xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin và glimepirid trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc msms

Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ DƯƠNG ĐÌNH CHUNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG ĐÌNH CHUNG  XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC  2020 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG ĐÌNH CHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc -Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN THANH DŨNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên DƯƠNG ĐỈNH CHUNG Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Dương Đình Chung Thầy hướng dẫn: PGS.TS Phan Thanh Dũng Từ khóa: Metformin, glimepirid, glipizid, LC-MS/MS, plasma Mở đầu: Đề tài xây dựng quy trình định lượng đồng thời metformin glimepirid huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS với mục tiêu làm tiền đề việc đánh giá tương đương sinh học sinh khả dụng chế phẩm generic có chứa hai hoạt chất metformin glimepirid, góp phần nâng cao chất lượng thuốc sản xuất Việt Nam Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Huyết tương tự tạo chứa metformin glimepirid Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát so sánh phương pháp xử lý mẫu (tủa protein, chiết phân bố lỏng lỏng với dung môi ethyl acetat diethyl ether tỷ lệ : 1, tt/tt chiết pha rắn với cột Bond Elut C18 –100 mg/ml) Khảo sát chất chuẩn nội glibenclamid, gliclazid glipizid Kỹ thuật LCMS/MS áp dụng, thực ion hóa ESI+ thực ghi tín hiệu chế độ MRM Quy trình phân tích thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: Đã xác định phương pháp xử lý mẫu phương pháp tủa protein với dung mơi acetinitril có bổ sung 0,1% acid formic Chất chuẩn nội phù hợp glipizid iu kin sc ký: Ct UPLCđBEH C18 (50 ì 2,1 mm; 1,7 μm), nhiệt độ buồng cột: 40 oC; Thể tích tiêm mẫu: µl; Tốc độ dịng: 0,3 ml/min; Chế độ rửa giải gradient với hệ pha động thành phần gồm: kênh A chứa 0,1 % acid formic acetonitril; kênh B chứa 0,1 % acid formic nước Điều kiện khối phổ: ion hóa chế độ ESI (+), trình chuyển khối metformin từ 130,2 → 60,0 70,9 (m/z); glimepirid từ 491,3 → 352,1 126,0 (m/z); glipizid từ 446,2 → 99,9 321,0 (m/z) tương ứng với lượng cone 15, 30, 15 (V) Khoảng tuyến tính từ - 100 ng/ml cho metformin từ 0,25 - 25 ng/ml cho glimepirid với hệ số tương quan hồi quy r2 > 0,98 cho hai chất phân tích LLOQ phương pháp xác định độ đúng, độ lặp lại pic thu sắc ký đồ mẫu có nồng độ thấp đường chuẩn ng/ml cho metformin 0,25 ng/ml cho glimepirid Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời metformin glimepirid huyết tương người kỹ thuật LC-MS/MS áp dụng cho cơng tác đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học chế phẩm generic dạng phối hợp hai hoạt chất metformin glimepirid Master’s Thesis – Academic course: 2018 – 2020 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 ESTABLISH PROCESS SIMULTANEOUS DETERMINATION OF METFORMIN AND GLIMEPIRIDE IN PLASMA BY LC-MS/MS Duong Dinh Chung Supervisor: Assoc Prof Dr Phan Thanh Dung Keywords: Metformin, glimepirid, glipizid, LC-MS/MS, plasma Introduction: The simultaneous quantification of metformin and glimepiride in human plasma by LC-MS / MS technique was established with the aim to be a prerequisite for evaluating bioequivalence and bioavailability of generic products of active ingredients (metformin and glimepirid), contributing to improve the quality of drugs manufactured in Vietnam Materials and methods: Research subjects: Serum contained metformin and glimepirid Research method: The sample treatment methods (protein precipitation, liquid liquid distribution extraction with 1: solvent ethyl acetate and diethyl ether, tt / tt and solid phase extraction with Bond Elut column C18 –100 mg/ml) were surveyed and compared The glibenclamide, gliclazid and glipizid internal standards were investigated The LC-MS/MS technique with ionization by ESI + and signal recording by MRM mode was applied Analytical procedures were validated according to US-FDA and EMA guidelines Results: The method of treating samples by protein precipitation method with a solvent of acetinitril supplemented with 0.1% formic acid has been determined Glipizide was selected as a suitable internal standard Chromatographic conditions: UPLC®BEH C18 column (50 × 2.1 mm; 1.7 μm), column chamber temperature: 40 ° C; Sample injection volume: µl; Flow rate: 0.3 ml/min; The gradient elution mode with 2-component dynamic phase system includes: A channel contains 0.1% formic acid in acetonitril; Channel B contains 0.1% formic acid in water Mass spectrometric condition: ionization of ESI (+) mode, metformin block transition from 130.2 → 60.0 and 70.9 (m/z); glimepirid from 491.3 → 352.1 and 126.0 (m/z); glipizid from 446.2 → 99.9 and 321.0 (m/z), corresponding to cone energies of 15, 30, 15 (V) The linear range is from - 100 ng/ml for metformin and 0.25 - 25 ng/ml for glimepiride with a regression correlation coefficient r2 > 0.98 for both analytes The LLOQ of the method is determined by the accuracy, repeatability, and peak obtained on the chromatogram of the sample with the lowest concentration of the calibration curve of ng/ml for metformin and 0.25 ng/ml for glimepiride Conclusion: Simultaneous quantification of metformin and glimepiride in human plasma by LC-MS / MS technique can be applied to assess the bioavailability and bioequivalence of the combined generic products of two active ingredients including metformin and glimepirid MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 METFORMIN 1.2 GLIMEPIRID 1.3 GLIPIZID 1.4 GLICLAZID 1.5 GLIBEMGLAMID 1.6 PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1.6.1 Phương pháp thường áp dụng phân tích thuốc dịch sinh học 1.6.2 Các kỹ thuật xử lý, tách chiết dược chất mẫu 1.7 KỸ THUẬT SẮC KÝ KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) 13 1.7.1 Nguyên tắc hoạt động 13 1.7.2 Cấu tạo phận thiết bị phân tích khối phổ 14 1.7.3 Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 17 1.8 CÁC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG DỊCH SINH HỌC 19 1.8.1 Ngoài nước 19 1.8.2 Trong nước 25 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 29 2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lựa chọn chất chuẩn nội 29 2.3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 30 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 31 2.3.5 Phương pháp tính tốn kết 41 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, BÀN LUẬN 43 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43 3.1.1 Điều kiện khối phổ 43 3.1.2 Điều kiện sắc ký xác định chất chuẩn nội 44 3.1.3 Phương pháp xử lý mẫu 48 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 50 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 51 3.2.2 Tính đặc hiệu – chọn lọc 51 3.2.3 Ảnh hưởng mẫu 53 3.2.4 Độ nhiễm chéo 54 3.2.5 Tính tuyến tính miền giá trị 55 3.2.6 Giới hạn định lượng dưới 58 3.2.7 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 59 3.2.8 Hiệu suất chiết 64 3.2.9 Độ ổn định 66 3.2.10 Hệ số pha loãng 77 3.3 BÀN LUẬN 79 3.3.1 Phương pháp phân tích 79 3.3.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 80 3.3.3 Phương pháp xử lý mẫu tỷ lệ thu hồi 80 3.3.4 Thẩm định phương pháp 81 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 4.1 KẾT LUẬN 84 4.2 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguên tiếng anh Nghĩa tiếng Việt ADH Antidiuretic Hormon Hormon chống niệu APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization Ion hóa áp suất khí CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản Cmax - Nồng độ đỉnh CV % Coefficient of Variation Hệ số biến thiên ĐTĐ - Đái tháo đường DMF Dimethylformamide Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPP-4 Dipeptidyl peptidase Enzym DPP-4 10 DQC Dilution quality control – Kiểm sốt chất lượng pha lỗng 11 EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý Dược phẩm châu Âu 12 ESI Electron spray ionization Sự ion hóa phun sương điện tử 13 GC Gas Chromatography Sắc ký khí 14 GLM Glimepiride Glimepirid 15 GLP Glucagon-like peptide Peptid có cấu trúc tương tự glucagon 16 HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao 17 HQC High Performance Liquid Chromatography High Quality Control 18 HT - Huyết tương 19 IS Internal Standard Chuẩn nội Mẫu kiểm chứng nồng độ cao International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission 17025 International Union of Pure and Applied Chemistry Liquid Chromatography - Mass Spectrometry Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Hiệp hội Quốc tế Hóa học túy ứng dụng 20 ISO/IEC 17025 21 IUPAC 22 LC-MS 23 LC-MS/MS 24 LLE Liquid - Liquid Extraction Chiết lỏng - lỏng 25 LLOQ The Lower Limit of Quantitation Giới hạn định lượng dưới 26 LQC Low Quality Control Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp 27 MBTFA N-methyl bis trifluoroacetamide N-methyl bis trifluoroacetamid Tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 Sắc ký lỏng - Khối phổ Sắc ký lỏng - Khối phổ lần ii 28 MET Metformin Metformin 29 MQC Middle Quality Control Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình 30 MRM Multiple Reaction Monitoring Theo dõi đa phản ứng 31 MP Mobile phase Pha động 32 MS Mass Spectrometry Khối phổ 33 MF Matrix effects Ảnh hưởng mẫu 34 NM - Nền mẫu 35 PP Protein Precipitation Phương pháp tủa protein 36 37 38 PTHQ QC Q-TOF Quality Control Quadrupole - Time of Flight Phương trình hồi quy Mẫu kiểm tra Đầu dò tứ cực - Thời gian bay 39 Q-TRAP Quadrupole Linear Ion Trap Tứ cực bẫy ion 40 41 42 Rev Rs RT Recovery Resolution Retention Time Độ phục hồi Độ phân giải Thời gian lưu 43 S/N Signal/Noise Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu 44 SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn 45 SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulphat 46 SP Stationary phase Pha tĩnh 47 SPE Solid-phase Extraction Chiết pha rắn 48 49 SRM tt/tt Selected Reaction Monitoring - Theo dõi phản ứng lựa chọn Thể tích/ thể tích 50 TB - Trung bình 51 52 TĐSH TLTK Tương đương sinh học Tài liệu tham khảo 53 UPLC 54 US-FDA 55 ULOQ Ultra Performance Liquid Chromatography U.S Food and Drug Administration Upper limit of quantification Sắc ký lỏng siêu hiệu Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ Giới hạn định lượng PL:28 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC 5: Sắc ký đồ thẩm định giới hạn định lượng (LLOQ) PL:29 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:30 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:31 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC 6: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng, độ xác (LLOQ) PL:32 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL 05: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng, độ xác (LQC), tt PL:33 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:34 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC 6: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng, độ xác (MQC), tt PL:35 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Phụ lục 06: Sắc ký đồ thẩm định độ đúng, độ xác (HQC), tt PL:36 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:37 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC 7: Sắc ký đồ thẩm định độ pha lỗng PL:38 Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PHỤ LỤC 8: Sắc ký đồ thẩm định hiệu suất chiết Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:39 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:40 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:41 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL:42 ... sau: Xây dựng qui trình định lượng đồng thời glimepirid metformin huyết tương người kỹ thuật LC- MS/MS Thẩm định qui trình định lượng đồng thời glimepirid metformin huyết tương người kỹ thuật LC- MS/MS... tương người kỹ thuật LC- MS/MS cơng bố Từ thực tế đó, đề tài: ? ?Xây dựng quy trình định lượng đồng thời glimepirid metformin huyết tương người kỹ thuật LC- MS/MS” sở để phục vụ cho việc đánh giá tương. .. DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG ĐÌNH CHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ GLIMEPIRID TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC- MS/MS Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc -Độc