Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người bằng phương pháp PCR kết hợp Reverse Dot Lot

B GIÁO DO I HC M TP.HCM KHOA CÔNG NGH SINH HC   KHÓA LUN TT NGHIP Tên đ tài: U XÂY DNG QUY TRÌNH PHÁT HING THI CÁC TÁC NHÂN VI KHUN T CÁC MU BNH PHM GÂY BI B PHÁP PCR KT HP REVERSE DOT LOT KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT GVHD: ThS. NG SVTH : NGUYN TR MSSV : 1053010486 Khóa : 2010  2014 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014  Nguyn Trng Nghĩa i  Em xin chân thành cy Cô Khoa Công ngh Sinh Hng i hc M n tình dy bo em trong nha qua, truyt nhng kin th i. Em kính gi li cn Cô Lê Hun tình c vn, truyt cho em nhng kin thc chuyên môn b ích. Em xin chân thành c    c Thu        tài khóa lun tt nghi                    tài khóa lun          các anh ch, các b em thc hi tài khóa lun tt nghip này.   tài khóa lun Sinh viên Nguyn Tr  Nguyn Trng Nghĩa ii  Kí hiu vit tt Din gii A Adenine AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat BLAST Basic Local Alignment Search Tool BP Baird Parker Bp Base Pair C Cytosine cAMP Cyclic Andenosine monophosphate cDNA complementary DNA CFU Colony Forming Unit DNA Deoxyribonucleic acid EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli G Guanidine IDT Integrated DNA technologies IMViC Indole, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate ISA Iso-sensitest agar ITS Internal Transcribed Spacer LB Labile heat LPS Lippolysaccharide MR Methyl Red mRNA messenger RNA NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential Hydrogen RDB Reverse dot blot  Nguyn Trng Nghĩa iii rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid S Semi-conserved SEs Staphylococcal enterotoxins SNP Single nucleotide polymorphism ST Stable heat T Thymin Ta Temperature annealing TLTK Tài liu tham kho Tm Temperature melting TMB 3,3,5,5- tetramethylbenzidine tRNA Transfer Ribonucleic Acid U Universal UV Ultraviolet, tia t ngoi V Variable VP Voges Proskauer VTEC Verotoxigenic E.coli  Nguyn Trng Nghĩa iv  Bng I.1. Bng th nghim sinh hóa phân bit nhóm vi khun gây b ng rut[25] 14 Bng II.1. Thành phn phn  16S_R. 28 Bng II.2. Chu k nhit cho phn 16S_F  16S_R. 29 Bng II.3. Thành phn phn 23S_F  23S_R. 29 Bng II.4. Chu k nhit cho phn  23S_R 29 Bng III.1. Các vùng gen s dng trong phát hin vi sinh vt gây bnh 33 Bng III.2. Các k thut sinh hc phân t s d   nh nhanh các vi khun gây bnh 34 Bng III.3. Các cp mi s dng trong nghiên cu 35 Bng III.4. Các mu dò s dng trong nghiên cu mu dò 36 Bng III.5. Bng thông s vt lí ca mi da vào phân tích IDT 44 Bng III.6. Bng ch s OD ca 5 mu DNA tách chit t vi khui ch  57 Bng III.7. Ch s OD ca 15 mu DNA tách chi 57 Bng III.8. V trí chm mu dò trên màng lai 62 Bng III.9. Thông tin mu bnh phm s dng trong nghiên cu 82 Bng III.10. Kt qu cy trang (s khun lc) và m t bào CFU/ml 83  Nguyn Trng Nghĩa v  Hình I.1. Hình thái t bào E.coli[75] 3 Hình I.2. Hình thái t bào Staphylococcus aureus[76] 5 Hình I.3. Hình thái t bào Salmonella[77] 6 Hình I.4. Hình thái t bào Shigella[78] 7 Hình I.5. Hình thái t bào Vibrio cholera[79] 8 Hình I.6. Hình thái t bào Y. enterocolitica[80] 9  16 Hình I.8. Minh h 22 Hình III.1. Kt qu BLAST mi 16S_F 38 Hình III.2. Kt qu BLAST mi 16S_R 39 Hình III.3. Kt qu kho sát kh t cp ca cp mi 16S_F  16S_R bng công c Annhyb. 40 Hình III.4. Kt qu BLAST mi 23S_F 41 Hình III.5. Kt qu BLAST mi 23S_R 42 Hình III.6. Kt qu kho sát kh t cp ca cp mi 23S_F  23S_R bng công c Annhyb. 43 Hình III.7. Kt qu BLAST mu dò SAL 45 Hình III.8. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò SAL bng công c Annhyb. 46 Hình III.9. Kt qu BLAST mu dò SHI 47 Hình III.10. Kt qu kho sát kh ng bt cp ca mu dò SHI bng công c Annhyb. 48 Hình III.11. Kt qu BLAST mu dò SAU 49 Hình III.12. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò SAU bng công c Annhyb. 50 Hình III.13. Kt qu BLAST mu dò VCH 51 Hình III.14. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò VCH bng công c Annhyb. 52  Nguyn Trng Nghĩa vi Hình III.15. Kt qu BLAST mu dò YER 53 Hình III.16. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò YER bng công c Annhyb. 54 Hình III.17. Kt qu BLAST mu dò ECO 55 Hình III.18. Kt qu kho sát kh  t cp ca mu dò ECO bng công c Annhyb. 56 Hình III.19. Kt qu n di kho sát nhi lai ca cp mi 16S_F  16S_R 58 Hình III.20. Kt qu n di sn phm PCR các mu vi khui din vi cp mi 16S rDNA. 60 Hình III.21. Kt qu n di sn phm PCR ca chng E. coli vi cp mi 23S rDNA. 61 Hình III.22. Kt qu phn ng lai RDB trên chng chun Staphylococcus aureus. 62 Hình III.23. Kt qu lai RDB trên chng chun Yersinia enterocolitica. 63 Hình III.24. Kt qu lai RDB trên chng chun Salmonella spp. và Shigella spp. 63 Hình III.25. Kt qu n di sn phm PCR các mu bnh phi din vi cp mi 16S_F  16S_R. 66 Hình III.26. Kt qu phn ng lai RDB trên mu bnh phm s 3 66 Hình III.27. Kt qu n di sn phm PCR các mu bnh phi din vi cp mi 23S_F  23S_R. 67 Hình III.28. Kt qu minh hng phát hin vi khun ca phn ng RDB trên mu bnh phm nhim Staphylococcus aureus 69 Hình III.29. Kt qu n di sn phm PCR các mu hn hp 3 loài vi khun khác nhau 70 Hình III.30. Kt qu lai RDB trên mu hn hp 3 loài vi khun khác nhau. 70  Nguyn Trng Nghĩa vii  LI C i DANH MC CH VIT TT ii DANH MC BNG BIU iv DANH MC HÌNH V v MC LC vii T V 1 PHN I. TNG QUAN TÀI LIU 3 I.1. C V CÁC NHÓM VI KHUN GÂY BNG GP . 3 I.1.1. Escherichia coli 3 I.1.1.1. m hình thái 3 I.1.1.2. ng 3 I.1.1.3. Thông tin b gen 3 I.1.1.4. Phân loi 4 I.1.2. Staphylococcus aureus 4 I.1.2.1. m hình thái 5 I.1.2.2. ng 5 I.1.2.3. Thông tin b gen 6 I.1.3. Salmonella spp. 6 I.1.3.1. m hình thái 6 I.1.3.2. ng 6 I.1.3.3. Thông tin b gen 6 I.1.4. Shigella spp. 7 I.1.4.1. m hình thái 7 I.1.4.2. ng 7 I.1.4.3. Thông tin b gen 8 I.1.5. Vibrio cholerae 8 I.1.5.1. m hình thái 8  Nguyn Trng Nghĩa viii I.1.5.2. ng 8 I.1.5.3. Thông tin b gen 9 I.1.6. Yersinia enterocolitica 9 I.1.6.1. m hình thái 9 I.1.6.2. c m ng 10 I.1.6.3. Thông tin b gen 10 I.2. THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA 10 I.2.1. Gen 16S rDNA 10 I.2.2. Gen 23S rDNA 12 I.3. CÁC K THUT PHÁT HIN VI SINH VT GÂY BNH CHO CON I 12 I.3.1. K thunh danh truyn thng [25] 12 I.3.2. K thut sinh hc phân t hii 15 I.3.2.1. K thut PCR[2][12] 15 I.3.2.2. Multiplex PCR [12] 19 I.3.2.3.  19 I.3.2.4.  20 I.4. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CU PHÁT HIN NHANH CHÓNG NG THI TÁC NHÂN VI SINH VT GÂY BNH 22 PHN II. VT LIU 25 II.1. VT LIU 25 II.2. U 25 II.2.1. Thu thp d liu và kho sát in silico 25 II.2.2. Thu thp d liu 25 II.2.3. Kho sát in silico 25 II.2.3.1.  gen mc tiêu 16S  23S rRNA 25 II.2.3.2. p mi 25 II.2.3.3. p m 26 II.2.4. Kho sát thc nghim 26 II.2.4.1. Tách chit DNA 26  Nguyn Trng Nghĩa ix II.2.4.2. Kim tra chng DNA thu nhn b ph 27 II.2.4.3. Phn ng PCR: 28 II.2.4.4. n di: 30 II.2.4.5.  30 II.2.4.6. Kh nhy c-RDB 31 II.2.4.7. Kho sát kh ng thi nhiu tác nhân vi khun gây bnh 32 PHN III. KT QU VÀ THO LUN 33 III.1. KT QU THU THP D LIU VÀ KHO SÁT IN SILICO 33 III.1.1. Thu thp d liu 33 III.1.2. Kt qu kho sát in silico 34 III.1.2.1. Thu th cp mi, mu dò 34 III.1.2.2. Kho sát h cp mi 36 III.1.2.3. Kho sát b mu dò 45 III.2. KT QU THC NGHIM 56 III.2.1. Tách chit DNA 56 III.2.2. Kt qu kho sát nhi lai ca mi 16S rDNA 58 III.2.3. Kt qu khui ca cp mi 16S_F  16S_R trên các chng vi khui chng 59 III.2.4. Kt qu khui ca cp mi 23S_F  23S_R trên chng E. coli . 60 III.2.5. Kt qu lai RDB trên các chng vi khui chng 61 III.2.6. Kt qu thc nghim trên mu bnh phm 64 III.2.7. Kh nhy cPCR-RDB 67 III.2.8. Kt qu phát hing thi các chng vi khun gây bnh 69 PHN IV. KT LU NGH 71 IV.1. KT LUN 71 IV.2.  NGH 71 TÀI LIU THAM KHO 72 [...]... Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica là c p thi t Nh m góp ph u qu trong vi c phát hi và chính xác các tác nhân vi khu n gây b nh nhi u tr khóa lu n t t nghi ng th i tr n cho b nh nhân, chúng tôi th c hi u xây d ng quy trình phát hi tài ng th i các tác 1 nhân vi khu n t các m u b nh ph m gây b ib pháp PCR k t h p Reverse Dot Lot 2 I.1 I.1.1 Escherichia coli I.1.1.1 Vi khu n Escherichia... n nhanh vi khu n gây b nh nhi d - n di, Real time PCR, Multiplex PCR, PCR k t h p gi i trình t t h p lai Reverse Dot Blot (PCR - th y nh t tr i v th i gian, s chính xác và phát hi ng th i nhi u tác nhân gây b nh nhi m trùng cùng lúc (Fiss et al., 1992; Xing et al., 2009), u tr n và k p th i cho b nh u tr cho b nh nhân Vì v y, s tìm hi u và thi t l p quy trình phát hi gây b ng th i 6 ch ng vi khu n... s phát hi n các tác nhân vi khu n gây b nh t d c, th c ph m [64] 23 k thu -RDB) so v - quát un ác nhân vi khu n gây b nh v i -RDB kh c ph c tính ngo i nhi m và Vi t Nam, k thu t PCR nghiên c u xây d ng quy trình phát hi truy n nhi c s d ng ph bi n trong nh ng ng th i các nhóm vi khu n gây b nh n gây ng nghiên c u này chúng tôi s d c th c ph m Vì v y, trong RDB v i nhi m nêu ng th i nhi u tác nhân vi. .. th n kinh, vi m màng não, Hi n nay, t i các phòng xét nghi m t i các b nh vi n pháp truy n th c s d ng r t ph bi m là d th c hi n và chi phí th p, tuy nhiên còn nhi u h n ch th c hi Vi chính n nhi u th i gian b ngo i nhi m trong quá trình nuôi c y, gây u tr Vì v y, vi c phát hi n nhanh các tác nhân gây b nh nhi u c n thi t, giúp h n ch l c s lây lan c a chúng và h tr u tr c n cho b nh nhân Hi n nay,... -) ph n ng âm tính n th ng quy trình xét nghi ng quy [25] Tuy nhiên, n th ng có m t s h n ch : tiêu t n th i gian, tiêu t n v môi 14 ng nuôi c y và các b khó phát hi nh tính vi khu n thông qua các th nghi m sinh hóa, ng th i các tác nhân gây b nh I.3.2 I.3.2.1 [2][12] I.3.2.1.1 PCR (Polymerase Chain Reaction in vitro [12] [2] I.3.2.1.2 in vitro olymerase [12] pri [12] [2] các thành ph o C 95oC trong... Listeria monocytogenes và Clostridium botulinum các tác nhân vi khu [34] 22 Trong nghiên c u c a Jin và c ng s (2005), s d t h p lai Reverse dot blot trên vùng 16S rDNA b c các tác nhân gây ng ru t bao g m Samonella sp., Escherichia coli, Shigella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Proteus spp., Bacellus cereus, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, Yersina enterocolitica...PH L C 82 x Nhóm vi khu n gây b nh truy n nhi m bao g m nh ng nhóm vi khu n gây nhi ng ru t, gây nhi ph bi n gây b ng hô h ng ru t và gây ng n c th c ph m: Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae và Yersinia enterocolitica Các loài vi khu n này gây s c kh ng nghiêm tr ng cho i v i các lo i b nh: tiêu ch y, nhi ng ru t,... x y ra gi a hai trình t hoàn toàn b sung d DNA- n hình thành các phân t lai DNA-DNA, hay áp lai dùng m khuy n cáo s d ng) ch phát hi u b ng phóng x c sinh v t m c 106-108 t bào/g m u Reverse dot blot (RDB) là m pháp s s ng m u dò oligonucleotide c c i ti c hi u allele g n c b sung các s n ph m PCR t DNA tách chi t t các m u b nh ph m Trong ph n ng PCR, b m i có g n biotin T t qu c phát hi n d a vào... trong RDB v i nhi m nêu ng th i nhi u tác nhân vi khu n gây b nh (nhóm vi khu n gây b ng ru t) trên m t s ngu n m u b nh ph m thu th c t i Vi t Nam 24 II.1 Trong nghiên c u này chúng tôi s d ng 15 m u máu (chai c c m các tác nhân vi sinh v t gây nhi m trùng huy t b ng ch n th c cung c p b i B nh vi H Chí Minh, chúng tôi còn s d ng các ch ng vi khu n gây b ng g c cung c p b i Phòng Thí Nghi m Sinh H c Phân... Staphylococcus spp và Vibrio spp [17] Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Shigella influenza [46] microarray Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni và Shigella spp [73] Reverse Dot Blot: Salmonella spp., Echerichia coli O157:H7, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria . Tên đ tài: U XÂY DNG QUY TRÌNH PHÁT HING THI CÁC TÁC NHÂN VI KHUN T CÁC MU BNH PHM GÂY BI B PHÁP PCR KT HP REVERSE DOT LOT KHOA CÔNG NGH. n cho bnh nhân, chúng tôi thc hi tài khóa lun tt nghiu xây dng quy trình phát hing thi các tác  Nguyn Trng Nghĩa 2 nhân vi khun. Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica là cp thit. Nhm góp phu qu trong vi c phát hing thi và chính xác các tác nhân vi khun gây bnh nhi