Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC.. Xây dựng quy trình định lượng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ CÚC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ CÚC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC

Nơi thực hiện:

Viện Dinh dưỡng Quốc gia

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất

và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trưởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dưỡng, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thanh Nga, cô Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dưỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dưỡng Quốc Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những người đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Cúc

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.1.1 Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9 2

1.1.2 Một số phương pháp định lượng các vitamin B1, B2, B6, B9 trong thực phẩm hiện nay 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 8

1.2.1 Nguyên tắc và phân loại 8

1.2.2 Các thông số đặc trưng 9

1.2.3 Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 13

2.1.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, máy móc 13

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC 14

2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng 14

2.2.3 Ứng dụng 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC 15

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 15

2.3.3 Ứng dụng 17

2.3.4 Tính toán và xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 19

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 19

3.1.1 Lựa chọn mẫu 19

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19

3.1.3 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 24

3.1.4 Quy trình phân tích các vitamin B1, B2, B6, B9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em 28

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 30

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 30

3.2.2 Độ phù hợp của hệ thống 31

3.2.3 Độ chọn lọc 32

3.2.4 Khoảng tuyến tính 33

3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 37

3.2.6 Độ lặp lại, độ chính xác trung gian 38

3.2.7 Độ thu hồi 40

3.2.8 Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký 42

3.3 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƯỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM TRÊN THỊ TRƯỜNG 43

BÀN LUẬN 47

KẾT LUẬN 48

ĐỀ XUẤT 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official

Analytical Chemists)

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography)

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

PAD: Detector mảng diode (Photodiode array detector)

QC Mẫu kiểm chứng (Quality Control)

RSD (%): Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TCA: Axit Trichloroacetic

UPLC-

MS/MS:

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao ghép khối phổ (Ultra high

performance chromatography – Mass spectrometry)

UV: Tử ngoại (Ultraviolet)

v/v Thể tích/thể tích (volume/volume)

w/v Khối lượng/thể tích (weight/volume)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số nghiên cứu định lượng đồng thời các vitamin nhóm B

3.1 Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình 20 3.2 Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau 21 3.3 Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau 23 3.4 Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau 23

3.6 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 31 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B1, B2, B6, B9 34 3.8 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B1 37 3.9 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B2, B6, B9 38 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 38 3.11 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phương pháp 39

3.12 Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình và

3.16 Hàm lượng vitamin B1 trong một số sản phẩm dinh dưỡng

3.17 Hàm lượng vitamin B2 trong một số sản phẩm dinh dưỡng

3.18 Hàm lƣợng vitamin B6 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng

3.19 Hàm lƣợng vitamin B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.2 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) 25

3.3 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bước sóng 267nm của

3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng tại bước sóng 246nm (đánh giá tính

3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 246nm 33

3.7 Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bước

3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic

và nồng độ của các vitamin B1, B2, B6, B9 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các vitamin có vai trò cần thiết đối với sức khỏe con người, đặc biệt là khả năng tăng trưởng, phát triển toàn diện ở trẻ nhỏ Trong số 13 loại vitamin rất quan trọng, các vitamin nhóm B tan trong nước như: thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pyridoxin (B6 ), cyanocobamine (B12) quan trọng cho quá trình trao đổi chất, điều hòa hoạt động của các cơ quan, đặc biệt khi cơ quan đang hoàn thiện chức năng; hỗ trợ tăng trưởng thể chất và phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp năng lượng và tổng hợp các tế bào máu Rất nhiều trường hợp do bệnh lý hoặc chế độ dinh dưỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B, gây ra ảnh hưởng xấu cho sức khỏe Ngày nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin như các thực phẩm công thức sữa, bột dinh dưỡng hoặc thuốc dưới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp các vitamin Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho trẻ nhỏ Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dưỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lượng cũng như phương pháp phân tích các chất dinh dưỡng, bao gồm các vitamin nhóm B Việc xác định chính xác hàm lượng các vitamin được bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của người tiêu dùng

Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm và phục

vụ các nghiên cứu dinh dưỡng chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC” với 2 mục tiêu chính:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm

B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ

em bằng phương pháp HPLC

2 Ứng dụng định lượng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mặc dù các sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em trên thị trường (sữa bột, bột dinh dưỡng) chứa hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí 10-11 loại vitamin khác nhau, nhưng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu định lượng các vitamin B1 (Thiamin hydroclorid), B2 (Riboflavin), B6 (Pyridoxin hydroclorid) và B9 (Acid folic)

1.1.1 Vài nét về các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9

1.1.1.1 Công thức cấu tạo, công thức phân tử [6], [9], [35], [37]

Hình 1.1: Vitamin B 1 Hình 1.2: Vitamin B 2

Hình 1.3: Vitamin B 6 Hình 1.4: Vitamin B 9

1.1.1.2 Tính chất và tác dụng

 Vitamin B1 (Thiamin hydroclorid)

- Tính chất: Thiamin dạng base không ổn định vì có cấu trúc nitơ bậc 4 nên B1thường được bào chế dạng muối hydrochlorid hoặc mononitrat, hai dạng muối này có tính chất tương tự nhau Thiamin hydroclorid là tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, vị đắng, dễ tan trong nước (1g/1ml) và glycerin (1g/18ml); khó tan trong ethanol (1g/315ml cồn tuyệt đối); không tan trong aceton, ether, chloroform và benzene [6], [9], [35] Nó ổn định trong dung dịch có pH axit (2-4); không ổn định với nhiệt và ánh sáng [37] Do có dị vòng thơm nên vitamin

B1 hấp thụ mạnh bức xạ UV [9]

- Tác dụng: Phòng và điều trị bệnh beri-beri; phối hợp với vitamin B6, B12 điều trị các trường hợp đau nhức dây thần kinh hông, lưng, dây thần kinh sinh ba; dùng trong trường hợp mệt mỏi, chán ăn, suy dinh dưỡng và rối loạn tiêu hóa [8]

 Vitamin B2 (Rioflavin)

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam, hơi có mùi, khó tan trong nước, ethanol; không tan trong ether, cloroform, benzen [6], [9] Nó dễ tan nhưng không ổn định trong môi trường kiềm; ổn định trong môi trường acid [35], [37]; không ổn định với ánh sáng [35], [37] Do có hệ nối đôi luân phiên nên vitamin B2 hấp thụ mạnh bức xạ UV-Vis [9]

- Tác dụng: Dùng trong các trường hợp thiếu B2 gây tổn thương da, niêm mạc, viêm giác mạc mắt, viêm kết mạc, loét miệng, suy nhược, mệt mỏi, chậm lớn,…Thường dùng phối hợp với vitamin PP [8]

 Vitamin B6 (Pyridoxin hydroclorid)

- Tính chất: Vitamin B6 là tên chung của 3 chất có cấu trúc hóa học khác nhau ở

vị trí nhóm chức số 4: pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin Dạng pyridoxin hydroclorid thường được dùng trong thực phẩm dinh dưỡng công thức Pyridoxin hydroclorid là những tinh thể không màu hoặc bột kết tinh màu trắng, bền vững trong không khí, dễ tan trong nước (1g/4,5ml), tan trong ethanol (1g/90ml), không tan trong ether, cloroform [6], [9] Ổn định trong môi trường nước với pH từ 2-4,5; hấp thụ mạnh bức xạ UV [9]

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trường hợp thiếu vitamin B6, biểu hiện: tổn thương mắt, mũi, miệng, co giật, thiếu máu Phòng và điều trị một số bệnh ở

hệ thần kinh do các thuốc khác (isoniazid) gây ra [8]

 Vitamin B9

- Tính chất: Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng cam, thực tế không tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong các dung dịch acid và kiềm loãng [6], [9], [35] Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử, acid, kiềm và khi bị đun nóng Dung dịch trong nước kém bền trong môi trường pH dưới 6 [9]

- Tác dụng: Phòng và điều trị trong các trường hợp thiếu vitamin B9 (thiếu máu tan máu, thiếu máu hồng cầu to) Bổ sung acid folic cho người đang điều trị bằng các thuốc kháng acid folic (methotrexat), đang điều trị thuốc chống động kinh hydantoin, bệnh nhân sốt rét, người nhu cầu tăng [8]

1.1.2 Một số phương pháp định lượng các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong thực phẩm hiện nay

1.1.2.1 Trên thế giới

Nghiên cứu các vitamin nhóm B trong thực phẩm đã phát triển từ lâu với nhiều

kỹ thuật đã được tiêu chuẩn hóa, tuy nhiên các kỹ thuật tiêu chuẩn này hầu hết là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng loại vitamin Các kỹ thuật tiêu chuẩn AOAC để phân tích vitamin B1, B2 thường dùng phương pháp quang phổ huỳnh quang [23], [24], [29]; phân tích vitamin B3, B6, B12, B9 hiện nay là phương pháp vi sinh [25], [26], [27] Phương pháp sắc ký cũng ngày càng phát triển như tiêu chuẩn AOAC 2004.07 phân tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức trẻ em [30] Bên cạnh đó phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS) cũng được sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin như vitamin B5 vì tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp [28]

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phương pháp phân tích đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm Một số nghiên cứu dùng

phương pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm [40], [38]; phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [33], [39], [34], [22]

Một số quy trình xử lý mẫu dùng để định lượng đồng thời các vitamin nhóm B trong chế phẩm dinh dưỡng công thức:

Quy trình 1: Joon Hyuk Suh và cộng sự [34]:

Cân chính xác 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 15ml

 Thêm 2ml nước cất, lắc đều, lắc xoáy 3 phút ở nhiệt độ phòng

 Thêm 6 ml acetonitrile, lắc đều



Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

 Hút lấy dịch trong, thổi khô dung môi bằng khí nitơ

 Hòa tan phần còn lại trong 5ml nước cất

 Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC

Quy trình 2: Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự [22]

Cân chính xác 8 g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml

 Thêm 10ml nước cất, lắc đều

 Thêm 1g TCA, lắc tan, lắc bằng khuấy từ 10 phút



Ly tâm 1250 vòng trong 10 phút

 Thu dịch trong Tủa: thêm 3ml TCA 4%, lắc 10 phút, ly tâm, loại tủa

 Gộp dịch chiết, định mức bằng TCA 4% vừa đủ 10ml

 Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm HPLC

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lượng đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC

Tài

liệu Mẫu thử

Xác định vitamin

Dung môi

Thể tích tiêm mẫu ( µl )

- Rửa giải gradient: Gồm acetonitrile và nước có chứa 0,1% axit formic

- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút

- Cột Acquity UPLC Ben C18 (2,1 mm × 100

và MeOH 15%

- Pha B: acetonitrile 100%

- Tỷ lệ: 90% A, 10% B

- Cột Luna 5µm C8 (250 mm × 4,6 mm) từ

Phenomenex (USA)

- Rửa giải gradient:

A: 20 mM kali phosphate pH 3.0 B: 50% acetonitrile (v/v) trong 20 mM kali

phosphate pH 3,0

- Tốc độ dòng chảy giữa 0,8 và 1,0mL / phút

- Develosil RPAQUEOUS C30 (4,6 mm ×

- LOQ (µg/ml): 0,03 đến 0,25

1.1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các kỹ thuật tiêu chuẩn để định lượng các vitamin nhóm B trong thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin Một số tiêu chuẩn dùng phương pháp HPLC để phân tích vitamin B1 [21] , B2 [18]; phương pháp vi sinh hoặc HPLC với B6 [19], [17]; phương pháp vi sinh với B9 [20] Hiện nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dưỡng công thức [3], [4], [5] quy định phương pháp phân tích riêng từng vitamin nhóm B – áp dụng các phương pháp của AOAC

Việc nghiên cứu định lượng đồng thời nhiều vitamin nhóm B cũng đã phát triển trong những năm gần đây nhưng đó hầu hết là các nghiên cứu trên đối tượng dược phẩm [1], [14], [15]; nghiên cứu trên đối tượng thực phẩm còn rất ít Tác giả Phạm Thị Thanh Hà và cộng sự [12] đã định lượng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9, C,

PP trong cốm dinh dưỡng bằng phương pháp điện di mao quản

Phương pháp đo quang kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến hoặc đạo hàm được ứng dụng trong phân tích vô cơ, hữu cơ, môi trường, dược phẩm, nhưng yêu cầu sử dụng các thuật toán phức tạp, cần có máy tính và phần mềm chuyên dụng Phương pháp vi sinh có nhược điểm là tính chọn lọc, độ lặp lại kém và thời gian phân tích kéo dài Phương pháp điện di mao quản có ưu điểm sử dụng tiết kiệm dung môi, hóa chất và thân thiện với môi trường nhưng độ lặp lại không cao

Kỹ thuật HPLC đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp định lượng trên Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi vì thao tác đơn giản, khả năng tách tốt các vitamin trong mẫu nhiều thành phần, rút ngắn thời gian phân tích, đồng thời cho độ chính xác và tính chọn lọc cao

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.2.1 Nguyên tắc và phân loại

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [2] Thứ tự rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột phụ thuộc vào khả năng lưu giữ khác nhau của các chất phân tích với hai pha tĩnh và pha động [10]

Tùy vào bản chất các pha, cơ chế tách mà HPLC phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân cho sắc

ký hấp thụ hoặc pha tĩnh là chất mang rắn được liên kết hóa học với các nhóm hữu

cơ cho sắc ký phân bố Ngoài ra còn có các loại sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó, sắc ký lỏng phân bố được dùng phổ biến nhất hiện nay

Sắc ký phân bố được chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo, với sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều hơn cả trong kiểm nghiệm Kỹ thuật này có pha tĩnh gồm các nhóm không phân cực (octyl C8, octadecyl C18 hay phenyl C6H5), pha động là những dung môi phân cực (nước, methol, acetonitril,…), thứ tự rửa giải

là các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên [2], [10], [11], [13]

1.2.2 Các thông số đặc trưng

1.2.2.1 Thời gian lưu

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích xuất hiện đỉnh pic trên sắc ký đồ

Với một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để định tính các chất

1.2.2.2 Hệ số phân bố K

Là đại lượng đặc trưng cho sự phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh

Với: CS : nồng độ mol chất phân tích trong pha tĩnh

CM : nồng độ mol chất phân tích trong pha động

K phụ thuộc vào bản chất chất phân tích và bản chất hai pha Trị số K càng lớn,

sự di chuyển của chất phân tích qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ [10]

1.2.2.3 Hệ số dung lượng k’

k’ là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha

Với: K : hệ số phân bố

1.2.2.5 Hệ số đối xứng F

Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng F:

Với: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0

1.2.2.6 Số đĩa lý thuyết N

Đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký:

( ) (

)Với: W0,5 là chiều rộng đo ở vị trí ½ chiều cao pic

W là chiều rộng đo ở đáy pic

WA , WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic

W0,5A , W0,5B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: RS >1,25; tối ưu RS ≥1,5 [2], [10], [13]

 Kỹ thuật chuẩn ngoại: Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu chuẩn và mẫu thử So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

 Chuẩn hóa 1 điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nộng độ mẫu chuẩn Nồng độ của mẫu thử được tính theo công thức:

CX, CS: Nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn

SX, SS: Diện tích của pic mẫu thử, mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm:

Cách tiến hành: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn C Sử dụng khoảng tuyến tính của đường chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chất cần xác định:

Trong đó: Y: diện tích hoặc chiều cao pic

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: độ dốc của đường chuẩn

CX: nồng độ của chất phân tích

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn [2], [10], [13]

 Kỹ thuật thêm chuẩn:

Cách tiến hành: Chuẩn bị 2 mẫu thử, thêm một lượng chất chuẩn ngoại vào mẫu thử thứ hai Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ của mẫu thử được tính theo công thức

Trong đó: CX, SX : Nồng độ, diện tích pic của mẫu thử

ΔC, ΔS: Chênh lệch về nồng độ, diện tích của pic mẫu thử và mẫu thử nạp chuẩn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

- Dung môi, hóa chất:

 TCA, acetonitrile, NaOH, HCl, natri bicarbonat (NaHCO3), natri heptan sulfonat đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (PA) của Merck- Đức

 Methanol (MeOH) và H3PO4 đặc loại HPLC của Merck - Đức

- Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức)

- Máy lắc ngang Edmund M6103000 (Đức)

- Máy lắc xoáy Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mĩ)

- Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi; lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm

- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120g) (Đức)

- Ống nghiệm thủy tinh 15ml, ống ly tâm 50ml

- Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, pipetman, cốc có mỏ,…

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu QC do công ty Abbott cung cấp

- Mẫu nghiên cứu: Sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em (bột dinh dưỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trường

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 ,

B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC

 Quy trình xử lý mẫu: Khảo sát một số quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 để từ đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết phù hợp với yêu cầu phân tích

 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu

 Khảo sát thể tích dung môi chiết

 Khảo sát cách lắc mẫu thử

 Khảo sát thời gian chiết

 Lựa chọn điều kiện sắc ký: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp

để phân tích đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 có trong mẫu:

 Độ phù hợp của hệ thống

 Độ chọn lọc

 Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định

 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

 Độ lặp lại, độ chính xác trung gian

 Độ thu hồi

2.2.3 Ứng dụng

Ứng dụng định lượng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em trên thị trường

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 ,

B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng phương pháp HPLC

2.3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình xử lý mẫu được xây dựng dựa trên hai quy trình của Joon Hyuk Suh cùng cộng sự [34] và của Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự [22]

Với quy trình đã chọn, tiếp tục khảo sát các yếu tố: thể tích TCA 20%, cách lắc, thời gian chiết

2.3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định lượng đồng thời các vitamin

B1, B2, B6, B9 trong mẫu Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện như sau:

- Cột sắc ký: Khảo sát các cột C8, C18 pha đảo hiện có ở phòng thí nghiệm

- Pha động: Khảo sát các chương trình gradient khác nhau

- Detector: Khảo sát trên detector DAD, lựa chọn bước sóng phù hợp

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích [7], [16], [31], [32], [36]

2.3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống sắc ký

- Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ các vitamin nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,00%

2.3.2.2 Tính chọn lọc

- Chuẩn bị các mẫu sau:

 Mẫu trắng

 Mẫu chuẩn hỗn hợp các vitamin B1, B2, B6, B9

 Mẫu thử

- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thu được, tại thời điểm xuất hiện pic của các vitamin không được xuất hiện pic lạ

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và khoảng nồng độ xác định

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin có nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

- Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ r ≤1

2.3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [16]

- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và

 Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả

- Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) xác định bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu thử Ghi sắc ký đồ, diện tích pic, xác định kết quả định lượng của các vitamin Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%)

Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chẩn tương đối RSD (%) của mỗi vitamin phải không lớn hơn 11,00% [16], [31]

- Độ chính xác trung gian: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau

Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chẩn tương đối RSD (%) trong ngày của mỗi vitamin phải không lớn hơn 11,00% và trong hai ngày phải không lớn hơn 16,00% [31]

2.3.2.6 Độ thu hồi

- Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng hoạt chất Lượng chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ: nồng độ thấp, nồng độ trung bình, nồng độ cao Tại mỗi mức nồng độ, phân tích lặp lại 10 lần

- Tính tỷ lệ thu hồi của các vitamin B1, B2, B6, B9 chuẩn thêm vào mẫu thử

- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% [16], [31]

2.3.3 Ứng dụng

Áp dụng phương pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lượng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em (bột dinh dưỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trường Chúng tôi tiến hành chọn mẫu ngẫu nhiên đơn giản:

 Thu thập thông tin các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức có trên thị trường Hà Nội, tên và địa điểm một số siêu thị, đại lý

 Bốc thăm ngẫu nhiên lấy 3 địa điểm để mua mẫu

 Bốc thăm ngẫu nhiên 10 loại sản phẩm để phân tích

 Tại mỗi địa điểm đã chọn, mỗi loại sản phẩm mua 1 mẫu đại diện

Tổng số mẫu thu thập: 1 mẫu/loại/điểm x 10 loại x 3 điểm = 30 mẫu

2.3.4 Tính toán và xử lý số liệu

Sử dụng ba phần mềm: Microsoft Office Excel 2010, GraphPad Prism và phần mềm Microsoft Office Word 2010 để xử lý số liệu và trình bày kết quả

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN

SẮC KÝ

3.1.1 Lựa chọn mẫu

- Mẫu QC: Mẫu do công ty Abbot cung cấp

- Hàm lượng các vitamin trong QC: B1 là 1,257 mg/100g; B2 là 2,037 mg/100g; B6 là 1,346 mg/100g; B9 là 0,2293 mg/100g

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Qua tham khảo các nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới, chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình sau:

Quy trình 1 (tham khảo Joon Hyuk Suh và cộng sự)

Cân 1g mẫu bột vào ống ly tâm 50ml

 Thêm 4 ml nước 18MΩ, lắc xoáy 1 phút ở nhiệt độ phòng

 Thêm 12 ml acetonitrile, lắc đều



Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút

 Hút 10 ml dịch trong vào ống ly tâm 50ml Thổi khô dung môi bằng khí nitơ đến khoảng 2ml

 Thêm pha động A đến 5ml

 Lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC

Quy trình 2 (tham khảo Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự)

Cân 1g mẫu bột vào ống thủy tinh 15ml

 Thêm 4ml nước 18MΩ, lắc xoáy 1 phút

 Thêm 1ml TCA 20%, lắc xoáy 1 phút

 Siêu âm 30 phút

↓

Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

 Lọc Rửa tủa và định mức bằng pha động A vừa đủ 10 ml

Hút 1ml dịch + 1ml pha động A

 Trộn đều, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào HPLC Kết quả độ nồng độ các vitamin thu đƣợc từ 2 quy trình xử lý mẫu đƣợc trình

Do vậy chúng tôi lựa chọn quy trình 2 và tiếp tục khảo sát xử lý các điều kiện chiết xuất: thể tích TCA 20%, cách lắc chiết, thời gian chiết để tối ƣu quy trình xử

lý mẫu

 Khảo sát thể tích TCA 20%:

Mục đích sử dụng dung dịch TCA là để kết tủa protein trong mẫu nhằm làm

sạch mẫu, thuận lợi cho quá trình phân tích bằng HPLC

Chúng tôi khảo sát 4 thể tích TCA 20%: 0.5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml Kết quả

đƣợc trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau

Với mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợc giữa 5 cách sử dụng thể tích TCA 20% khác nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test và T-test trên phần mềm GraphPad Prism Kết quả:

- Khi dùng hàm ANOVA-test: giá trị p-value của các vitamin đều lớn hơn 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

- Khi dùng hàm T-test:

 Vitamin B9: Khi so sánh giữa các thể tích 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml cho giá trị p-value > 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Khi so sánh giữa cặp thể tích 0,5ml và 1ml TCA 20% cho giá trị p-value = 0,0082<

0,05: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Nhìn bảng 3.2 ta thấy khi dùng

thể tích 0,5 ml TCA 20% cho nồng độ B9 thấp hơn các thể tích khác

 Các giá trị p-value của các vitamin còn lại đều lớn hơn 0,05: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy:

- Với các vitamin B1, B2, B6: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích TCA 20% là 0,5ml; 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml

- Với vitamin B9: không có sự khác biệt khi sử dụng các thể tích TCA 20% là 1ml; 1,5ml; 2ml; 3ml Nhƣng khi dùng 0,5ml TCA 20% thì thu đƣợc nồng

Kết quả nồng độ các vitamin đƣợc trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, ba cách lắc cho nồng độ của các vitamin

tương đương nhau Siêu âm và lắc ngang có thể làm đồng thời nhiều mẫu hơn so với lắc xoáy do đó tiết kiệm thời gian chiết Chúng tôi lựa chọn cách siêu âm cho các khảo sát tiếp theo

 Khảo sát thời gian chiết:

Chúng tôi tiến hành khảo sát các thời gian siêu âm là 5, 10, 15, 20, 30, 60 phút

Mỗi khoảng thời gian, tiến hành ba mẫu độc lập Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau

B2

1,392 1,491 1,446 1,429 1,442 1,432 1,387 1,521 1,483 1,279 1,298 1,285 1,480 1,470 1,440 0,990 1,345 1,206

1,234 1,409 1,395 1,203 1,286 1,201 1,324 1,399 1,399 0,954 1,337 1,157

B9

0,112 0,117 0,118 0,124 0,127 0,130 0,149 0,149 0,129 0,105 0,132 0,121 0,137 0,145 0,122 0,095 0,106 0,116 Với mỗi vitamin, so sánh nồng độ thu đƣợc giữa các thời gian siêu âm khác nhau, chúng tôi sử dụng hàm ANOVA-test, T-test trên phần mềm GraphPad Prism Kết quả giá trị p-value của các vitamin đều lớn hơn 0,05 cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Do vậy chúng tôi chọn thời gian siêu âm ngắn nhất là 5 phút

Từ các kết quả khảo sát thu được, chúng tôi lựa chọn được các điều kiện xử lý mẫu như sau:

 Lựa chọn quy trình 2 để xử lý mẫu

 Sử dụng 1ml TCA 20% để kết tủa protein trong mẫu

 Lựa chọn cách lắc siêu âm để tăng hòa tan các vitamin

 Lựa chọn thời gian siêu âm 5 phút

3.1.3 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký

 Cột sắc ký: Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký trên các cột:

- Cột Inertsil C8 (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột 35oC

- Cột Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm), nhiệt độ cột 35oC

Kết quả thu đƣợc các sắc ký đồ sau:

Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm)

Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) Nhận xét: Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 350

C, hai cột có khả năng tách vitamin

B1, B6 là tương đương nhau Nhưng cột Inertsil C8 (150 x 4,6 mm; 5µm) tách vitamin B2, B9 kém hơn (pic B9 dính pic B2) so với cột Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm; 5µm) Vì vậy cột Agllent HC C18(2) (150 x 4,6 mm) là phù hợp, tách tốt

và chọn lọc các vitamin trong mẫu phân tích

 Pha động: Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi lựa chọn pha động gồm pha A là

0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc, pha trong 1 lít nước 18 MΩ; pha

B là MeOH Tốc độ dòng: 1ml/ phút

Mẫu chuẩn hỗn hợp: vitamin B1 (10,2 ppm), B2 (2, ppm), B6 (7,5 ppm), B9 (10,8 ppm)

Tiến hành khảo sát 3 chương trình gradient sau:

Bảng 3.5: Ba chương trình gradient khảo sát

gian (phút)

Kết quả cho thấy:

 Chương trình gradient 3 cho khả năng tách tốt cả bốn vitamin B1, B2, B6, B9

 Chương trình gradient 1, 2: khả năng tách kém, chưa tách hoàn toàn hai pic vitamin B2, B9 Kết quả sắc ký đồ được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 267nm của 3

chương trình gradient

 Detector: Qua tham khảo tài liệu, để định lƣợng các vitamin B1, B2, B6, B9 có thể sử dụng các loại detector PAD, MS-MS Với điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn sử dụng máy HPLC với detector PAD

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn đơn của các vitamin B1, B2, B6, B9 cho kết

quả nhƣ hình 3.4 sau:

Hình 3.4: Phổ hấp thụ UV của các vitamin

Trên phổ hấp thụ cho thấy: vitamin B1 có cực đại hấp thụ ở bước sóng 246nm,

B2 có cực đại hấp thụ ở bước sóng 267nm, B6 có cực đại hấp thụ ở bước sóng 291nm, B9 có cực đại hấp thụ ở bước sóng 285nm Vì vậy chúng tôi quyết định chọn bước sóng phát hiện B1 ở 246nm, B2 ở 267nm, B6 và B9 ở 290nm

3.1.4 Quy trình phân tích các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong sản phẩm dinh

dưỡng công thức cho trẻ em

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký có thể tách tốt được đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 trong các mẫu thử như sau:

 Quy trình xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu được trình bày theo sơ đồ sau:

+ 4 ml nước 18MΩ

+ Lắc xoáy khoảng 1 phút

+ 1ml TCA 20%

+ Lắc xoáy 1 phút

+ Siêu âm 5 phút + Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút

- Pha động:

 Pha động A: 0,5g natri heptan sulfonat + 1,14g H3PO4 đặc Hoà tan, định mức vừa đủ 1 lít bằng nước 18MΩ Trộn đều, lọc qua màng lọc đường kính lỗ lọc 0,45µm, rung siêu âm 15 phút

Hỗn hợp

Cân 1g mẫu bột sữa vào ống

nghiệm thủy tinh 15ml

Dịch lọc

Dịch tiêm sắc ký

 Vitamin B1, B6: hòa tan và định mức bằng dung dịch acid acetic 2,4% (v/v)

 Vitamin B2: thấm ướt bằng 200 µl nước 18MΩ, cho thêm 100 µl NaOH 0,2N Lắc tan Sau đó cho ngay 200 µl HCl 0,1N để trung hòa kiềm, tránh thủy phân vitamin B2 Định mức vừa đủ 20,00 ml bằng acid acetic 2,4%

 Vitamin B9: hòa tan và định mức bằng dung dịch Natri bicarbonat (NaHCO3) 5% (w/v)

- Dung dịch chuẩn đơn trung gian: Với mỗi dung dịch chuẩn đơn gốc, hút

chính xác 1,00 ml dung dịch gốc, pha loãng bằng pha động A trong bình định mức 10,00 ml được dung dịch chuẩn đơn nồng độ 50 ppm

Bảo quản: Các dung dịch chuẩn đơn của các vitamin được bảo quản trong điều kiện -40C, tránh ánh sáng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp bốn vitamin: từ dung dịch chẩn đơn trung gian: hút

chính xác 1,00 ml chuẩn B1; 1,50 ml chuẩn B2; 0,50 ml chuẩn B6; 0,10 ml chuẩn B9vào bình định mức 20,00 ml; định mức tới vạch bằng pha động A Như vậy thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm B1 (2,5ppm), B2 (3,75 ppm), B6 (1,25 ppm), B9(0,25 ppm) Dung dịch chuẩn hỗn hợp được pha mới trước khi dùng

3.2.1.2 Mẫu thử

Mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem được xử lý theo quy trình được trình bày

ở mục 3.1.4

3.2.1.3 Mẫu trắng

Thay 1g sữa bột trong quy trình xử lý mẫu bằng 1ml pha động A:B (90:10) Sau

đó tiến hành tương tự như chuẩn bị mẫu thử

3.2.2 Độ phù hợp của hệ thống

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp chuẩn bị như mục 3.2.1.1, pha loãng 4 lần (hút

chính xác 5,00 ml; định mức trong bình định mức 20,00 ml bằng pha động A) được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ các vitamin B1 (0,608 ppm), B2 (0,938 ppm),

B6 (0,304 ppm), B9 (0,067 ppm) Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện sắc ký như

đã nêu ở mục 3.1.4

Xác định các thông số mỗi lần tiêm mẫu: thời gian lưu, diện tích pic của các vitamin Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký (n = 6)

Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Lần