Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin, góp phần giảm chi phí và thời gian phân tích.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI FEXOFENADIN VÀ TẠP A BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Trần Thị Cẩm Vân* Trần Quốc Lộc*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethylbenzeneacetic acid (tạp A) tạp chất liên quan fexofenadin, có nguồn gốc từ q trình tổng hợp bảo quản fexofenadin Do đó, chuyên luận fexofenadin dược điển số nước BP 2016 USP 40 quy định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A nguyên liệu thành phẩm chứa fexofenadin Cho đến nay, giới có vài cơng trình cơng bố định lượng fexofenadin tạp A phương pháp HPLC Trong nước chưa có tác giả cơng bố qui trình sắc ký lỏng hiệu cao định lượng đồng thời fexofenadin tạp A nguyên liệu, chế phẩm chứa fexofenadin trình theo dõi độ ổn định thuốc Xuất phát từ lý trên, nghiên cứu thực với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích đồng thời fexofenadin tạp A nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin, góp phần giảm chi phí thời gian phân tích Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Fexofenadin hydroclorid tạp A fexofenadin hydroclorid (4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethylbenzeneacetic acid) Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến hiệu lực tách fexofenadin tạp A tỷ lệ thành phần pha động Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng giới hạn phát tạp A, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác, độ độ thơ Quy trình sau thẩm định ứng dụng để định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin thị trường Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời fexofenadin tạp A sau: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; µm), bước sóng phát 220 nm, pha động acetonitril – nước – acid phosphoric – amoni hydroxyd (42:58:0,1:0,2), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 0,8 ml/phút Quy trình phân tích thẩm định theo hướng dẫn ICH đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt yêu cầu độ đúng, độ xác độ thô, giới hạn phát giới hạn định lượng tạp A thấp Kết định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin lưu hành Việt Nam cho thấy hàm lượng fexofenadin tạp A nằm giới hạn cho phép Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời fexofenadin tạp A phương pháp HPLC xây dựng thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng pha động khơng có dung dịch đệm Quy trình ứng dụng để định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin có thị trường Từ khóa: Fexofenadin, tạp A fexofenadin * Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, Mỹ phẩm tỉnh Đắklắk **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913 799 068 Email: ductuan@ump.edu.vn 416 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF FEXOFENADINE AND IMPURITY A BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Tran Thi Cam Van, Tran Quoc Loc, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 416 -425 Background – Objectives: 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid is fexofenadine impurity A which arises from synthesis and during storage of fexofenadine The presence of this impurity may influence treatment efficacy and safety of fexofenadine The BP 2016 and USP 40 require conducting the impurity test in fexofenadine pharmaceutical substance as well as corresponding finished products There have been several published studies on assay of fexofenadine and impurity A so far Therefore, this study was carried out with the aim of development of a fast, simple and less-costly HPLC method for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A Method: The subject of this study was fexofenadine hydrochloride and fexofenadine impurity A (4-[1-oxy-4[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid) Method: Several chromatographic conditions such as components of mobile phase in different ratio that affects selectivity and separation efficiency, were investigated Once the appropriate chromatographic conditions were obtained, the analytical procedure was validated basing on ICH guidelines, including system suitability, selectivity, quantitation and detection limit of impurity A, linearity and range, precision, accuracy, and robustness Then the validated procedure was applied for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A in fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals Results: The appropriate chromatographic conditions for complete separation of fexofenadine and impurity A were obtained on HIQ sil C18HSA column (250 x 4.6 mm; µm), detection wavelength at 220 nm, mixture of acetonitrile, water, phosphoric acid, and ammonium hydroxide (42:58:0.1:0.2) as mobile phase, injection volume of 20 µL, flow rate of 0.8 ml/min Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear, precise, accurate, high sensitivity, and robust All the calculations concerning the quantitative analysis showed that several fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals in Vietnam market contained an amount of fexofenadine and impurity A that was within accepted limits Conclusion: The RP-HPLC method for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A was successfully developed and validated, using isocratic mode and mobile phase without buffer The proposed method was applied for quantitation of fexofenadine and impurity A in some fexofenadine raw materials and corresponding finished products in the market Keyword: fexofenadine, fexofenadine impurity A ĐẶT VẤN ĐỀ 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid (tạp A) tạp chất liên quan fexofenadin, có nguồn gốc từ trình tổng hợp bảo quản fexofenadin(3,6) Do đó, chuyên luận fexofenadin dược điển số nước BP 2016 USP 40 quy định phải kiểm tra giới hạn h|m lượng tạp A nguyên Chuyên Đề Dƣợc liệu thành phẩm chứa fexofenadin Cho đến nay, giới có vài cơng trình cơng bố định lượng fexofenadin tạp A phương ph{p HPLC(2,4) Trong nước chưa có t{c giả cơng bố qui trình sắc ký lỏng hiệu cao định lượng đồng thời fexofenadin tạp A nguyên liệu, chế phẩm chứa fexofenadin trình theo dõi độ ổn định thuốc Xuất phát từ lý trên, nghiên cứu n|y thực với mục tiêu xây dựng 417 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 phương ph{p ph}n tích đồng thời fexofenadin tạp A nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin, góp phần giảm chi phí thời gian phân tích v|o bình định mức 10 ml Hút xác ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, cho v|o bình định mức, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Mẫu thử: cân lượng bột thuốc tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội thêm pha động đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch cho v|o bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Đối tƣợng nghiên cứu Fexofenadin hydroclorid tạp A fexofenadin hydroclorid (4-[1-oxy-4-[4(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl],-dimethyl benzeneacetic acid) Nguyên vật liệu Chất chuẩn Chuẩn đối chiếu fexofenadin hydroclorid: độ tinh khiết 99,7% tính nguyên trạng, số kiểm soát 160236, điều kiện bảo quản 2-8oC công ty SAVI cung cấp Tạp chuẩn A fexofenadin hydroclorid: độ tinh khiết 100% tính nguyên trạng, số kiểm so{t 02032, điều kiện bảo quản 2-8oC tổ chức dược điển Châu Âu cung cấp (European Pharmacopoeia) Trang thiết bị: Hệ thống HPLC 1260 Agilent, cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; µm), cân phân tích ABT 220 – 5DM Kern với độ xác 0,01 mg, bể siêu âm S100H Elmasonic, máy đo pH S220 Metler Toledo Hóa chất dung mơi: Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký lỏng (Merck) Triethylamin (TEA), acid phosphoric đậm đặc amoni hydroxyd đậm đặc đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn gốc tạp A (50 ppm): cân xác khoảng mg tạp chuẩn A, cho vào bình định mức 20 ml, thêm 10 ml acetonitril, siêu âm phút, bổ sung acetonitril vừa đủ đến vạch, lắc Mẫu chuẩn fexofenadin 60 ppm tạp ppm: cân xác khoảng mg fexofenadin chuẩn, cho v|o bình định mức 10 ml, thêm ml pha động, siêu }m ph t, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc thu dung dịch A H t x{c ml dung dịch A, cho 418 Mẫu thử giả lập: cân lượng bột thuốc tương đương 60 mg fexofenadin, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội thêm pha động đến vạch, lắc H t x{c ml dung dịch, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm xác ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu giả dược: cân lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội thêm pha động đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch cho v|o bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin: cân xác khoảng 60 mg fexofenadin chuẩn lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch, cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn tạp chuẩn A: cân xác khoảng 60 mg fexofenadin chuẩn lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội thêm pha động đến vạch, lắc H t Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 x{c ml dung dịch, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm xác ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Để chứng minh qui trình định lượng đồng thời tạp A ngun liệu fexofenadin có tính chọn lọc trường hợp fexofenadin bị phân hủy để tạo thành tạp A tạp khác (nếu có), mẫu khảo sát sau đ}y chuẩn bị sau: Mẫu oxy hóa H2O2 3%/ 48 giờ: cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml dung dịch H2O2 3%, siêu âm 10 ph t, để nguội thêm H2O2 3%, lắc Dung dịch thu được đặt tủ sấy nhiệt độ 30oC 48 Mẫu đặt nhiệt độ 60oC/ 48 giờ: cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành lớp mỏng hộp petri cho vào tủ sấy nhiệt độ 60oC 2oC 48 Sau cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp 48 giờ: cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành lớp mỏng hộp petri v| để ánh sáng mặt trời 48 Sau cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu chiếu tia UV 24 giờ: cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành lớp mỏng hộp petri v| để đèn UV 254 nm 24 Sau cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu làm ẩm 24 giờ: cân 50 mg nguyên liệu fexofenadin, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng ml nước cất, siêu }m 10 Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học ph t, để nguội, thêm nước cất đến vạch, lắc đều, để yên 24 giờ, lọc qua m|ng lọc 0,45 m Các dung dịch sau pha bọc kín miệng giấy parafin bảo quản tủ lạnh, nhiệt độ 5oC ± 2oC Trước sử dụng, để dung dịch nhiệt độ 20oC – 25oC - Phƣơng pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc hóa học fexofenadin tạp A, đồng thời tham khảo chuyên luận fexofenadin c{c dược điển USP 40(7) BP 2016(1), phương ph{p sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò DAD áp dụng với điều kiện sắc ký ban đầu sau: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; m), tốc độ dòng 0,8 ml/ph t, bước sóng phát 220 nm, thể tích tiêm 20 l, pha động acetonitril nước có thêm acid phosphoric triethylamin amoni hydroxyd với chương trình rửa giải đẳng dòng Trong q trình thực nghiệm, số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách khảo sát tỷ lệ thành phần pha động Qua khảo sát thực nghiệm, chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho pic tạp A v| pic fexofenadin đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis), tách hồn tồn có hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình ph}n tích theo hướng dẫn ICH, bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng giới hạn phát tạp A, tính tuyến tính miền giá trị, độ x{c, độ đ ng v| độ thơ Quy trình sau thẩm định ứng dụng để định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin thị trường KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký hỗn hợp chuẩn fexofenadin 60 ppm tạp A ppm theo điều kiện sắc ký ban đầu v| thay đổi thành phần pha động theo tỷ lệ khác Bảng trình bày số tỷ lệ thành phần pha động khảo s{t Hình đến hình minh họa sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn Bảng 419 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học trình bày thơng số sắc ký fexofenadin tạp A Hệ số phân giải cao thời gian phân tích khơng q 15 phút Bảng 1: Thành phần pha động khảo sát Với hệ pha động 3: Tạp A fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 hệ số phân giải cao so với hệ 1, Hệ pha động Tỷ lệ khảo sát (ACN – H2O – H3PO4 - TEA) 50 : 50 : 0,1 : 0,30 45 : 55 : 0,1 : 0,30 42 : 58 : 0,1 : 0,30 40 : 60 : 0,1 : 0,30 Bảng 2: Kết khảo sát thành phần pha động Hệ pha S (mAU x Hoạt chất tR (phút) động giây) Fexofenadin 4,953 3035 Tạp A 6,347 189 Fexofenadin 6,551 3026 Tạp A 9,205 187 Fexofenadin 8,386 3022 Tạp A 12,610 190 Fexofenadin 10,096 3028 Tạp A 15,425 188 RS AS 4,2 5,2 5,7 5,6 1,5 1,1 1,5 1,1 1,4 1,1 1,5 1,2 Độ tinh khiết pic Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Kết khảo sát cho thấy: Với hệ pha động 1: Tạp A fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 Tuy nhiên, hệ số phân giải thấp so với hệ 2, Với hệ pha động 2: Tạp A fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 Khoảng cách thời gian lưu pic fexofanadin tạp A ngắn so với hệ Với hệ pha động 4: Tạp A fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 Thời gian phân tích d|i so với hệ pha động 1, Với hệ pha động, áp suất hệ thống cao (trung bình khoảng 200 bar) khơng ổn định (180 - 220 bar) Nguyên nhân độ nhớt TEA cao Như vậy, hệ pha động lựa chọn cho khảo sát Tiến h|nh thay đổi tỷ lệ TEA pha động từ 0,15% - 0,25% Tuy nhiên, áp suất hệ thống cao (trung bình khoảng 200 bar) khơng ổn định (180 - 220 bar) Các thí nghiệm bao gồm thay TEA amoni hydroxyd với nồng độ từ 0,1% - 0,3% Kết khảo sát cho thấy nồng độ amoni hydroxyd từ 0,2% - 0,3%, tạp A fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5, áp suất hệ thống giảm (trung bình khoảng 90 bar) ổn định (89 - 91 bar) Fexofenadin Tạp A Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động 420 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Fexofenadin Tạp A Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động Fexofenadin Tạp A Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động Fexofenadin Tạp A Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động Như điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời fexofenadin tạp A phương ph{p HPLC với đầu dò DAD là: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; m), bước Chuyên Đề Dƣợc sóng phát 220 nm, pha động acetonitril nước - acid phosphoric - amonihydroxyd (42:58:0,1:0,2), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl 421 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Thẩm định quy trình Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 3: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Giá trị thống kê tR (phút) TB 8,341 Chuẩn RSD% 0,03 TB 8,277 Thử giả lập RSD% 0,08 TB 8,258 Giả dƣợc thêm chuẩn RSD% 0,07 Mẫu Fexofenadin S (mV x giây) AS 3063,813 1,4 1,48 0,00 3070,391 1,4 0,18 0,00 3019,065 1,4 0,09 0,00 Nbk 2833 0,64 2739 0,51 3060 0,44 tR (phút) 12,294 0,15 12,211 0,17 12,267 0,25 Tạp A S (mV x giây) RS 240,204 5,4 0,42 0,00 236,521 5,4 0,52 0,95 195,785 5,5 0,73 0,74 AS 1,0 1,18 1,1 1,04 1,1 1,27 Nbk 3396 0,94 3671 0,99 3586 1,48 tR: thời gian lưu; S: diện tích pic; As: hệ số bất đối; Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến; Rs: độ phân giải Kết khảo sát cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối thông số sắc ký tạp A v| fexofenadin không 2%, hệ số bất đối pic tạp A fexofenadin nằm khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải pic tạp A fexofenadin lớn 1,5 Như qui trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Kết khảo s{t tính đặc hiệu cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng (pha động dung môi pha mẫu) mẫu giả dược không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu tạp A v| fexofenadin sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn mẫu thử xuất pic fexofenadin có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ mẫu chuẩn Pic fexofenadin có thời gian lưu kh{c ho|n to|n với thời gian lưu tạp A sắc ký đồ mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu thử giả lập mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn Hình 5: Sắc ký đồ pha động 422 tạp chuẩn A xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu fexofenadin tạp A sắc ký đồ mẫu chuẩn Pic tạp A tách hoàn toàn với pic fexofenadin pic tạp khác Sắc ký đồ mẫu khảo sát có xuất pic tạp A, không xuất tạp khác hàm lượng fexofenadin giảm mẫu thử bị oxy hóa H2O2 3% v| đặt tủ sấy 60oC 48 Trong mẫu này, pic tạp A fexofenadin tách hoàn toàn Phổ UV-Vis thời gian lưu pic tạp A fexofenadin sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử giả lập, mẫu giả dược thêm chuẩn mẫu khảo sát giống với phổ UV-Vis thời gian lưu pic tương ứng sắc ký đồ mẫu chuẩn Các pic tạp A fexofenadin sắc ký đồ mẫu tinh khiết (theo phổ UV-Vis) Như qui trình phân tích có tính đặc hiệu Hình đến hình 16 minh họa kết khảo s{t tính đặc hiệu Hình 6: Sắc ký đồ mẫu thử Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử giả lập Hình 8: Sắc ký đồ mẫu giả dược Hình 9: Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin Hình 10: Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin tạp A Hình 11: Sắc ký đồ mẫu thử chiếu sáng 48 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu thử chiếu UV 24 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu thử làm ẩm 24 Hình 14: Sắc ký đồ mẫu thử bị oxy hóa H2O2 3% Hình 15: Sắc ký đồ mẫu thử để 60oC 48 Hình 16: Sắc ký đồ mẫu chuẩn tạp A 50 ppm Chuyên Đề Dƣợc 423 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) tạp , độ xác độ Bảng 4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, LOD LOQ tạp A, độ xác độ Tạp A Fexofenadin Phƣơng trình hồi qui Khoảng tuyến tính (ppm) LOD (ppm) ŷ = 36,80x 0,5 - 10; R = 0,9990 0,15 ŷ = 51,13x 60 - 140; R = 0,9998 LOQ (ppm) 0,50 Độ xác (n=12) Nguyên liệu giả lập Thành phẩm giả lập * Độ (n=9) RSD = 1,11% RSD = 0,62% 99,12% - 103,30%; RSD = 1,69% RSD = 0,09% RSD = 0,04% 97,66% - 100,53%; RSD = 0,93% * Độ thẩm định mẫu giả dược thêm chuẩn mức nồng độ 80%, 100% 120% nồng độ định lượng fexofenadin mức giới hạn cho phép tạp A Kết xử lý thống kê cho thấy giá trị F ứng dụng để định lượng đồng thời tạp A v| fexofenadin lớn F0,05 nên fexofenadin tạp A nguyên liệu thành phương trình hồi quy tương thích Gi{ trị t phẩm chứa fexofenadin hệ số B lớn t0,05 nên giá trị B có ý nghĩa Ứng dụng quy trình định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm fexofenadin có thị trường Bảng 5: Kết định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin thị trường (n=4) Giá trị t hệ số Bo nhỏ t0,05 nên hệ số Bo khơng có ý nghĩa Hệ số tương quan r có gi{ trị lớn 0,999 Phương ph{p ph}n tích đạt yêu cầu độ đ ng v| độ xác(5) Độ thơ: Tiến hành sắc ký mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn tạp chuẩn A c{c điều Sản phẩm kiện thay đổi tốc độ dòng ± 0,2 ml/phút Nguyên liệu fexofenadin Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty A) Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty B) Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty C) thành phần pha động với tỷ lệ 5% so với điều kiện sắc ký thích hợp lựa chọn Kết khảo sát cho thấy độ phân giải fexofenadin tạp A lớn 1,5; Gi{ trị RSD thời gian lưu v| diện tích pic fexofenadin tạp A không 2%; Hệ số bất đối pic fexofenadin tạp A khoảng 0,8 – 1,5 Các kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng đồng thời fexofenadin tạp A phương ph{p HPLC đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng Hàm Hàm lượng lượng tạp fexofenadin A NLFE 9/2019 98,40% < LOD CPFE 0/2020 96,17% 0,02% CPFE 10/2019 95,18% < LOD CPFE 3/2020 95,89% 0,01% Mã hóa Hạn dùng Kết định lượng cho thấy h|m lượng fexofenadin nguyên liệu chế phẩm nằm giới hạn cho phép từ 98% - 102% nằm khoảng 90% - 110% so với h|m lượng nhãn; Không phát pic tạp A sắc ký đồ mẫu nguyên liệu mẫu chế phẩm; Trong hai chế phẩm lại, h|m lượng tạp A mức giới hạn cho phép (0,4%) tuyến tính rộng, giới hạn phát giới hạn BÀN LUẬN định lượng tạp A nằm mức cho phép Một khó khăn định lượng tạp A mức giới hạn cho phép tạp A nhỏ so với dược chất Điều n|y đòi hỏi điều kiện sắc ký phải lựa chọn cho độ phân tạp A chế phẩm, đạt độ x{c, độ đ ng v| độ thơ Như quy trình 424 Chun Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 giải pic dược chất pic tạp chất phải lớn nhiều so với giá trị quy định 1,5 Điều kiện sắc ký để tách hoàn toàn fexofenadin tạp A nghiên cứu acetonitril - nước - acid phosphoric amoni hydroxyd (42:58:0,1:0,2), so với dung môi pha động sử dụng dược điển Anh v| dược điển Mỹ với hỗn hợp acetonitril dung dịch đệm điều kiện n|y kh{ đơn giản, khơng nhiều thời gian phải rửa hệ thống sắc ký so với pha động có dung dịch đệm v| tr{nh g}y ăn mòn hệ thống Cột sắc ký sử dụng nghiên cứu cột C18, so với cột phenyl USP BP cột C18 thơng dụng hơn, có hầu hết tất phòng thí nghiệm tuyến tỉnh tuyến trung ương Thứ tự rửa giải fexofenadin tạp A nghiên cứu fexofenadin khoảng phút tạp A khoảng 12 phút So với điều kiện sắc ký USP BP thời gian lưu fexofenadin khoảng phút thời gian lưu tương đối pic tạp A so với pic fexofenadin 1,7 Như vậy, thời gian sắc ký nghiên cứu ngắn (trước 15 phút) so với dược điển (hơn 15 ph t) Tốc độ dòng nghiên cứu 0,8 ml/phút nhỏ dược điển (1,2 -1,5 ml/ph t) Điều giúp tiết kiệm thời gian dung môi q trình phân tích mẫu Kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng fexofenadin tạp A đ{p ứng đầy đủ yêu cầu quy trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm nên ứng dụng để kiểm tra fexofenadin tạp A số nguyên liệu chế phẩm thị trường Ở số điều Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học kiền khắc nghiệt (H2O2 3%/48 60 oC/48 giờ), fexofenadin bị phân phân hủy tạo thành tạp A số tạp khác Trong trường hợp n|y, quy trình định lượng xây dựng nghiên cứu thể tính đặc hiệu KẾT LUẬN Quy trình định lượng đồng thời fexofenadin tạp A phương ph{p HPLC xây dựng thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng v| pha động khơng có dung dịch đệm Quy trình ứng dụng để định lượng fexofenadin kiểm tra tạp A số nguyên liệu chế phẩm chứa fexofenadin có thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO British Pharmacopoeia (2016), CD-ROMs, monograph 2280 Hadir MM, Maha AS, Ileana VO (2011), “Development of validated stability-indicating chromatographic method for the determination of fexofenadine hydrochloride and its related impurities in pharmaceutical tablets”, Chemistry Central Journal, 5(1):76, 1-10 Jiangang M, Haining G, Pengfei Z (2008), “A Novel and Efficient Synthesis of Intermediates for the Preparation of Fexofenadine”, Scholar Research Exchange, Article ID 137091 LGC Limited (2015) Đường link https://hybris-static-assetsproduction.s3-eu-west-1.amazonaws.com/sys-master/pdfs/h1b/ ha4/9439042535454/en_ST-WB-CERT-2235280-1-1-1.PDF Ngày truy cập: 26/08/2017 Ludwig Huber (2007), “Validation and qualification in analytical laboratories, second edition”, pp 144, 146 Siva RPV, Dnyandev RR, Narendra DM, Venkateswar K, Ramesh KS, Debashish D (2009), “Process for the preparation of 4-[4-(4-(hydroxydiphenylmethyl)- 1-piperidinyl]-1-oxobutyl]α,α-dimethylbenzen acetic acid methyl ester and use there of”, Patent No WO 2009136412 A2 USP 40 – NF 35 (2017), monographs fexofenadine, fexofenadine tablets, fexofenadine capsules, pp 4183, 4188 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ngày báo đăng: 15/03/2018 425 ... sensitivity, and robust All the calculations concerning the quantitative analysis showed that several fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals in Vietnam market contained an amount... procedure was applied for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A in fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals Results: The appropriate chromatographic conditions... hợp n|y, quy trình định lượng xây dựng nghiên cứu thể tính đặc hiệu KẾT LUẬN Quy trình định lượng đồng thời fexofenadin tạp A phương ph{p HPLC xây dựng thẩm định, sử dụng chương trình r a giải