Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời yeallow head virus(YHV), taura syndrome virus(TSV) và gill associated virus(GAV) trên tôm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

1 LỜI CẢM ƠN Con xin cám ơn bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên con. Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Viện CNSH& MT trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu trong những năm qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Hải Thanh - Viện CNSH&MT Đại học Nha Trang, anh Nguyễn Trọng Hiếu công ty CPCN Việt Á, đã hướng dẫn tôi tận tình trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị phòng R&D và phòng Dịch vụ công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi về mặt tài liệu và thực nghiệm để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài. Ngoài ra, tôi cũng xin được cảm ơn tất cả những người đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành Trang 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 MỤC LỤC 2 DANH MỤC CÁC BẢNG 5 DANH MỤC CÁC HÌNH 6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8 1.1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 11 1.1.2. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam 12 1.2. Tác nhân gây bệnh 13 1.2.1. Yellow head virus (YHV) 13 1.2.1.1. Hình thái cấu trúc 13 1.2.1.2. Cách thức lan truyền 13 1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý 14 1.2.2. Taura syndrome virus (TSV) 15 1.2.2.1. Hình thái cấu trúc 15 1.2.2.2. Cách thức lan truyền 16 1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý 16 1.2.3.1. Hình thái cấu trúc 17 1.2.3.2. Cách thức lan truyền 17 1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý 17 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh 18 1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 18 1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) 20 1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử 20 1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) 20 3 1.3.3.3. Các thành phần trong phản ứng PCR 23 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Vật liệu 27 2.1.1. Chủng virus 27 2.1.2. Mẫu thí nghiệm 27 2.1.3. Mồi cho phản ứng 27 2.1.4. Hóa chất tách chiết RNA 28 2.1.5. Hóa chất cho phản ứng RT 28 2.1.6. Hóa chất cho phản ứng PCR 28 2.1.7. Hóa chất cho điện di 28 2.1.8. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29 2.2. PHUƠNG PHÁP 30 2.2.1. Chuẩn bị mẫu 30 2.2.2. Tách chiết RNA 30 2.2.2.1. Nguyên tắc 30 2.2.2.2. Tiến hành 30 2.2.3. Phản ứng RT 31 2.2.3.1. Nguyên tắc 31 2.2.3.2. Tiến hành 31 2.2.4. Khuếch đại bằng phản ứng PCR 31 2.2.4.1. Nguyên tắc 31 2.2.4.2. Tiến hành 32 1. Thành phần phản ứng PCR 32 2.2.5. Điện di trên gel agarose 32 2.2.5.1. Nguyên tắc 32 4 2.2.5.2. Tiến hành 32 1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu 32 2.2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lý thuyết 33 2.2.6.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi 33 2.2.6.2. Phương pháp đánh giá mồi. 33 2.2.7. Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi. 33 2.2.8. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của qui trình 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời Yellow head virus(YHV), Taura syndrome virus (TSV), và Gill-associated virus (GAV) Error! Bookmark not defined. 3.1. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi 35 3.2. Khảo sát độ đặc hiệu và khả năng nhân bản của mồi của mồi trên lý thuyết. 39 3.3. Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT- PCR bằng thực nghiệm 45 3.3.1. Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer 45 3.3.2. Khảo sát tỉ lệ nồng độ giữa ba cặp mồi 47 3.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai(Ta) cho 3 cặp mồi. 48 3.3.3. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu cho ba cặp mồi 49 3.3.4. Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi 51 3.3.5. Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh. 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 1. Kết luận 56 2. Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Trình tự các mồi 27 Bảng 2: Kích thƣớc của thang DNA 100bp 29 Bảng 3: Khảo sát đặc tính của mồi 35 6 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV 14 Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV. 15 Hình 3: Hội chứng Taura 16 Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 22 Hình 5 : Các dạng cấu trúc self-dimer của các mồi 36 Hình 6: Các dạng cấu trúc hetrodimer của các mồi 38 Hình 7: Khảo sát mồi YHVf trên BLAST 39 Hình 8: Khảo sát độ dặc hiệu của mồi YHVr 40 Hình 9: Khảo sát độ dặc hiệu trên BLAST của GAVf 40 Hinh 10: Khảo sát độ đặc hiệu của mồi GAVr trên BLAST 41 Hình 11: Khảo sát dộ đặc hiệu của mồi TSVf trên BLAST 41 Hình 12: Khảo sát độ đặc hiệu của TSVr trên BLAST 42 Hình 13: Kết quả sắp gióng mồi YHVf 42 Hình 14: Kết quả sắp gióng của mồi YHVr 43 Hình 15: Kết quả sắp gióng mồi GAVf 43 Hình 16: Kết quả sắp gióng của mồi GAVr 44 Hình 17: Kết quả sắp gióng của mồi TSVf 44 Hình 18: Kết quả sắp gióng của mồi TSVr 45 Hình 19: Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer 46 Hình 20: Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 48 Hình 21: Khảo sát nhiệt độ lai 49 Hình 22 : Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của 3 cặp mồi 50 7 Hình 23: Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi 51 Hình 24 : Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh 53 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT YHV: Yeallow heat virus TSV: Taura syndrome virus GAV: Gill-associated virus CTV: Cộng tác viên ARN: Acid ribonucleic DNA: Acid deoxyribonucleic PCR: Transcription polymerase chain reaction dNTP: Deoxynucleotide triphotphat DMSO: Dimethylsulfoxide dATP: Deoxy adenosine triphosphate dTTP: Thymedine triphosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate UTRs: Untranslated regions RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction kDa: kilo dalton H&E: Hematoxylin EoSin 9 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao và do sự ưu đãi của thiên nhiên, nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng với khoảng 260.000 ha với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã được áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi chưa được đảm bảo. Hơn nữa việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và đã gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể. Nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm, nhất là bệnh do virus gây ra như virus gây hội chứng Taura (Taura syndrome virus -TSV), virus gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV) và virus gây bệnh mang (gillassociated virus - GAV). Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Hiện nay, ba loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm và gây thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát ba mầm bệnh này từ lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương 10 pháp sinh học phân tử trong đó có phương pháp multiplex RT-PCR để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao. Đề tài “Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời Yeallow head virus(YHV), Taura syndrome virus(TSV) và Gill-associated virus(GAV) trên tôm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse transcription polymerase chain reaction” được thực hiện nhằm mục đích trên. [...]... trong vòng 2-3 ngày Bệnh gây hại chủ yếu trên tôm sú  Biểu hiện đầu tiên tôm phát triển rất nhanh và ăn nhiều hơn mức bình thường Tôm đột ngột dừng ăn, sau một hai ngày tôm dạt vào gần bờ và chết  Mang và gan tụy có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt  Bệnh có thể gây ra tỷ lệ chết nghiêm trọng đến 100% trong vòng 3-5 ngày  Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu... hình nuôi tôm và dịch bệnh 1.1.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước, nhất là ở vùng Trung Quốc và Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm là điều không thể tránh khỏi Các mô hình nuôi tôm, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994] Trung Quốc là nước có sản lượng tôm cao nhất... từ một số tôm tự nhiên nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đầu vàng từ ao khác và bay đến ao nuôi và mang theo mầm bệnh 14 1.2.1.3 Dấu hiệu bệnh lý Theo báo cáo của các nhà khoa học, từ năm 2001 đến nay phát hiện thấy tôm bị bệnh vàng đầu có độ tuổi từ 25 ngày đến 70 ngày Nếu là tôm nhỏ từ 25-35 ngày thì nhiễm bệnh càng nặng và sẽ chết... xác Trong thời gian đầu không thấy tôm chết quanh bờ ao nhưng lại có tôm chết dưới đáy, khoảng 2 ngày sau tôm sẽ nổi lên mặt nước và tìm thấy nhiều tôm chết ở rìa ao[Bệnh học thủy sản,2005] Hình 3: Hội chứng Taura 17 1.2.3 Gillassociated virus (GAV) 1.2.3.1 Hình thái cấu trúc GAV được coi là thành viên của loài Gill- associated virus, giống Okavirus, họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV.,... mềm vỏ, phá huỷ hệ tiêu hoá và khuếch tán, lan truyền rất nhanh Tôm sống sót giai đoạn cấp tính đi qua một giai đoạn chuyển tiếp vào giai đoạn mãn tính Trong giai đoạn này, tôm không có triệu chứng, và chỉ bị phát hiện tổn thương mô học là tạng lymphoid Cơ thể và các bộ phận khác có màu đỏ hoặc đen hồng, biếng ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước hoặc rúc vào đìa nuôi Gan tụy có màu vàng hơn bình thường, mang... đến tuổi và kích cỡ tôm Bệnh đã gây những thiệt hại rất lớn 1.1.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam Hơn 10 năm trở lại đây, nghề nuôi tôm ở nước ta phát triển mạnh Năm 2001, diện tích nuôi tôm thương phẩm đạt hơn 230.000ha, năng suất bình quân 462kg/ha, cá biệt có mô hình đạt 9-11tấn/ha, tổng sản lượng tôm nuôi 155.000 tấn Ðồng bằng sông Cửu Long là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển... phương pháp PCR thể hiện sự vượt trội trong chẩn đoán các loại bệnh Ưu điểm của phương pháp này là: - Thời gian chẩn đoán nhanh - Độ đặc hiệu cao nhờ cặp mồi thiết kế trên vùng bảo tồn của chủng virus cần phát hiện 1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước chính: - Tách chiết RNA từ bệnh phẩm biểu mô - Tạo cDNA bằng phản ứng sao... ứng có khối lượng 55, 40, 24 kDa) và một protein phụ là VP0 (58 kDa) Để phát hiện hội chứng Taura trên tôm người ta thường nghiên cứu trên gene protein capsid hoặc protein áo (coat protein) nằm trong gene protein capsid (vùng gene VP1) [4] Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV Số: chỉ vị trí nucleotide ORFs 1 và 2 được hiển thị như là các hộp mở ORF1 chứa gene qui định trình tự của các protein phi cấu... lý Virus này xuất phát từ trong tế bào chất và sau đó lây sang các biểu mô và biểu bì con bệnh Bệnh gây hại trên tôm thẻ ngay trong giai đoạn trưởng thành, trọng lượng phổ biến từ 0,1-0,5 gram từ 2-4 tuần tuổi Đây được xác định là loại virus cực kỳ nguy hiểm, thời gian ủ bệnh dài và khả năng chết lên tới 95% Bệnh kéo dài cho tới giai đoạn tôm lột xác và có khả năng cấp tính làm cho tôm èo uột, mềm vỏ,... pháp phát hiện gene trên đối tượng là tôm Penaeus monodon đã tìm ra 6 genenotyp của YHV Sử dụng mồi kiểm tra giới hạn và mục tiêu là vùng gene ORF1b đã xác định được trình tự gen được bảo tồn cao trong số 57 chủng trong sáu kiểu gen phát hiện ở P monodon nguồn gốc từ các vùng khác nhau của Ấn Độ-Thái Bình Dương [5] 1.2.1.2 Cách thức lan truyền Bệnh đầu vàng lây truyền theo đường nằm ngang, virus từ tôm . độ nhạy của qui trình 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời Yellow head virus(YHV), Taura syndrome virus (TSV), và Gill-associated. multiplex RT-PCR để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao. Đề tài Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời Yeallow head virus(YHV), Taura syndrome. virus(YHV), Taura syndrome virus(TSV) và Gill-associated virus(GAV) trên tôm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse transcription polymerase chain reaction được thực hiện nhằm mục đích trên.