xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc msms

Mở đầu: Đề tài xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với mục tiêu làm tiền đề trongviệc đánh giá tương đương sin

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

DƯƠNG ĐÌNH CHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM.

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

DƯƠNG ĐÌNH CHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc -Độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN THANH DŨNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

DƯƠNG ĐỈNH CHUNG

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ

GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

Dương Đình ChungThầy hướng dẫn: PGS.TS Phan Thanh Dũng

Từ khóa: Metformin, glimepirid, glipizid, LC-MS/MS, plasma.

Mở đầu: Đề tài xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin và glimepirid

trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với mục tiêu làm tiền đề trongviệc đánh giá tương đương sinh học và sinh khả dụng các chế phẩm generic có chứahai hoạt chất metformin và glimepirid, góp phần nâng cao chất lượng thuốc được sảnxuất tại Việt Nam

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Huyết tương tự tạo

chứa metformin và glimepirid Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát và so sánh các

phương pháp xử lý mẫu (tủa protein, chiết phân bố lỏng lỏng với dung môi ethylacetat và diethyl ether tỷ lệ 1 : 1, tt/tt và chiết pha rắn với cột Bond Elut C18 –100mg/ml) Khảo sát các chất chuẩn nội glibenclamid, gliclazid và glipizid Kỹ thuật LC-MS/MS áp dụng, thực hiện ion hóa bằng ESI+ và thực hiện ghi tín hiệu bằng chế độMRM Quy trình phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của US-FDA và EMA

Kết quả: Đã xác định được phương pháp xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein

với dung môi là acetinitril có bổ sung 0,1% acid formic Chất chuẩn nội phù hợp làglipizid Điều kiện sắc ký: Cột UPLC®BEH C18 (50 × 2,1 mm; 1,7 μm), nhiệt độbuồng cột: 40 oC; Thể tích tiêm mẫu: 2 µl; Tốc độ dòng: 0,3 ml/min; Chế độ rửa giảigradient với hệ pha động 2 thành phần gồm: kênh A chứa 0,1 % acid formic trongacetonitril; kênh B chứa 0,1 % acid formic trong nước Điều kiện khối phổ: ion hóachế độ ESI (+), quá trình chuyển khối metformin từ 130,2 → 60,0 và 70,9 (m/z);glimepirid từ 491,3 → 352,1 và 126,0 (m/z); glipizid từ 446,2 → 99,9 và 321,0 (m/z)tương ứng với năng lượng cone là 15, 30, 15 (V) Khoảng tuyến tính từ 1 - 100 ng/mlcho metformin và từ 0,25 - 25 ng/ml cho glimepirid với hệ số tương quan hồi quy r2

> 0,98 cho cả hai chất phân tích LLOQ của phương pháp được xác định bằng độđúng, độ lặp lại và pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu có nồng độ thấp nhất củađường chuẩn là 1 ng/ml cho metformin và 0,25 ng/ml cho glimepirid

Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong huyết tương

người bằng kỹ thuật LC-MS/MS có thể áp dụng cho công tác đánh giá sinh khả dụng

và tương đương sinh học của các chế phẩm generic dạng phối hợp của hai hoạt chấtmetformin và glimepirid

Master’s Thesis – Academic course: 2018 – 2020

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210

ESTABLISH PROCESS SIMULTANEOUS DETERMINATION OF METFORMIN AND GLIMEPIRIDE IN PLASMA BY LC-MS/MS

Duong Dinh ChungSupervisor: Assoc Prof Dr Phan Thanh Dung

Keywords: Metformin, glimepirid, glipizid, LC-MS/MS, plasma.

Introduction: The simultaneous quantification of metformin and glimepiride in

human plasma by LC-MS / MS technique was established with the aim to be aprerequisite for evaluating bioequivalence and bioavailability of generic products ofactive ingredients (metformin and glimepirid), contributing to improve the quality ofdrugs manufactured in Vietnam

Materials and methods: Research subjects: Serum contained metformin and

glimepirid Research method: The sample treatment methods (protein precipitation,

liquid liquid distribution extraction with 1: 1 solvent ethyl acetate and diethyl ether,

tt / tt and solid phase extraction with Bond Elut column C18 –100 mg/ml) weresurveyed and compared The glibenclamide, gliclazid and glipizid internal standardswere investigated The LC-MS/MS technique with ionization by ESI + and signalrecording by MRM mode was applied Analytical procedures were validatedaccording to US-FDA and EMA guidelines

Results: The method of treating samples by protein precipitation method with a

solvent of acetinitril supplemented with 0.1% formic acid has been determined.Glipizide was selected as a suitable internal standard Chromatographic conditions:UPLC®BEH C18 column (50 × 2.1 mm; 1.7 μm), column chamber temperature: 40

° C; Sample injection volume: 2 µl; Flow rate: 0.3 ml/min; The gradient elution modewith 2-component dynamic phase system includes: A channel contains 0.1% formicacid in acetonitril; Channel B contains 0.1% formic acid in water Mass spectrometriccondition: ionization of ESI (+) mode, metformin block transition from 130.2 → 60.0and 70.9 (m/z); glimepirid from 491.3 → 352.1 and 126.0 (m/z); glipizid from 446.2

→ 99.9 and 321.0 (m/z), corresponding to cone energies of 15, 30, 15 (V) The linearrange is from 1 - 100 ng/ml for metformin and 0.25 - 25 ng/ml for glimepiride with aregression correlation coefficient r2 > 0.98 for both analytes The LLOQ of themethod is determined by the accuracy, repeatability, and peak obtained on thechromatogram of the sample with the lowest concentration of the calibration curve of

1 ng/ml for metformin and 0.25 ng/ml for glimepiride

Conclusion: Simultaneous quantification of metformin and glimepiride in human

plasma by LC-MS / MS technique can be applied to assess the bioavailability andbioequivalence of the combined generic products of two active ingredients includingmetformin and glimepirid

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 METFORMIN 3

1.2 GLIMEPIRID 5

1.3 GLIPIZID 7

1.4 GLICLAZID 7

1.5 GLIBEMGLAMID 8

1.6 PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 8

1.6.1 Phương pháp thường áp dụng phân tích thuốc trong dịch sinh học 8

1.6.2 Các kỹ thuật xử lý, tách chiết dược chất trong mẫu 9

1.7 KỸ THUẬT SẮC KÝ KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) 13

1.7.1 Nguyên tắc hoạt động 13

1.7.2 Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ 14

1.7.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 17

1.8 CÁC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG DỊCH SINH HỌC 19

1.8.1 Ngoài nước 19

1.8.2 Trong nước 25

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 29

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký và lựa chọn chất chuẩn nội 29

2.3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 30

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 31

2.3.5 Phương pháp tính toán kết quả 41

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, BÀN LUẬN 43

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43

3.1.1 Điều kiện khối phổ 43

3.1.2 Điều kiện sắc ký và xác định chất chuẩn nội 44

3.1.3 Phương pháp xử lý mẫu 48

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 50

3.2.1 Tính tương thích hệ thống 51

3.2.2 Tính đặc hiệu – chọn lọc 51

3.2.3 Ảnh hưởng của nền mẫu 53

3.2.4 Độ nhiễm chéo 54

3.2.5 Tính tuyến tính và miền giá trị 55

3.2.6 Giới hạn định lượng dưới 58

3.2.7 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 59

3.2.8 Hiệu suất chiết 64

3.2.9 Độ ổn định 66

3.2.10 Hệ số pha loãng 77

3.3 BÀN LUẬN 79

3.3.1 Phương pháp phân tích 79

3.3.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 80

3.3.3 Phương pháp xử lý mẫu và tỷ lệ thu hồi 80

3.3.4 Thẩm định phương pháp 81

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84

4.1 KẾT LUẬN 84

4.2 KIẾN NGHỊ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT Ký hiệu, chữ

viết tắt Từ nguên tiếng anh Nghĩa tiếng Việt

1 ADH Antidiuretic Hormon Hormon chống bài niệu

2 APCI Atmospheric Pressure

Chemical Ionization Ion hóa ở áp suất khí quyển

3 CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

5 CV % Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

8 DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid

9 DPP-4 Dipeptidyl peptidase 4 Enzym DPP-4

10 DQC Dilution quality control – Kiểm soát chất lượng pha loãng

11 EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý Dược phẩm châu Âu

12 ESI Electron spray ionization Sự ion hóa phun sương điện tử

15 GLP Glucagon-like peptide Peptid có cấu trúc tương tự glucagon

16 HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

17 HQC High Quality Control Mẫu kiểm chứng ở nồng độ cao

20 ISO/IEC17025

International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission 17025

Tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

21 IUPAC International Union of Pure and

-Tandem Mass Spectrometry Sắc ký lỏng - Khối phổ 2 lần

24 LLE Liquid - Liquid Extraction Chiết lỏng - lỏng

25 LLOQ The Lower Limit of

Quantitation Giới hạn định lượng dưới

26 LQC Low Quality Control Mẫu kiểm chứng ở nồng độ thấp

27 MBTFA N-methyl bis

trifluoroacetamide N-methyl bis trifluoroacetamid

29 MQC Middle Quality Control Mẫu kiểm chứng ở nồng độ trung bình

30 MRM Multiple Reaction Monitoring Theo dõi đa phản ứng

35 PP Protein Precipitation Phương pháp tủa protein

38 Q-TOF Quadrupole - Time of Flight Đầu dò tứ cực - Thời gian bay

39 Q-TRAP Quadrupole Linear Ion Trap Tứ cực bẫy ion

45 SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulphat

47 SPE Solid-phase Extraction Chiết pha rắn

48 SRM Selected Reaction Monitoring Theo dõi phản ứng được lựa chọn

53 UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

54 US-FDA U.S Food and Drug

Administration

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

55 ULOQ Upper limit of quantification Giới hạn định lượng trên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của metformin 3

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của glimepirid 5

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của glipizid 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của gliclazid 8

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của glibenclamid 8

Hình 1.6: Quy trình xử lý mẫu SPE [64] 12

Hình 1.7: Sơ đồ và nguyên lý hoạt động thiết bị khối phổ [25] 13

Hình 1.8: Sơ đồ cấu tạo LC-Q-TOF-MS/MS [50] 16

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát điều kiện phân mảnh MS/MS 44

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn, chuẩn nội khảo sát chương trình rửa giải đẳng dòng: 45

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn, chuẩn nội khảo sát chương trình rửa giải đẳng dòng: 45

Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát chất chuẩn nội glipizid, gliclazid, glibenclamid phân tích đồng thời với metformin, glimepirid trong điều kiện sắc ký cột BEH C18 (50 × 2,1 mm; 1,7 µm); Hệ dung môi 0,1% acid formic trong acetonitril và 0,1% acid formic trong nước chế độ gradient; tốc độ dòng 0,3 ml/min 46

Hình 3.5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, chuẩn nội khảo sát tốc độ dòng 0,25 ml/ phút 47

Hình 3.6: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, chuẩn nội khảo sát tốc độ dòng 0,30 ml/ phút 47

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, chuẩn nội khảo sát tốc độ dòng 0,35 ml/ phút 48

Hình 3.8: Hiệu suất chiết của các phương pháp xử lý mẫu khác nhau 49

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu huyết tương có pha MET, GLM và IS ở mức nồng độ MQC (nồng độ MET khoảng 37,5 ng/ml và GLM khoảng 12,5 ng/ml): (a) của MET; (b) của IS và (c) của GLM 51

Hình 3.10: Sắc ký đồ đại diện lần lượt cho các mẫu huyết tương trắng, zero, LLOQ 52

Hình 3.11: Sắc ký đồ đại diện lần lượt cho các mẫu WS1 - WS8 57

Hình 3.12: Đường chuẩn trung bình: (a) MET, (b) GLM 57

Hình 3.13: Biểu đồ kiểm soát kết quả thẩm định độ đúng của MET 59

Hình 3.14: Biểu đồ kiểm soát kết quả thẩm định độ đúng của GLM 59

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các nghiên cứu dược động học của MET 3

Bảng 1.2. Các nghiên cứu dược động học của GLM 6

Bảng 1.3: So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA 17

Bảng 1.4: Một số phương pháp định lượng metformin trong dịch sinh học 19

Bảng 1.5: Một số phương pháp định lượng glimepirid trong dịch sinh học 21

Bảng 1.6: Một số phương pháp định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong dịch sinh học 23

Bảng 2.1: Danh sách chất đối chiếu sử dụng cho nghiên cứu 27

Bảng 2.2: Danh sách dung môi, hóa chất sử dụng cho nghiên cứu 27

Bảng 2.3: Danh sách các lô huyết tương người sử dụng cho nghiên cứu 28

Bảng 2.4: Danh mục thiết bị nghiên cứu 28

Bảng 2.5: Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc để pha dãy chuẩn 33

Bảng 2.6: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc để pha mẫu QC 33

Bảng 2.7: Cách chuẩn bị đường chuẩn 34

Bảng 2.8: Cách chuẩn bị mẫu kiểm tra 34

Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh MS/MS 43

Bảng 3.2: Chương trình rửa giải gradient 46

Bảng 3.3: Phân tích ANOVA so sánh hiệu suất chiết của các phương pháp xử lý mẫu 49

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống 51

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của mẫu trắng trùng với thời gian lưu của MET, GLM và IS 52

Bảng 3.6: Kết quả thẩm định ảnh hưởng của nền mẫu – LQC 53

Bảng 3.7: Kết quả thẩm định ảnh hưởng của nền mẫu – HQC 53

Bảng 3.8: Kết quả thẩm định độ nhiễm chéo 54

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định tính tuyến tính của GLM 55

Bảng 3.10: Kết quả thẩm định tính tuyến tính của MET 55

Bảng 3.11: Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới – LLOQ 58

Bảng 3.12: Kết quả thẩm định độ đúng MET (LLOQ, LQC) 60

Bảng 3.13: Kết quả thẩm định độ đúng MET (MQC, HQC) 60

Bảng 3.14: Kết quả thẩm định độ đúng GLM (LLOQ, LQC) 61

Bảng 3.15: Kết quả thẩm định độ đúng GLM (MQC, HQC) 61

Bảng 3.16: Kết quả thẩm định độ đúng của MET khác ngày (LLOQ, QCs) 62

Bảng 3.17: Kết quả thẩm định độ đúng của GLM khác ngày (LLOQ, QCs) 63

Bảng 3.18: Kết quả thẩm định hiệu suất chiết IS 64

Bảng 3.19: Kết quả thẩm định hiệu suất chiết MET 65

Bảng 3.20: Kết quả thẩm định hiệu suất chiết GLM 65

Bảng 3.21: Kết quả độ ổn định mẫu LQC của MET sau 4h ở bơm mẫu tự động 66

Bảng 3.22: Kết quả độ ổn định mẫu HQC của MET sau 4h ở bơm mẫu tự động 67

Bảng 3.23: Kết quả độ ổn định mẫu LQC của GLM sau 4h ở bơm mẫu tự động 67

Bảng 3.24: Kết quả độ ổn định mẫu HQC của GLM sau 4h ở bơm mẫu tự động 68

Bảng 3.25: Kết quả độ ổn định mẫu LQC của MET sau 6h ở nhiệt độ phòng 68

Bảng 3.26: Kết quả độ ổn định mẫu HQC của MET sau 6h ở nhiệt độ phòng 69

Bảng 3.27: Kết quả độ ổn định mẫu LQC của GLM sau 6h ở nhiệt độ phòng 69

Bảng 3.28: Kết quả độ ổn định mẫu HQC của GLM sau 6h ở nhiệt độ phòng 70

Bảng 3.29: Kết quả độ ổn định mẫu LQC sau 3 chu kỳ đông – rã đông đối với MET 70

Bảng 3.30: Kết quả độ ổn định mẫu HQC sau 3 chu kỳ đông – rã đông đối với MET 71

Bảng 3.31: Kết quả độ ổn định mẫu LQC sau 3 chu kỳ đông – rã đông đối với GLM 71

Bảng 3.32: Kết quả độ ổn định mẫu HQC sau 3 chu kỳ đông – rã đông đối với GLM 72

Bảng 3.33: Kết quả độ ổn định mẫu LQC sau thời gian bảo quản 15, 30 ngày đối với MET 73

Bảng 3.34: Kết quả độ ổn định mẫu HQC sau thời gian bảo quản 15, 30 ngày đối với MET 74

Bảng 3.35: Kết quả độ ổn định mẫu LQC sau thời gian bảo quản 15, 30 ngày đối với GLM 75

Bảng 3.36: Kết quả độ ổn định mẫu HQC sau thời gian bảo quản 15, 30 ngày đối với GLM 76 Bảng 3.37: Kết quả thẩm định độ pha loãng mẫu 77

Bảng 3.38: Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp 77

Bảng 3.39: So sánh với phương pháp LC-MS/MS khác áp dụng định lượng đồng thời MET và GLM trong dịch sinh học 82

MỞ ĐẦU

Bệnh đái tháo đường tuýp 2 là một rối loạn chuyển hóa phức tạp gây ra bởi hainguyên nhân chính là suy giảm bài tiết insulin và suy giảm hoạt động của insulin ởngoại vi [10], [48] Việc điều trị dựa trên đánh giá lâm sàng và sinh hóa của bệnhnhân, ban đầu, bệnh nhân nên thay đổi lối sống, duy trì chế độ ăn uống lành mạnh vàtham gia các luyện tập về thể chất thường xuyên [33] Khi chỉ điều chỉnh lối sốngkhông làm thay đổi hay chưa đạt được mục tiêu đường huyết thì sẽ kết hợp các thuốcđiều trị ĐTĐ dùng đường uống [36]

Metformin, một loại thuốc thuộc nhóm biguanid, thường là lựa chọn đầu tiên để kiểmsoát ĐTĐ vì hiệu quả cao, chi phí thấp, khả năng ngăn ngừa tăng cân và giảm nguy

cơ hạ đường huyết [3], [43] Tuy nhiên, đối với những bệnh nhân có mức HbA1c cao(HbA1c ≥ 9,0) hoặc những người không đáp ứng với metformin sau ba tháng điều trị,nên sử dụng kết hợp một thuốc uống thứ hai [8], [24], [36] Việc kết hợp thuốc đểđiều trị ĐTĐ tùy thuộc vào đặc điểm cá nhân của bệnh nhân, tính chất dược lý củathuốc và tính phổ biến, sẵn có của các nhóm thuốc trên thị trường, nó có thể thay đổitheo từng quốc gia [30] Khuyến cáo rằng metformin nên được kết hợp với một tácnhân của một trong các nhóm trị liệu này: sulfonylurea, thiazolidinedion hoặc thuốc

ức chế DPP-4 [8], [28], [30]

Glimepirid là một thuốc hạ đường huyết sulfonylurea, glimepirid có tác dụng hiệpđồng với metformin [3], chế phẩm kết hợp của glimepirid và metformin đã được FDAphê duyệt năm 1999 [41] Việc sử dụng dạng viên kết hợp của các thuốc điều trị ĐTĐgiúp bệnh nhân thuận tiện và tuân thủ đúng các phác đồ trị liệu

Chế phẩm generic kết hợp giữa metformin và glimepirid vẫn còn khá mới mẻ và chưa

có nhiều công ty sản xuất ở Việt Nam Một số chế phẩm lưu hành đang lưu hành trênthị trường dược phẩm hiện nay như: Perglim M-2 (2 mg/500 mg), Co Miaryl (2mg/500 mg) … Vì vậy, việc nghiên cứu dạng bào chế thay thế (thuốc generic), giúpgiảm giá thành, cũng như hiệu quả kinh tế đang ngày càng được quan tâm nghiên cứunhiều hơn

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng đồng thời metformin, glimepiridtrong các mẫu sinh học bằng kỹ thuật LC-MS/MS như [4], [15], [17], [65] Tuynhiên, cho đến nay, ở Việt Nam chưa có quy trình định lượng đồng thời metformin

và glimepirid trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS được công bố

Từ thực tế đó, đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời glimepirid và metformin trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS” là cơ sở để phục

vụ cho việc đánh giá tương đương sinh học chế phẩm generic hoặc theo dõi nồng độthuốc cho trị liệu sau này

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng qui trình định lượng đồng thời glimepirid và metformin trong huyết

tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS.

2 Thẩm định qui trình định lượng đồng thời glimepirid và metformin trong huyếttương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của FDA và EMA.

- Danh pháp IUPAC: 1-carbamimidamido-N,N-dimethylmethanimidamid

- Số CAS (Chemical Abstracts Service – CAS): 657-24-9

- Khối lượng phân tử: 129,16364 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của metformin

Bảng 1.1 Các nghiên cứu dược động học của MET

STT C max (ng/ml) AUC (ng*h/ml) t max (h) TLTK

1.1.4 Chống chỉ định

- Quá mẫn với metformin hoặc với bất cứ thành phần nào của thuốc

- Người bệnh có trạng thái dị hóa cấp tính, nhiễm khuẩn, chấn thương phải đượcđiều trị tiểu đường bằng insulin

- Giảm chức năng thận do bệnh thận, hoặc rối loạn chức năng thận (creatininhuyết thanh ≥ 1,5 mg/dl ở nam, ≥ 1,4 mg/dl ở nữ), hoặc có thể do những tìnhtrạng bệnh lý như trụy tim mạch, nhồi máu cơ tim cấp tính và nhiễm khuẩnhuyết gây nên

- Bệnh nhân suy thận nặng (mức lọc cầu thận eGFR < 30 ml/min/1,73 m2)

- Bệnh nhân toan chuyển hóa cấp tính hoặc mãn tính, bao gồm cả nhiễm toanceton do tiểu đường

- Bệnh gan nặng, bệnh tim mạch nặng, bệnh hô hấp nặng với giảm oxy huyết

- Suy tim sung huyết, trụy tim mạch, nhồi máu cơ tim cấp tính

- Bệnh phổi thiếu oxy mạn tính

- Nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn huyết

- Người mang thai phải điều trị bằng insulin, không dùng metformin

1.1.5 Tác dụng phụ

Những tác dụng không mong muốn thường gặp nhất của metformin là về tiêu hóa:thường gặp là chán ăn, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đầy thượng vị, táo bón, ợ nóng, giảm

Trans-3-ethyl-2,5-dihydro-4-methyl-N-[2-[4-[[[[trans-4 Khối lượng phân tử: 490,63 g/mol.

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của glimepirid

1.2.2 Dược động học

- Glimepirid có sinh khả dụng rất cao Thức ăn không làm thay đổi đáng kể sựhấp thu của thuốc, nhưng tốc độ hấp thu có chậm hơn Nồng độ tối đa tronghuyết tương đạt được khoảng 2,5 giờ sau khi uống thuốc

Bảng 1.2 Các nghiên cứu dược động học của GLM

STT Cmax (ng/ml) AUC (ng*h/ml) tmax (h) TLTK

- Mẫn cảm với glimepirid, sulfonylurea hay sulfonamid

- Tiểu đường phụ thuộc insulin, hôn mê, nhiễm keto-acid do tiểu đường

- Rối loạn chức năng gan hoặc chức năng thận

- Phụ nữ có thai và cho con bú

1.2.5 Tác dụng phụ

- Hạ glucose huyết, chóng mặt, suy nhược, đau đầu, buồn nôn

- Nôn, đau dạ dày – ruột và tiêu chảy Một số hiếm trường hợp, có thể có tăngnồng độ enzym gan Một vài trường hợp riêng biệt có thể bị suy giảm chứcnăng gan (ứ mật và vàng da) cũng như viêm gan

- Rối loạn chuyển hóa porphyrin da, nhạy cảm với ánh sáng và viêm mạch dị ứng.

- Những thay đổi trong điều tiết mắt và/ hoặc nhìn mờ.

1.3 GLIPIZID

- Công thức phân tử: C21H27N5O4S

- Số CAS: 29094-61-9

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của glipizid

- Danh pháp IUPAC: N- [2 - [4 - (cyclohexylcarbamoylsulfamoyl)phenyl]ethyl]

- 5 - methylpyrazine – 2 - carboxamid

- Khối lượng phân tử: 445,54 g/molTính tan: không tan trong nước và ethanol 96 %, rất khó tan trong methylen clorid vàaccton, tan trong các dung dịch kiềm loãng [2]

1.4 GLICLAZID

- Công thức phân tử: C15H21N3O3S

- Số CAS: 21187-98-4

- Danh pháp IUPAC: 1 - (3,3a,4,5,6,6a-hexahydro - 1H – cyclopenta [c] pyrrol

- 2 - yl) - 3 - (4 - methylphenyl) sulfonylurea

- Khối lượng phân tử: 323,4 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của gliclazid

Tính tan: không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, hơi tan trong aceton, khó tantrong ethanol 96 % [2]

- Khối lượng phân tử: 494,004 g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của glibenclamid

Tính tan: không tan trong nước, ít tan trong methylen clorid, hơi tan trong ethanol 96 % vàmethanol [2]

1.6 PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC

1.6.1 Phương pháp thường áp dụng phân tích thuốc trong dịch sinh học

Thuốc sau khi được tách loại khỏi các thành phần của dịch sinh học, được tiến hànhđịnh lượng bằng các kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào các đặc điểm hóa lý của dượcchất cần phân tích, đặc điểm của mẫu thu được sau khi chiết tách (kỹ thuật xử lýmẫu), cũng như các đặc điểm, nguyên lý của các phương pháp phân tích Để địnhlượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) thường sử dụng các

ổn định cũng như dễ triển khai hơn [35] Đối với các dược chất không phân cực, dễbay hơi và bền với nhiệt có thể phân tích bằng phương pháp GC [44] Những dượcchất phân cực hoặc ít phân cực, không bền với nhiệt thường được phân tích bằngphương pháp HPLC hoặc CE [72] Trong các phương pháp hóa lý, tùy thuộc vàonồng độ, cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, khả năng hấp thụ UV-Vis, khả năng pháthuỳnh quang… của chất phân tích mà lựa chọn đầu dò phù hợp để phát hiện Đối vớinhững mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất ở ngưỡng thấp (ng/ml), phương phápphân tích khối phổ (MS), đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) vì phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao [23], [71], [73].

1.6.2 Các kỹ thuật xử lý, tách chiết dược chất trong mẫu

Các mẫu dịch sinh học với các đặc điểm như nền mẫu phức tạp, nồng độ dược chấtthường rất nhỏ Vì vậy mẫu cần phải được chiết tách, xử lý để loại bỏ các tạp chất và

có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ bền cũng như độ nhạycủa thiết bị phân tích Việc lựa chọn kỹ thuật xử lý mẫu cần phải căn cứ vào đặc điểmhóa lý của hoạt chất, đặc điểm mẫu sinh học và đặc điểm của phương pháp phân tích.Hiện nay, để xử lý mẫu dịch sinh học, người ta hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là:tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [45], [53], [64] Ngoài ra, trong một sốtrường hợp, các tác giả có thể sử dụng đồng thời hai hoặc cả ba kỹ thuật xử lý mẫu cơbản nêu trên để tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu

Kỹ thuật tủa protein

Tủa protein (Protein Precipitation – PP) là phương pháp đơn giản để chiết các chấtphân tích khỏi nền mẫu Các tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học sử dụngphổ biến như dung môi hữu cơ, muối vô cơ, acid và nhiệt độ

Tủa protein bằng dung môi hữu cơ: acetonitril, methanol… ngăn cản sự phân tán củacác phân tử protein trong môi trường làm giảm độ hòa tan của protein và xảy ra kết tủa

- Tủa protein bằng muối vô cơ: Một số muối như ammoni sulfat, natri clorid,

… vừa làm trung hòa điện tích, vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử proteingây ra hiện tượng tủa protein

- Tủa protein bằng các tác nhân acid: trichloroacetic, trifluoracetic (3 % – 5 %),percloric (15 %) so với lượng mẫu Tuy nhiên, gây tủa protein bằng acid được

áp dụng cho những hoạt chất dễ tan trong nước và bền với acid

Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm thực hiện đơn giản, độ lặp cao và tốn ít dung môi.Tuy nhiên, kỹ thuật này do chỉ có thể loại bỏ được một phần protein và peptid nênmẫu sau khi xử lý có nhiều thành phần tạp chất có thể làm tăng áp suất ngược trên hệthống sắc ký ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột phân tích và gây nhiễu đường nền, ảnhhưởng đến kết quả xác định nồng độ dược chất có trong mẫu khi phân tích bằng cácphương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp LC – MS [45], [53], [64]

Kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng

Chiết lỏng – lỏng (Liquid – Liquid Extraction – LLE) là phương pháp được dùng phổbiến để chuyển chất phân tích hoà tan trong một dung môi này sang dung môi khác

không đồng tan Thực tế, thường dùng nước và dung môi hữu cơ (n-hexan,

diethylether, dicloromethan…) để loại bớt tạp trong các mẫu dịch sinh học Hiệu suấtchiết hoạt chất từ pha nước phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết;tính phân cực của dung môi chiết; pH của pha nước; hệ số/hằng số phân bố của hoạtchất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau Để tăng hiệu suất chiết hoạt chất từpha nước có thể áp dụng những giải pháp sau [45], [53], [64]:

- Thay đổi dung môi hữu cơ chiết (có thể phối hợp một vài dung môi hữu cơkhác nhau theo các tỷ lệ khác nhau) hoặc tăng thể tích dung môi chiết

- Nếu chất phân tích ở dạng ion hoặc có khả năng ion hóa, hệ số phân bố củadược chất có thể tăng lên bằng cách ức chế sự ion hóa của bản thân chất đó

Ngoài ra, có thể tiến hành chiết nhiều lần, chiết ngược hoặc chiết liên tục để tăng hiệusuất chiết hoạt chất của quy trình Tuy vậy, cần căn cứ vào số lượng mẫu, thể tíchmẫu, điều kiện áp dụng quy trình chiết, thời gian thực hiện quy trình chiết… để cóthể xây dựng được quy trình chiết phù hợp Với kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, mẫu thuđược tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất, đơngiản, dễ thực hiện phù hợp với điều kiện và các thiết bị ở hầu hết các phòng thínghiệm Tuy vậy, kỹ thuật chiết lỏng – lỏng cũng có một số nhược điểm như: sử dụngnhiều dung môi ảnh hưởng tới môi trường và sức khỏe người phân tích, kỹ thuật chiếtlỏng – lỏng mất nhiều thời gian, cần phải bay hơi dung môi chiết trước khi phân tích,nhũ tương có thể hình thành trong quá trình chiết gây sai lệch kết quả phân tích Hiệnnay, chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật xử lý mẫu được dùng phổ biến để chiết chất phântích trong nền mẫu huyết tương [64], [66].

Kỹ thuật chiết pha rắn

Nguyên lý của chiết pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE) tương tự như chiết lỏng– lỏng, đó là dựa vào sự phân bố của chất tan vào hai pha không trộn lẫn với nhau

Kỹ thuật SPE dựa vào sự phân bố giữa một pha lỏng (nền mẫu hoặc dung dịch chấtphân tích) và một pha rắn (chất hấp phụ) Các chất phân tích có thể được hấp phụ vàopha rắn hoặc giữ lại trong pha lỏng khi nó đi qua pha rắn Khi hai pha cân bằng, chúng

có thể tách ra nhờ gạn, lọc, ly tâm hoặc một quá trình khác tương tự Nếu chất phântích bị hấp phụ trên bề mặt pha rắn, chúng có thể được rửa giải bằng cách sử dụng

dung môi phù hợp [45], [55], [64] Các giai đoạn chính của kỹ thuật chiết SPE được

mô tả ở Hình 1.6

Hình 1.6: Quy trình xử lý mẫu SPE [64]

Quy trình chiết SPE bao gồm 4 bước chính:

- Hoạt hóa cột bằng các dung môi hoặc dung dịch đệm thích hợp

- Nạp mẫu: mẫu được hòa tan trong dung môi và cho chảy qua cột

- Rửa: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho chảy qua cột để loại tạp

- Rửa giải: dùng dung môi thích hợp để đẩy chất phân tích ra khỏi cột

Trong kỹ thuật SPE, sự tương tác giữa hoạt chất cần phân tích, pha tĩnh và phađộng quyết định hiệu suất chiết của quy trình Cơ chế lưu giữ chính trong SPE có thểdựa trên lực Van der Waals, lực liên kết hydro, tương tác phân cực và tương tác điệntích Mỗi chất hấp phụ đều mang một nhóm thuộc tính riêng mà có thể áp dụng đểgiải quyết các vấn đề khác nhau trong xử lý mẫu Tùy thuộc vào bản chất của chấtphân tích mà người ta sử dụng các loại cột chứa pha tĩnh có bản chất khác nhau vàcác hệ dung môi khác nhau để chiết tách [45], [55], [64] Các pha tĩnh và cơ chế liênkết, rửa giải của SPE tương tự như HPLC

Do có nhiều loại cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù hợp với chất phân tíchnên kỹ thuật chiết SPE thường cho hiệu suất chiết cao, ổn định, lặp lại, nền mẫu sạch

ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng bởi nền mẫu Đồng thời, hệ số làm giàu mẫu của kỹthuật SPE thường cao hơn rất nhiều so với các kỹ thuật xử lý mẫu khác (trong kỹthuật SPE, thể tích của pha rắn thường nhỏ hơn nhiều lần so với pha lỏng) Kỹ thuật

SPE chỉ sử dụng một lượng dung môi nhỏ để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột,

an toàn, ít độc hại với môi trường và nhân viên phân tích hơn Kỹ thuật SPE thíchhợp để tự động hóa, xử lý cùng lúc nhiều mẫu Tuy vậy, kỹ thuật SPE cũng có một

số nhược điểm như: khó lưu giữ chất phân cực mạnh (không thích hợp để phân tíchcác chất dễ tan, tan hoàn toàn trong nước; chất phân tích ở dạng ion…); tính chọn lọcchỉ dựa vào tương tác phân cực, tương tác kỵ nước, chưa dựa vào đặc điểm của chấtphân tích nên hiệu suất và tính đặc hiệu của kỹ thuật chiết chưa cao; cột chiết pha rắnđắt tiền, nên chi phí phân tích cao [45], [55], [64]

1.7 KỸ THUẬT SẮC KÝ KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

1.7.1 Nguyên tắc hoạt động

Phương pháp phân tích phổ khối (MS) là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng vàđiện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý của phương pháp này được trình bày ở Hình 1.7 [25]

Hình 1.7: Sơ đồ và nguyên lý hoạt động thiết bị khối phổ [25]

Tùy thuộc vào cấu tạo của chất cần phân tích và cơ chế, kỹ thuật ion hóa được sửdụng mà chất cần phân tích có trong mẫu có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểuphân tích điện hoặc bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân tử để hình thành các ion hoặccác tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn Hỗn hợp các ion, tiểu phân mangđiện hình thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối.Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác nhau sẽ chuyểnđộng có hướng với tốc độ và quỹ đạo chuyển động khác nhau Tốc độ, quỹ đạo chuyển

động của ion phụ thuộc vào cường độ điện trường của bộ phận phân tích khối; điệntích và khối lượng của ion Do vậy, sau khi phân tích khối, các ion trong hỗn hợp sẽđược phân tách riêng thành từng loại Mỗi loại ion được phân tách sẽ được bộ phậnphát hiện ghi nhận thành từng vạch phổ tương ứng trên phổ đồ [25], [22], [11]

Đối với hợp chất hữu cơ, sự ion hoá phân tử trung hoà ban đầu thành các ion/phân tửmang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao như chùm electron hay cácgốc tự do,… xảy ra theo một trong các cách như sau:

- Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích:

ABCD + e → ABCD+ + 2e (> 95 %) hoặc

1.7.2 Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ

Một thiết bị phân tích MS bao gồm các bộ phận chính: bộ nạp mẫu (inlet), bộ nguồn ion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện – đếm lượng ion (detector – đầu dò) và bộ phận ghi/xử lý số liệu (data system).

Bộ phận nạp mẫu: Chuyển mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị MS.

Tùy thuộc vào trạng thái vật lý của mẫu cần phân tích mà có thể nạp mẫu trực tiếpvào thiết bị MS hoặc nạp mẫu gián tiếp thông qua các thiết bị phân tích kết hợp, ghépnối như GC, HPLC hoặc CE Căn cứ vào thiết bị phân tích ghép nối, mà người ta chia

thành các phương pháp như GC-MS, LC-MS hay CE-MS [11], [25], [22].

Nguồn ion hoá: Nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân tích thành các

ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau Các ion tạothành sẽ được tăng tốc độ, thu gọn (hội tụ) để đi vào bộ phận phân tích phổ khối, cònnhững tiểu phân, dung môi,… không bị ion hóa, không mang điện sẽ bị hút ra khỏibuồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS Có nhiều loại nguồn ion hoá, sửdụng các kỹ thuật ion hoá khác nhau được dùng trong các thiết bị MS như: ion hóa

va chạm điện tử; ion hóa điện trường, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa

phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization),… Tùy thuộc đặc điểm của chất

cần phân tích, đặc điểm của thiết bị phân tích ghép nối mà các nguồn ion hóa với các

kỹ thuật ion hóa khác nhau được lựa chọn [11], [22], [25], [47]

Bộ phân tích khối: Tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt

nhờ tác dụng của điện trường Bộ phận phân tích khối của thiết bị MS gồm nhiều loạinhư: cung từ, tứ cực, tứ cực kép, bẫy ion và phân tích thời gian bay Các bộ phân tíchkhối có cấu tạo không giống nhau, nhưng đều hoạt động dựa trên nguyên lý cung cấpmột điện trường biến thiên với tần số xác định để điều chỉnh quỹ đạo và tốc độ chuyểnđộng của các ion trên cơ sở đó phân tách các ion có tỷ số m/z khác nhau [25], [22],[11] Hiện nay, để tăng cường độ nhạy, độ phân giải hoặc độ chính xác phổ khối, một

số thiết bị MS thường ghép nối giữa hai hoặc nhiều bộ phân tích khối nêu trên với

nhau [63] Các thiết bị MS kiểu tứ cực kép, bẫy ion và phân tích thời gian bay có thể

tiến hành phân tích phổ khối lượng 2 hoặc nhiều lần (MS/MS) trong đó lần phân tíchkhối thứ nhất lựa chọn ion ban đầu (ion mẹ) với m/z xác định, lần phân tích khối tiếptheo xác định số khối của các ion tạo thành (ion con) khi phân mảnh ion mẹ

Trong số các phương pháp LC-MS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nốivới đầu dò khối phổ kiểu tứ cực kép (LC-MS/MS hoặc HPLC-MS/MS hoặc LC-Q-TOF-MS/MS) với nguồn ion hóa phun sương điện tử có độ đặc hiệu-chọn lọc tốt và

độ nhạy cao thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch sinh học[11], [20],[22], [25], [73]

Phương pháp LC-MS/MS sử dụng nguồn ESI có độ đặc hiệu chọn lọc và độ nhạy cao

là do kết hợp các ưu điểm của cả thiết bị ghép nối HPLC, và thiết bị phân tích phổ

khối hai lần với nguồn ESI Cơ chế hoạt động của thiết bị LC-MS/MS với nguồn ESInhư sau: HPLC/UPLC sẽ phân tách các hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phầntạp chất có trong dịch sắc ký, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với hoạtchất đi vào nguồn ESI Việc giảm số lượng các tiểu phân có mặt tại nguồn ion làmtăng hiệu suất ion hóa hoạt chất cần phân tích, do đó góp phần tăng độ nhạy củaphương pháp [11], [22], [25] Hình 1.8 minh họa sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng– khối phổ đầu dò tứ cực thời gian bay LC-Q-TOF-MS/MS [50]

Hình 1.8: Sơ đồ cấu tạo LC-Q-TOF-MS/MS [50]

Dòng ion đi qua tứ cực (Q – Quadrupole) sẽ phân tích khối lần thứ nhất lựa chọn ionban đầu (ion mẹ) có số khối m/z xác định Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion

nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Collision Cell Tại đây, ion mẹ chuyển động Brown, va

chạm với các phân tử khí argon (được cung cấp bổ sung vào Collision Cell với mộtlượng xác định, điều chỉnh được để khống chế tần suất va chạm) Nhờ va chạm, nănglượng động học của các ion được chuyển thành nội năng để phân mảnh ion mẹ tạo racác ion con Các ion con hình thành có số khối khác nhau được phân tách theo thờigian bay (TOF) trong môi trường chân không tuyệt đối Các hợp chất với cấu tạokhác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ chế phân mảnh và hình thành nên

Để định lượng, xác định nồng độ, hàm lượng của hoạt chất, có thể lựa chọn một hoặcmột vài số khối đặc trưng cho hoạt chất cần phân tích, thường chỉ lựa chọn một số khốiđặc trưng và có đáp ứng ổn định nhất trong quá trình phân tích (có thể là ion mẹ –phương pháp MS) hoặc một ion con (phương pháp MS/MS) và tiến hành so sánh cường

độ của số khối này trong mẫu thử với cường độ của nó trong một hoặc nhiều mẫu chuẩn(mẫu chứa chất chuẩn) đã biết nồng độ, hàm lượng [11], [20], [22], [25], [73]

1.7.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình nghiên cứu thực nghiệm xác địnhnhững đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đạt yêu cầuvới các ứng dụng phân tích thực tế và chứng minh phương pháp phân tích có đủ độnhạy, độ tin cậy để phân tích những mẫu thực theo US-FDA[5] và EMA [6][19]

Khi so sánh với quy định của US-FDA, quy định EMA có một số điểm khác biệt:

Bảng 1.3: So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA

Chỉ tiêu US-FDA 2018 EMA 2015

Tính đặc hiệu - Không ít hơn 6 lô mẫu sinh học trắng- LLOQ thấp nhất của chất phân tích đạt

độ đúng và chính xác

- Không ít hơn 6 lô mẫu sinh học trắng

- Độ nhiễu tại đáp ứng của chất phân tích ở LLOQ ≤ 20 %

- Độ nhiễu tại đáp ứng của chuẩn nội ≤ 5 %

Giới hạn định lượng dưới

- Điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ)

- Đáp ứng LLOQ ≥ 5 lần so với đáp ứng của mẫu trắng

chuẩn và khoảng

- Đường chuẩn ít nhất 6-8 mẫu với nền mẫu được xử lý gồm có chất phân tích và IS

- Đường chuẩn ít nhất 6 mẫu với nền mẫu được xử lý gồm có chất phân tích và IS

tuyến tính

- Ở LLOQ: CV % ≤ 20 % so với nồng độ thực và ≤ 15 % ở các nồng độ khác

- Ở LLOQ: CV % ≤ 20 % so với nồng độ thực và ≤ 15 % ở các nồng độ khác

- Xây dựng ít nhất 3 đường chuẩn Mẫu

kiểm tra (QC)

- Ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình, cao (LQC, MQC, HQC)

- Mẫu QC là mẫu độc lập với các mẫu của đường chuẩn

- Thực hiện ít nhất 3 nồng độ

- Độ đúng: CV % ở nồng độ LLOQ không lớn hơn ± 20 %; Ở nồng độ LOQ, MQC, HQC có CV % không lớn hơn ± 15 %

- Độ chính xác: CV % ở nồng độ LLOQ ≤

20 %; Ở nồng độ khác CV % ≤ 15 % Hiệu

suất chiết

- Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội phải ổn định, chính xác và có tính tái lặp

- Thực hiện ở 3 nồng độ: LQC, MQC và HQC

- Không đề cập

Độ ổn định

- Dung dịch chuẩn gốc, chuẩn nội

- Độ ổn định trong huyết tương:

+ Ngắn hạn + Dài hạn + Đông – rã đông + Sau khi xử lý mẫu

- Dung dịch chuẩn gốc, chuẩn nội

- Độ ổn định trong huyết tương ở nồng độ thấp và cao:

+ Ngắn hạn ở nhiệt độ phòng + Dài hạn (- 20 o C và - 70 o C) + Đông – rã đông

+ Sau khi xử lý mẫu Ảnh

hưởng của nền mẫu

Xem xét có sự thay đổi của nền mẫu hay không, để bảo đảm phương pháp phân tích không ảnh hưởng của nền mẫu

CV % của nền mẫu đối với chất phân tích

và IS không quá 15 % ở 3 lần LLOQ và HQC, tính trên 6 lô nền mẫu

Lượng mẫu tồn dư

- Không đề cập - Tiêm mẫu trắng ngay sau khi tiêm mẫu có

nồng độ cao

- Lượng mẫu tồn dư ≤ 20 % ở LLOQ và ≤ 5

% với chuẩn nội Ảnh

hưởng của sự pha loãng

- Pha loãng mẫu có nồng độ cao hơn ULOQ

- Độ đúng và độ chính xác của các mẫu pha loãng phải được thẩm định

- Pha loãng mẫu có nồng độ cao hơn ULOQ (thực hiện ít nhất 5 mẫu đối với mỗi hệ số pha loãng)

- Độ đúng và độ chính xác nằm trong khoảng ± 15 %.

1.8 CÁC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ

GLIMEPIRID TRONG DỊCH SINH HỌC

1.8.1 Ngoài nước

Hàm lượng thuốc trong dịch sinh học phụ thuộc rất nhiều yếu tố: cá thể, đường dùng,dạng thuốc, sinh khả dụng của mỗi thuốc, công thức của các nhà sản xuất khác nhau.Chính vì vậy, nghiên cứu định lượng thuốc trong dịch sinh học nói chung gặp nhiềukhó khăn Các phương pháp đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế phải có

đủ độ nhạy, độ tin cậy để phân tích những mẫu thực

Để phân tích thuốc trong dịch sinh học các tác giả chủ yếu thường sử dụng phươngpháp HPLC kết nối với đầu dò UV [12], [14], [37], [58], [60], [62], [69] hoặc MS[13], [16], [18], [21], [29], [32], [34], [52], [54], [56],[59] Ngoài ra, một số tác giảcũng nghiên cứu phân tích bằng phương pháp GC với đầu dò MS [61] hay một sốphương pháp khác như sắc ký micel điện động [38], [49]

Tóm tắt một số phương pháp phân tích MET và glimepirid (GLM) trong dịch sinh

học được trình bày ở các Bảng 1.4, Bảng 1.5 và Bảng 1.6 để so sánh các thông sốnhư: pha tĩnh (Stationary Phase – SP), pha động (Mobile Phase – MP), chuẩn nội(Internal Standard – IS), giới hạn phát hiện (Limit Of Detection – LOD) được thamkhảo từ các tài liệu tham khảo (TLTK) khác nhau

Bảng 1.4: Một số phương pháp định lượng metformin trong dịch sinh học

Phương pháp Tóm tắt phương pháp

Ghi tín hiệu (UV/MS)

Khoảng tuyến tính

LOD Nền

mẫu TLTK

UV

HPLC-SP: Cột cation (250 mm × 4,6 mm; 10

m); MP: dung dịch A: ammonium phosphat 0,05 mol/l, dung dịch B:

ammonium phosphat 0,4 mol/l; tốc độ

dòng 1 ml/min và 2 ml/min.

232 nm 0,1 - 40,0

mg/ml

0,05 mg/ml

Huyết tương

[69]

UV

Huyết tương

[14]

ml/min; IS: atenolol; Xử lý mẫu:

acetonitril/HCl.

UV

HPLC-SP: Cột C 18 (250 mm × 4,6 mm; 5

µm); MP: acetonitril, dung dịch đệm kali dihydrogen phosphat pH 6,5 (34 :

66, tt/tt) và 3 mM natri dodecyl sulfat;

tốc độ dòng 0,7 ml/min; Xử lý mẫu:

kiềm hóa bằng NaOH, chiết lỏng –

lỏng với n-butanol – n-hexan (50 : 50,

tt/tt).

236 nm 10

-5000 ng/ml

và 2 2000 μg/ml

-7,8 ng/ml

và 1,6 µg/ml

Huyết tương, nước tiểu

[12]

CE-UV Sử dụng dung dịch đệm phosphate 0,1

M (pH 2,5); điện áp tiêm: 10 kV/10

giây; điện áp chạy: 20 kV; IS:

phenformin; Xử lý mẫu: chiết lỏng –

lỏng với cloroform sử dụng cặp ion

(bromothymol blue).

195 nm 0,25 - 3,5

µg/ml

0,25 µg/ml

Huyết tương

[61]

GC-MS Tạo dẫn xuất bằng N-methyl bis

trifluoroacetamid (MBTFA).

MS (303 m/z)

100 3000 ng/ml

-40 ng/ml

Huyết tương

[68]

MS/MS

HPLC-SP: Cột Zorbax SB C 8 (150 mm × 4,6

mm, 5 µm); MP: acetonitril – nước – acid formic (70 : 30 : 1, tt/tt/tt), tốc độ

dòng 0,5 ml/min IS: diphenhydramin;

Xử lý mẫu: tủa protein với acetonitril.

MS/MS:

APCI, SRM

2 - 2000 ng/ml

2 ng/ml

Huyết tương

[13]

MS/MS

HPLC-SP: Cột RP (150 mm x 2 mm; 4 µm);

MP: dung dịch A: nước chứa 0,1 % acid formic (tt/tt) và 1 mM ammonium format; Dung dịch B: acetonitril 0,1 % acid formic (tt/tt), tốc độ dòng từ 0,2 -

0,4 ml/min ; Xử lý mẫu: tủa protein bằng methanol chứa 0,1 M ZnSO 4.

Q-TRAP MS/MS:

ESI, SRM

25 5000 µg/l

Huyết tương

[21]

MS/MS

HPLC-SP: Cột Capcell Pak SCX UG80 (2,0

mm × 20 mm, 5 µm); MP: dung dịch

A: 15 mM dung dịch ammonium acetat, dung dịch B: acetonitril, dung dịch C: acetonitril/15 mM dung dịch ammonium acetat (90 : 10, tt/tt) và dung dịch D: methanol – nước (50 :

50, tt/tt); IS: metformin D6; Xử lý mẫu: tủa protein với methanol

MS/MS:

ESI, SRM

10 - 1000 ng/ml

10 ng/ml

Huyết tương

[34]

MS/MS

UPLC-SP: Cột UPLC HSS (50 mm × 2,1

mm; 1,8 µm; MP: acetonitril có 10

mM ammonium format và dung dịch nước 0,2 % acid formic (rửa giải

gradient); IS: ketamin; Xử lý mẫu: tủa

protein với acetonitril.

MS/MS:

ESI, SRM

5 - 2000 ng/ml

2,3 ng/ml

Huyết tương

[54]

Bảng 1.5: Một số phương pháp định lượng glimepirid trong dịch sinh học

Phương pháp Tóm tắt phương pháp

Ghi tín hiệu (UV/MS)

Khoảng tuyết tính

LOD Nền

mẫu TLTK

UV

HPLC-SP: Cột Spherisorb ODS C 18 (125

mm × 4,6 mm; 5 µm); MP: dung dịch

A: 0,05 M dung dịch acid perchloric

và dung dịch B: acetonitril; Rửa giải:

gradient, tốc độ dòng 2 ml/min; IS:

glipirid III; Xử lý mẫu: chiết lỏng –

lỏng với dung môi diethyl ether, sau

đó xử lý với dimethylchlorosilan.

350 nm 6 - 1300

ng/ml

5 ng/ml

Huyết tương và nước tiểu

[37]

UV

hợp etanol và acetonitril sau đó loại

protein còn lại bằng tiền cột Pak MF Ph-1 trong hệ thống HPLC có van chia dòng, thời gian phân tích 43 phút.

228 nm 10 - 400

ng/ml

10 ng/ml

Huyết tương

[62]

MS

HPLC-SP: Cột LiChroCART (125 mm × 3,2

mm); MP: Dung dịch A: ammoni format (0,005 M, pH 3,0 bằng acid formic) và dung dịch acetonitril; Rửa

giải gradient dung môi và gradient tốc độ dòng từ 0,4 - 0,8 ml/min; IS:

trimipramin-D3; Xử lý mẫu: chiết

lỏng – lỏng với dung môi diethyl ether – ethyl acetat (1 : 1, tt/tt).

MS/

APCI

0,1 - 3 mg/l

0,01 mg/l

Huyết tương

[42]

HPLC – MS/MS

SP: Cột XTerra C 18 (50 mm × 2,1

mm; 5 µm); MP: Dung dịch gồm đệm amoni acetat (0,02 M, pH 3,5) – acetonitril – metanol (40 : 35 : 25,

tt/tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc độ 0,28 ml/min; IS: glibenclamid; Xử lý mẫu: chiết lỏng – lỏng với dung môi

diethyl ether.

ESI; Q- TRAP

MS/MS-5 - MS/MS-500 ng/ml

5 ng/ml

Huyết tương

[56]

HPLC – MS/MS

SP: Cột C 18 Capcell Pak (150 × 2,0 mm; 5,0 µm); MP: hỗn hợp

acetonitril – nước (chỉnh pH đến 3,5 bằng acid acetic) (80 : 20, tt/tt); Rửa

giải đẳng dòng ở tốc độ 0,2 ml/min;

IS: glipizid; Xử lý mẫu: cột SPE OASIS HLB (C 18 , 30 mg – Waters Co., Milford, USA) loại tạp bằng nước và rửa giải bằng 2 ml methanol.

MS/MS:

ESI, SRM

0,1 - 500 ng/ml

0,1 ng/ml

Huyết tương

[32]

MS/MS

HPLC-SP: Cột C 18 YMC-Pack Pro hãng Schermbeck, Germany (150 × 2,0 mm; 5,0 µm); MP: hỗn hợp

acetonitril – nước chứa 20 mM acid acetic (80 : 20, tt/tt); Rửa giải đẳng

dòng ở tốc độ 0,6 mL/min; IS:

glibenclamid; Xử lý mẫu: chiết phân

bố lỏng lỏng với hỗn hợp ethyl acetat – diethyl ether (50 : 50, tt/tt).

MS/MS:

ESI, SRM

1 - 500 ng/ml

1 ng/ml

Huyết tương

[16]

– MS/MS

HPLC-SP: Cột Hypersil ODS (250 × 4,6 mm; 5 µm); MP: hỗn hợp gồm

acetonitril – nước (0,05 M acid

formic) (72 : 28, tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc độ 0,3 ml/min; Xử lý mẫu:

chiết phân bố lỏng lỏng với hỗn hợp

1‐chlorobutan – isopropanol – ethyl acetat (88 : 2 : 10, tt/tt/tt).

MS/MS:

ESI, SRM

0,5 1000 ng/ml

-0,5 ng/ml

Huyết tương

[52]

MS/MS

HPLC-SP: Cột Hypurity C 18 hãng Thermo (150 × 2,1 mm; 5 μm); MP: hỗn hợp

gồm acetonitril – nước (1 g/l acid

formic) (50 : 50, tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc độ 0,3 ml/min; IS:

glisoxepid; Xử lý mẫu: chiết phân bố

lỏng lỏng với diethyl ether.

MS/MS:

Q-TRAP, ESI, SRM

15,6 1000 ng/ml

-0,98 ng/ml

Huyết tương

[27]

MEKC SP: Cột mao quản silica – polyimide

50 mm (chiều dài 27 hoặc 47 cm);

tách ở 25 kV (điện áp không đổi),

MP: dung dịch đệm natri borat có

chứa chất hoạt động bề mặt 50 mM natri dodecyl sulfat; IS: N-acetyl-4- (2,3-dichlorophenylureido)

[49]

MEKC Cột mao quản silica của hãng

MicroSolv (Eatontown, NJ, USA), chiều dài 48,5 cm; Dung dịch đệm chạy điện di chứa 50 mM natri borat điều chỉnh pH = 10,0 bằng dung dịch NaOH 0,1 M; Tiêm mẫu được thực hiện ở áp lực của 50 mbar Điện áp được áp dụng là + 20 kV; Xử lý mẫu:

Tủa protein với acetonitril được acid

hóa bằng HCl 1 M.

200 nm 6,9

-29,7 µmol/l

6,9 µmol/l

Huyết tương

[38]

Bảng 1.6: Một số phương pháp định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong dịch

sinh học

Phương pháp Tóm tắt phương pháp

Ghi tín hiệu (UV/MS)

Khoảng tuyết tính LOD

Nền mẫu TLTK

MS/MS

HPLC-SP: Cột C 18 (33 × 4,6 mm; 5

µm); MP: Hỗn hợp methanol – nước (0,5 % acid fomic) (8 : 2,

tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc

độ 0,6 ml/min; IS: piogletazon;

Xử lý mẫu: chiết phân bố lỏng

– lỏng với dichloromethan – isoamyl alcohol (9 : 1, tt/tt).

MS/MS, ESI, MRM

MET: 10 1500 ng/ml;

-GLM: 2,5

- 500 ng/ml

MET:

10 ng/ml;

GLM:

2,5 ng/ml

Huyết tương

[59]

MS/MS

LC-SP: Cột Alltima HP C 18 (50 × 4,6 mm; MP: Hỗn hợp

acetonitril – dung dịch 10 mM đệm ammoni acetat (pH 3);

Rửa giải đẳng dòng ở tốc độ

MS/MS, ESI, MRM

MET:

12,14 1207,50 ng/ml;

-GLM:

MET:

12,14 ng/ml;

GLM:

Huyết tương

[4]

1,1 ml/min; IS: carbamazepin;

Xử lý mẫu: Tủa protein bằng

dung môi acetonitril có kiềm hóa bằng dung dịch ammoniac.

4,97 494,29 ng/ml

-4,97 ng/ml

MS/MS

HPLC-SP: Cột PAK C 18 UG80 (3,0 ×

35 mm; 5 µm); MP: Hỗn hợp

methanol – dung dịch 10 mM đệm ammoni format (80 : 20,

tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc

độ 0,4 ml/min; IS: Glipizid; Xử

lý mẫu: Chiết phân bố lỏng –

lỏng với dung môi acetonitril

có acid hóa bằng 0,2 % acid formic.

MS/MS, ESI, MRM

MET: 5 2000 ng/ml;

GLM: 2 2400 ng/ml

-MET: 5 ng/ml;

GLM: 2 ng/ml

Huyết tương

[29]

Q-TOF- MS

UPLC-SP: Cột UPLC1 HSS Cyano (100 × 2,1 mm, 1,8 μm); MP:

Dung môi A: acetonitril, dung môi B: nước (0,1 % acid

fomic); Rửa giải gradient ở tốc

độ 0,6 ml/min; IS: isoniazid;

sulfaquinoxalin; Xử lý mẫu:

Phương pháp tủa protein với

acetonitril (có chứa 0,1 % acid

formic).

MS, ESI, MRM

MET: 250 -20000 ng/ml;

GLM: 125

- 10000 ng/ml

MET:

250 ng/ml;

GLM:

125 ng/ml

Huyết tương

[18]

HPLC- DAD

Rp-SP: Cột Magellen C 18 (5 μm,

150 mm × 4,60 mm); MP: Hỗn

hợp methanol và đệm KH 2 PO 4

0,025 M, điều chỉnh pH 3,2 bằng acid ortho-phosphoric

(85 : 15, tt/tt); Rửa giải đẳng dòng ở tốc độ 1 ml/min; Xử lý mẫu: Phương pháp tủa protein

với methanol.

235 nm MET,

GLM: 2,5

- 100 µg/ml

MET:

0,05 µg/ml;

GLM:

0,1 µg/ml

Huyết tương

[58]

UV

HPLC-SP: Cột Nucleosil, C 18 (25 × 0,46 cm; 10µm) MP: Hỗn hợp

acetonitril và dịch đệm phosphat (pH 4,3) (60 : 40,

GLM: 5 10000 ng/ml

-MET:

0,5 ng/ml;

GLM:

0,3 ng/ml

Huyết tương

[60]

Nhận xét:

Chiết phân bố lỏng – lỏng là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan trong một dungmôi sang một dung môi thứ hai không hoặc kém hòa tan trong dung môi thứ nhất.Trong thực nghiệm thường dùng hai pha nước – dung môi hữu cơ khác nước (khôngđồng tan trong nước) để chiết tách Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật đơn giản, dễ thựchiện và được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp xử lý mẫu có nền mẫutương đối phức tạp Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là sử dụng nhiều dungmôi, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch kết quả

Các chất nghiên cứu MET và GLM có độ phân cực tương đối lớn nên phần lớn cáctác giả thường chọn kỹ thuật gây tủa protein bằng các tác nhân như dung môi hữu cơ

(methanol, acetonitril) hay kết hợp vừa methanol hoặc acetonitril với tác nhân tủa protein khác như acid fomic, hydrochloric, percloric, tricloacetic… Ưu điểm của kỹ

thuật này là thao tác rất đơn giản, độ tái lập cao Tuy nhiên, mẫu sinh học xử lý theo

kỹ thuật này vẫn còn nhiều tác nhân ảnh hưởng (do một lượng protein tan nhất địnhtrong các dung môi xử lý)

Một số tác giả chọn làm giàu mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), kỹ thuật nàyhạn chế áp dụng với MET, nguyên nhân là MET phân cực mạnh nên khả năng lưugiữ trên cột là rất kém Để dùng kỹ thuật này các tác giả thường cho thêm chất tạocặp ion với MET để làm giảm tính phân cực của MET giúp tăng hiệu suất của phươngpháp Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục được các nhược điểm của chiết lỏng –lỏng Lượng dung môi sử dụng ít, có hệ thống tách chiết tự động và có khả năng kếtnối với GC và HPLC Kỹ thuật này có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp vớichất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn Tuy nhiên, nhược điểm là khó lưu giữ chất phâncực mạnh, khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu, thao tác và kỹ thuật tương đốiphức tạp, thời gian xử lý mẫu lâu, giá thành của phương pháp cao

1.8.2 Trong nước

Nguyên cứu trong nước còn rất hạn chế, chỉ các qui trình định lượng riêng lẽ METhoặc GLM Ngoài ra, có một số quy trình định đường đồng thời MET với một hoạtchất khác [1] Cho đến thời điểm này, chưa có công bố nào nghiên cứu định lượngđồng thời MET và GLM bằng LC-MS/MS trong dịch sinh học

Năm 2014, Đoàn Cao Sơn và cộng sự nghiên cứu xây dựng phương pháp

UPLC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và glibenclamid Kết quả: giá trị giới hạn định lượng dưới nhỏ (30 ng/ml cho metformin và 2,5 ng/ml cho glibenclamid xấp xỉ

bằng 1/30 giá trị Cmax, khoảng tuyến tính rộng từ 30 đến 3000 ng/ml đối với

metformin và 2,5 đến 250 ng/ml đối với glibenclamid, độ đúng cao, độ lặp lại với giátrị CV % nhỏ (91,5 % - 107,9 %; 3,4 % - 10,8 % và 92,1 % - 101,2 %; 0,9 % - 8,8

% lần lượt cho metformin và glibenclamid, phương pháp xử lý mẫu nhanh, đơn giản;

phương pháp phân tích có thể ứng dụng trong các nghiên cứu sinh khả dụng và tươngđương sinh học chế phẩm thuốc chứa đồng thời metformin và glibenclamid [1]

Nhận xét: Hiện nay, Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào định lượng đồng

thời MET và GLM trong dịch sinh học nói chung và trong huyết tương người nóiriêng bằng kỹ thuật LC/MS/MS

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Metformin hydrochlorid và glimepirid trong huyết tương người.

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Chất đối chiếu

Chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh

(metformin hydroclorid; glimepirid; gliclazid) và Viện Kiểm Nghiệm TW (glibenclamid, glipizid) Hàm lượng, số kiểm soát mỗi chất trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1: Danh sách chất đối chiếu sử dụng cho nghiên cứu

STT Tên Hàm lượng Số kiểm soát Viết tắt

1 Metformin hydroclorid 99,9 % QT168 060619 MET

4 Acid formic Tinh khiết phân tích Merck, Đức

5 Diethyl ether Tinh khiết phân tích Merck, Đức

3 Ethyl acetat Tinh khiết phân tích Merck, Đức