu định lƣợng calophyllolid Mù u hay curcumin I Nghệ(1) đƣợc số tài liệu công bố, nhiên chƣ có c ng trình n|o c ng bố phƣơng ph{p định lƣợng đồng thời hoạt chất thành phẩm dầu Mù u – Nghệ Calophyllolid marker dầu Mù u với hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn giúp mau lành vết thƣơng (2,4) Curcumin I nhóm hoạt chất mang tác động kháng viêm (5) chống oxi hóa (3) Vì vậy, mục tiêu đề tài xây dựng thẩm định phƣơng ph{p định lƣợng đồng thời calophyllolid curcumin thành phẩm dầu Mù u – Nghệ sắc ký lỏng hiệu c o HPLC , từ đề nghị giới hạn h|m lƣợng hai hoạt chất chế phẩm ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu Nguyên vật liệu Chất đối chiếu calophyllolid (94,90%) curcumin I (92,93%) nhóm nghiên cứu phân lập Mẫu nghiên cứu Thành phẩm dầu Mù u – Nghệ nhóm nghiên cứu điều chế Thiết bị HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA; cột C18 Waters (250 x 4,6 mm; µm) số thiết bị kh{c đƣợc hiệu chuẩn định kỳ theo quy định Dung mơi - hóa chất Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn HPLC Merck ; nƣớc cất lần dùng cho sắc ký lỏng Phƣơng pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Khảo sát dung mơi hòa tan mẫu: methanol acetonitril, chọn dung m i hò t n đƣợc c lophyllolid v| curcumin; đƣờng sắc ký đồ HPLC ổn định Xử lý mẫu: dùng dung m i hò t n khảo s{t để chiết curcumin I calophyllolid từ dầu mẫu thử, tiếp tục xử lý kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) Khảo sát dung môi rửa giải qua SPE, dịch rửa giải qu SPE đƣợc phân tích Calophyllolid curcumin I 230 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 HPLC Chọn ph}n đoạn thu đƣợc curcumin calophyllolid với tỷ lệ phục hồi 98% Các khảo sát phƣơng ph{p ph}n tích để lựa chọn điều kiện sắc ký cho sắc ký đồ đạt yêu cầu độ phân giải giữ c{c pic định lƣợng pic lân cận, nhƣ c{c yêu cầu thông số pic sắc ký nhƣ độ bất đối, độ tinh khiết pic Khảo sát điều kiện sắc ký tách đồng thời calophyllolid curcumin I HPLC C{c điều kiện dự kiến: tốc độ dòng mL/phút, bƣớc sóng 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC Khảo s{t ph động (pH tỷ lệ dung môi) kỹ thuật rửa giải đẳng dòng, gradient) Dung mơi khảo sát gồm acetonitril meth nol đƣợc phối hợp với acid formic Thẩm định quy trình phân tích HPLC Thẩm định theo hƣớng dẫn chung thẩm định quy trình: khảo sát tính phù hợp hệ thống, Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu Trên sắc ký đồ HPLC, mẫu thử chiết meth nol cho đƣờng ổn định hệ số phân giải pic hiệu mẫu thử chiết acetonitril Xử lý mẫu Cân xác khoảng 1,0 g dầu cho vào bình định mức 50 ml, hò t n v| điền đầy methanol Để yên 30 phút, dung dịch tách thành lớp, lấy xác 10 ml lớp dịch bên trên, cho b y hết dung m i đến cắn Cho toàn cắn vào cột SPE, loại tạp ml hỗn hợp methanol – nƣớc (50 : 50); tiếp tục rửa giải ml dung môi methanol – nƣớc (60 : 40), cho tồn dịch chiết vào bình định mức 10 ml, điền dung m i đến vạch Tỷ lệ phục hồi đƣợc khảo sát mẫu chuẩn tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ xác, trƣớc sau xử lý qua SPE (bảng 1, hình 1) độ Bảng 1: Tỷ lệ phục hồi hỗn hợp mẫu chuẩn trước sau qua SPE S u quy trình đạt yêu cầu thẩm định, áp dụng phƣơng ph{p lên mẫu sản xuất Nồng độ chuẩn thử nghiệm, đề nghị giới hạn định lƣợng Curcumin (40 ppm) Calophyllolid (250 ppm) curcumin I calophyllolid cho sản phẩm Mẫu chuẩn curcumin I v| calophyllolid chưa xử lý qua SPE S Chưa qua SPE S Qua cột SPE Tỷ lệ phục hồi (%) (µV x giây) S (µV x giây) 788130 772529 98,02 7496766 7465498 99,58 Mẫu chuẩn curcumin I calophyllolid sau xử lý qua SPE Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn trước sau xử lý qua SPE Kết khảo sát điều kiện sắc ký tách đồng thời calophyllolid curcumin I HPLC hợp đối chiếu: calophyllolid curcumin I nồng Mẫu trắng: dung môi pha mẫu Mẫu hỗn - Các hệ ph động khảo sát bao gồm Chuyên Đề Dƣợc độ tƣơng ứng 20 v| 3,5 µg/mL đƣợc pha ph động 231 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 acetonitril phối với acid formic 0,1% với tỷ lệ (65 : 35), (60 : 40), (57 : 43) (55 : 45) Kết khảo sát cho thấy: tỷ lệ dung môi acetonitril - acid formic (60 : 40) cho kết SKĐ tối ƣu thông số độ phân giải Tuy nhiên, khảo sát với kỹ thuật isocratic chƣ đạt yêu cầu độ tinh khiết, khảo sát đƣợc thực nhằm cải thiện thông số độ tinh khiết pic calophyllolid curcumin I - Thử nghiệm đƣợc khảo sát vài tỷ lệ ph động acetonitril – dung dịch acid formic 0,1 % với kỹ thuật rửa giải gradient Bảng 3: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống dung dịch hỗn hợp đối chiếu Chất phân tích Giá trị Thời gian Diện tích thống lưu (phút) pic (µVxs) kê TB 6,55 60087 Curcumin I RSD 0,09% 1,39 % TB 28,28 627097 Calophyllolid RSD 0,09 % 0,61% Hệ số Độ bất phân đối giải 1,4 3,7 1,1 3,7 Bảng 4: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu thử dầu Mù u – Nghệ Chất phân tích Giá trị Thời gian Diện tích thống lưu (phút) pic (µVxs) kê TB 6,53 61031 Curcumin I RSD 0,22% 1,97% TB 27,96 656984 Calophyllolid RSD 0,36% 0,54% Hệ số Độ bất phân đối giải 1,3 3,7 1,0 3,3 Kết cho thấy bƣớc sóng 270 nm có pic curcumin I calophyllolid tách hoàn toàn khỏi pic lân cận v| đạt độ tinh khiết theo yêu cầu sắc ký Như vậy, RSD thời gi n lƣu v| diện tích pic khảo s{t < %, hệ số bất đối khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải pic > 1,5: quy trình đạt tính phù hợp hệ thống Nhƣ vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định lƣợng đồng thời calophyllolid curcumin I: cột C18 (250 x 4,6 mm; µm), tốc độ dòng mL/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µL, bƣớc sóng phát 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC Thẩm định quy trình Ph động hệ dung mơi acetonitril – dung dịch cid formic 0,1 % pH 3,5 theo chƣơng trình gr dient đƣợc trình bày bảng Bảng 2: Chương chình dung mơi Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitril – acid formic 0,1% (pH 3,5) 60 : 40 10 55 : 45 25 65 : 35 35 60 : 40 Điều kiện n|y t{ch ho|n to|n pic khảo sát, tiến hành thử nghiệm khảo sát tính phù hợp hệ thống thẩm định quy trình Khảo sát tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký lần dung dịch hỗn hợp đối chiếu (bảng 3) mẫu thử (bảng 4) 232 Tính đặc hiệu Kết khảo s{t tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu pic thời gian lƣu pic mẫu đối chiếu tƣơng ứng Dung dịch thử: sắc ký đồ có pic tách hồn tồn thời gi n lƣu hai pic cần định lƣợng mẫu thử tƣơng đƣợng với mẫu đối chiếu Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu, chiều cao diện tích pic curcumin I c lophyllolid tăng lên so với mẫu thử; phổ Uv – Vis pic hoạt chất cần định lƣợng mẫu thử tƣơng ứng với phổ Uv – Vis mẫu đối chiếu Sử dụng chức kiểm tr độ tinh khiết cho thấy pic khảo s{t đạt yêu cầu Như vậy, quy trình đạt yêu cầu độ đặc hiệu (Hình 2) Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Sắc ký đồ (SKĐ) mẫu trắng Nghiên cứu Y học SKĐ hỗn hợp mẫu đối chiếu SKĐ mẫu thử dầu Mù u – Nghệ SKĐ mẫu đối chiếu + thử Hình 2: SKĐ độ đặc hiệu quy trình định lượng định lƣợng đồng thời calophyllolid curcumin Kết thẩm định khoảng tuyến tính, độ đúng, I đạt yêu cầu thẩm định độ xác Kết liệu thống kê cho thấy quy trình Bảng 5: Kết thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình Curcumin I Calophyllolid Phương trình hồi quy ŷ = 17386 x Hệ số tương quan R = 0,9996 ŷ = 29309 x R = 0,9998 Khoảng tuyến tính 1, – 16,0 µg/mL – 80 µg/mL Độ xác (n=6) - Độ lặp lại RSD 2,00% ≤ 2% RSD 1,79% < 2% - Độ xác trung gian RSD 1,98% ≤ 2% RSD 1,31% < 2% Độ (n = 9) Tỷ lệ phục hồi 98,0 – 101,1% Tỷ lệ phục hồi 98,12 – 101,95 % Mẫu thử thêm đối chiếu (50%, 100% 150%) RSD 1,34 % RSD 1,28 % Quy trình đƣợc ứng dụng để x{c định hàm lƣợng hoạt chất mẫu thử từ lô dầu Mù u – Nghệ sản xuất thử: Hàm lượng TB curcumin I (%) Hàm lượng TB calophyllolid (%) Lô 0,031 0,22 Lô 0,031 0,23 Lô 0,030 0,22 Từ kết định lƣợng lô sản xuất thử, kiến nghị giới hạn h|m lƣợng hai hoạt chất dầu Mù u – Nghệ: H|m lƣợng C% curcumin I dầu Mù u – Nghệ phải ≥ 0,03% Chuyên Đề Dƣợc H|m lƣợng C% calophyllolid dầu Mù u – Nghệ ≥ 0,20% BÀN LUẬN Kết thực nghiệm minh chứng cho quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I đạt yêu cầu quy trình định lượng Mẫu thử nghiệm mẫu có thành phần phức tạp nên công đoạn xử lý mẫu qua SPE cần thiết Kết cùa việc xử lý mẫu ảnh 233 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 hưởng lớn đến độ độ xác quy trình, việc thực bước xử lý mẫu cần tỉ mỉ, xác Chúng thực thử nghiệm xác định tỷ lệ phục hồi hàm lượng trước sau qua SPE, chứng minh hàm lượng thu hồi hai hoạt chất 98%, kết góp phần khẳng định độ quy trình phân tích Các điều kiện sắc ký khảo sát, kết thử nghiệm cho thấy pha động có dung mơi acetonitril acid hóa acid formic cho thông số sắc ký đạt yêu cầu so với dung môi methanol Mặc dù kỹ thuật rửa giải gradient khó đạt độ xác kết định lượng, nhiên mẫu thử có thành phần phối hợp cao chiết từ hai dược liệu nên thành phần tạp Các thử nghiệm kỹ thuật isocratic cho sắc ký đồ không đạt độ tinh khiết thời gian lưu hai pic urcumin I calophylloid Vì vậy, chúng tơi chọn kỹ thuật rửa giải gradient cho quy trình phân tích lƣợng đồng thời calophyllolid curcumin I mẫu thử dầu Mù u – Nghệ đạt yêu cầu theo theo thẩm định Đ}y l| sở để xây dựng tiêu chuẩn sở cho thành phẩm với mức kiến nghị cho h|m lƣợng % curcumin I ≥ 0,03% calophyllolid ≥ 0,20% TÀI LIỆU THAM KHẢO Ardi N, Abdul R, Endang L, Nuning R and Sudjadi (2015) Analysis of Curcumin in ethanolic extract of Curcuma longa Linn and Curcuma xanthorriza Roxb using High Performance Liquid Chromatography with UV-Detection Research Journal of Phytochemistry, 9: 188-194 Bin ZM, Ilham Z (2014), Anti - infalmmatory activity of Calophyllum inophyllum fruits extracts, Procedia Chemistry, 13: 218-220 Borra SK, Prema G, Jayamathi RC (2013), Antioxidation and free radical scavenging activity of curcumin determined by using different in vitro and ex vivo models, Journal of Medicinal Plants Research (36): 2680-2690 Shanmugapriya CY (2016), Calophyllum inophyllum: A medical Plant with multiple curative values Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Medical,7 (4): 1446 - 1452 Soheil ZM, Hbash AK, Pouya H (2014), A review on Antibacterial, Antiviral and Antifungal activity of Curcumin, BioMe Research International pp 337-339 Ngày nhận báo: 18/10/2017 KẾT LUẬN Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Bằng phƣơng ph{p sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dãy diod qu ng, quy trình định Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 234 Chuyên Đề Dƣợc ... C% calophyllolid d u Mù u – Nghệ ≥ 0,20% BÀN LUẬN Kết thực nghiệm minh chứng cho quy trình định lượng đồng thời calophyllolid curcumin I đạt y u c u quy trình định lượng M u thử nghiệm m u có... độ đặc hi u quy trình định lượng định lƣợng đồng thời calophyllolid curcumin Kết thẩm định khoảng tuyến tính, độ đúng, I đạt y u c u thẩm định độ xác Kết li u thống kê cho thấy quy trình Bảng... construct the analytical standards of tamanu – turmeric oil Keywords: tamanu – turmetic oil, calophyllolide, curcumin I, HPLC, SPE ĐẶT VẤN ĐỀ D u Mù u – Nghệ phối hợp d u Mù u với d u Nghệ tạo