Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các vitamin b1, b2, b6, b9 trong sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B 1 , B 2 , B 6 , B 9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B 1 , B 2 , B 6 , B 9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Lâm Hồng ThS. Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Viện Dinh dưỡng Quốc gia. HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những ngƣời đã dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất và thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phòng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thanh Nga, cô Nguyễn Thúy Dung, anh Hoàng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán bộ khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng đã luôn quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các thầy cô giáo, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc Gia đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè những ngƣời đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Cúc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. 2 1.1.1. Vài nét về các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 . 2 1.1.2. Một số phƣơng pháp định lƣợng các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong thực phẩm hiện nay. 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. 8 1.2.1. Nguyên tắc và phân loại 8 1.2.2. Các thông số đặc trƣng. 9 1.2.3. Các kỹ thuật định lƣợng bằng HPLC. 11 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ. 13 2.1.1. Nguyên vật liệu. 13 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, máy móc. 13 2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 14 2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. 14 2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. 14 2.2.3. Ứng dụng. 15 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 15 2.3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. 15 2.3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích. 15 2.3.3. Ứng dụng. 17 2.3.4. Tính toán và xử lý số liệu. 18 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ. 19 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ. 19 3.1.1. Lựa chọn mẫu. 19 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu. 19 3.1.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 24 3.1.4. Quy trình phân tích các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em. 28 3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP. 30 3.2.1. Chuẩn bị mẫu. 30 3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống. 31 3.2.3. Độ chọn lọc. 32 3.2.4. Khoảng tuyến tính. 33 3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. 37 3.2.6. Độ lặp lại, độ chính xác trung gian. 38 3.2.7. Độ thu hồi. 40 3.2.8. Độ ổn định của các vitamin trong dung dịch chạy sắc ký. 42 3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B 1 , B 2 , B 6 , B 9 TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM TRÊN THỊ TRƢỜNG. 43 BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN 48 ĐỀ XUẤT 51 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification) MeOH: Methanol PAD: Detector mảng diode (Photodiode array detector) QC Mẫu kiểm chứng (Quality Control) RSD (%): Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TCA: Axit Trichloroacetic UPLC- MS/MS: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao ghép khối phổ (Ultra high performance chromatography – Mass spectrometry) UV: Tử ngoại (Ultraviolet) v/v Thể tích/thể tích (volume/volume) w/v Khối lƣợng/thể tích (weight/volume) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời các vitamin nhóm B trong thực phẩm bằng phƣơng pháp HPLC. 6 3.1 Nồng độ của các vitamin với mỗi quy trình 20 3.2 Nồng độ của các vitamin tại các thể tích TCA 20% khác nhau 21 3.3 Nồng độ của các vitamin với mỗi cách lắc khác nhau 23 3.4 Nồng độ của các vitamin với thời gian siêu âm khác nhau 23 3.5 Ba chƣơng trình gradient khảo sát 25 3.6 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 31 3.7 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 34 3.8 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B 1 37 3.9 Kết quả thẩm định LOD, LOQ của vitamin B 2 , B 6 , B 9 38 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp 38 3.11 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp 39 3.12 Pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình và cao 40 3.13 Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B 1 41 3.14 Kết quả thẩm định độ thu hồi của phƣơng pháp với vitamin B 2 , B 6 , B 9 42 3.15 Kết quả độ ổn định của các vitamin 43 3.16 Hàm lƣợng vitamin B 1 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 44 3.17 Hàm lƣợng vitamin B 2 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 44 3.18 Hàm lƣợng vitamin B 6 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 45 3.19 Hàm lƣợng vitamin B 9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin B 1 2 1.2 Công thức cấu tạo của vitamin B 2 2 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin B 6 2 1.4 Công thức cấu tạo của vitamin B 9 2 3.1 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm) 24 3.2 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) 25 3.3 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn tại bƣớc sóng 267nm của 3 chƣơng trình gradient 26 3.4 Phổ hấp thụ UV của các vitamin 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng tại bƣớc sóng 246nm (đánh giá tính chọn lọc) 32 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp tại bƣớc sóng 246nm. 33 3.7 Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem tại bƣớc sóng 246nm 33 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các vitamin có vai trò cần thiết đối với sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là khả năng tăng trƣởng, phát triển toàn diện ở trẻ nhỏ. Trong số 13 loại vitamin rất quan trọng, các vitamin nhóm B tan trong nƣớc nhƣ: thiamin (B 1 ), riboflavin (B 2 ), niacin (B 3 ), pyridoxin (B 6 ), cyanocobamine (B 12 ) quan trọng cho quá trình trao đổi chất, điều hòa hoạt động của các cơ quan, đặc biệt khi cơ quan đang hoàn thiện chức năng; hỗ trợ tăng trƣởng thể chất và phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp năng lƣợng và tổng hợp các tế bào máu. Rất nhiều trƣờng hợp do bệnh lý hoặc chế độ dinh dƣỡng kém dẫn tới thiếu viatmin B, gây ra ảnh hƣởng xấu cho sức khỏe. Ngày nay, trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin nhƣ các thực phẩm công thức sữa, bột dinh dƣỡng hoặc thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp các vitamin. Trong đó, thực phẩm công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho trẻ nhỏ. Hiện nay Bộ Y Tế đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng cũng nhƣ phƣơng pháp phân tích các chất dinh dƣỡng, bao gồm các vitamin nhóm B. Việc xác định chính xác hàm lƣợng các vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa trong vấn đề đảm bảo quyền lợi và sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm và phục vụ các nghiên cứu dinh dƣỡng chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời các vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng HPLC” với 2 mục tiêu chính: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. 2. Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng. [...]... định  Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng  Độ lặp lại, độ chính xác trung gian 15  Độ thu hồi 2.2.3 Ứng dụng Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 2.3.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ. .. 50ml - Các dụng cụ khác: Bình định mức, pipet thủy tinh, pipetman, cốc có mỏ,… 14 2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu - Mẫu QC do công ty Abbott cung cấp - Mẫu nghiên cứu: Sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em (bột dinh dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng... các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC  Quy trình xử lý mẫu: Khảo sát một số quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời các vitamin B1, B2, B6, B9 để từ đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết phù hợp với yêu cầu phân tích  Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu  Khảo sát thể tích dung môi chiết  Khảo sát cách lắc mẫu thử  Khảo sát thời gian chiết  Lựa chọn điều... Mặc dù các sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em trên thị trƣờng (sữa bột, bột dinh dƣỡng) chứa hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí 10-11 loại vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu định lƣợng các vitamin B1 (Thiamin hydroclorid), B2 (Riboflavin), B6 (Pyridoxin hydroclorid) và B9 (Acid folic) 1.1.1 Vài nét về các vitamin B1, B2, B6, B9 1.1.1.1 Công thức. .. [31] 2.3.3 Ứng dụng Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 trong một số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em (bột dinh dƣỡng, sữa bột bổ sung vi chất) mua trên thị trƣờng Chúng tôi tiến hành chọn mẫu ngẫu nhiên đơn giản:  Thu thập thông tin các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức có trên thị trƣờng Hà Nội, tên và địa điểm một số siêu... Mẫu QC sau khi xử lý bằng quy trình 1, 2 em phân tích bằng phƣơng pháp HPLC đều cho pic các vitamin tách rời hoàn toàn khỏi các pic tạp Quy trình 1 không phân tích đƣợc vitamin B9 Quy trình 2 phân tích đƣợc đồng thời cả 4 vitamin, tuy nhiên nồng độ vitamin B2 và B9 thu đƣợc thấp hơn so với hàm lƣợng thực trong QC Do vậy chúng tôi lựa chọn quy trình 2 và tiếp tục khảo sát xử lý các điều kiện chiết xuất:... tích vitamin B6 trong sản phẩm dinh dƣỡng công thức trẻ em [30] Bên cạnh đó phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ (UPLC/MS) cũng đƣợc sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các vitamin nhƣ vitamin B5 vì tính chọn lọc và độ nhạy cao, đồng thời giảm bớt công đoạn xử lý mẫu phức tạp [28] Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã công bố các phƣơng pháp phân tích đồng thời các vitamin. .. lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 có trong mẫu:  Cột sắc ký  Chƣơng trình gradient của pha động  Detector và bƣớc sóng 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Theo hƣớng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích đối với chế phẩm định tính, định lƣợng [7], [16], [32], [36] chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp phân tích đã đƣợc lựa chọn với các chỉ... Nam, các kỹ thuật tiêu chuẩn để định lƣợng các vitamin nhóm B trong thực phẩm cũng mới dừng lại là các kỹ thuật phân tích riêng lẻ từng vitamin Một số tiêu chuẩn dùng phƣơng pháp HPLC để phân tích vitamin B1 [21] , B2 [18]; phƣơng pháp vi sinh hoặc HPLC với B6 [19], [17]; phƣơng pháp vi sinh với B9 [20] Hiện nay, Bộ Y Tế cũng đã ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm dinh dƣỡng công. .. trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC 2.3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Chúng tôi tiến hành khảo sát hai quy trình xử lý mẫu đƣợc xây dựng dựa trên hai quy trình của Joon Hyuk Suh cùng cộng sự [34] và của Soledad Albalá-Hurtado cùng cộng sự [22] Với quy trình đã chọn, tiếp tục khảo sát các yếu tố: thể tích TCA 20%, cách lắc, thời gian chiết 2.3.1.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký Dùng phƣơng pháp HPLC . 2.2.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời 4 vitamin nhóm B gồm B 1 , B 2 , B 6 , B 9 trong các loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em bằng phƣơng pháp HPLC. 14 2.2.2. Thẩm định. DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B 1 , B 2 , B 6 , B 9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP. DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B 1 , B 2 , B 6 , B 9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP