Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời chlamydia trachomatis và neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real time PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM ĐỖ TRUNG HẬU XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2017 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cán chấm nhận xét 1: TS Trần Trưng Hiếu Cán chấm nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 28 tháng 07 năm 2017 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Thư ký hội đồng: TS Huỳnh Ngọc Oanh ủy viên Phản biện 1: TS Trần Trung Hiếu ủy viên Phản biện 2: TS Hoàng Anh Hoàng ủy viên Hội đồng: PGS.TS Phan Ngọc Hòa Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Nguyễn Đức Lượng TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC GS.TS Phan Thanh Sưn Nam ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Đỗ Trung Hậu MSHV: 1570255 Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1985 Nơi sinh: TP HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát đồng thời Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae phương pháp multiplex real-time PCR II NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng quy trình phát đồng thời Chlamydia trachomatis (CT) Neisseria gonorrhoeae (NG) phương pháp multiplex real-time PCR với nội dung sau: Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát CT NG Xác định thông số kỹ thuật phản ứng multiplex real-time PCR Đánh giá hiệu quy trình phát CT NG mẫu lâm sàng, in NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2017 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Tp HCM, ngày tháng năm 20 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương PGS.TS Nguyễn Thúy Hương GS.TS Phan Thanh Sơn Nam LỜI CẢM ƠN Tơi xin gửi lòi cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Bách Khoa, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tất quý thầy cô giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt trình học tập trường Ban Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương tạo điều kiện cho làm việc thực đề tài công ty PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương, Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM, người hướng dẫn khoa học cho tơi q trình hồn thành luận văn ThS Nguyễn Thị Minh Tâm, em phòng nghiên cứu, phòng Kiểm định Chất lượng toàn thể đồng nghiệp làm việc công ty TNHH CNSH Khoa Thương hỗ trợ đồng hành suốt thời gian qua Những người thân yêu tôi: Ba mẹ, Bà xã, trai anh chị em mến thương Cảm ơn Bà xã trai tạo động lực cho tơi hồn thành luận văn Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017 Đỗ Trung Hậu TÓM TẮT Chlamydia trachomatis (CT) Neisseria gonorrhoeae (NG) hai tác nhân vi khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến giới thường kèm với Nhằm tạo công cụ hỗ trợ, phát nhanh xác CT NG bệnh phẩm, chúng tơi xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát đồng thời hai tác nhân gây bệnh Phản ứng multiplex real-time PCR xây dựng có giới hạn phát LOD50 sao/phản ứng, với độ đặc hiệu cao cho CT NG Quy trình có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏ 1% hệ số biến thiên liên phản ứng nhỏ 2% Chúng thực 100 mẫu dịch phết tế bào, kết cho thấy có 20% trường hợp nhiễm CT, 15% trường hợp nhiễm NG 8% trường hợp đồng nhiễm CT/NG Đồng thời quy trình chúng tơi có kết với kết giải trình tự Nghiên cứu tiền đề cho phát triển kit phát đồng thời CT NG ABSTRACT Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) are the most common pathogens which cause sexually ửansmitted diseases in the world In order to create a toolkit used for a rapid and accurate detection of CT and NG in clinical samples, we developed a multiplex real-time PCR test that can simultaneously detect both pathogens The limit of detection (LOD50) of the real-time PCR was copies per reaction The protocol had good repeatability, with intra-assay and interassay coefficients of variability inferior to 1% and 2%, respectively We tested 100 clinical samples for CT and NG The infection rates were 20 % for NG and 15% for CT, co-infection of CT/NG accounted for 8% in total Our results were confirmed by Sanger sequencing The study constituted the base for further development of diagnostic kit simultaneously detecting CT and NG in clinical samples LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017 Đỗ Trung Hậu V MỤC LỤC TÓM TẮT ii ABSTRACT .iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan Chlamydia trachomatis (CT) Neisseria gonorrhoeae (NG) 1.1.1 Giới thiệu CT 1.1.2 Giới thiệu NG 1.2 Một số phuơng pháp phát CT NG 11 1.2.1 Phuơng pháp nuôi cấy truyền thống 11 1.2.2 Phuơng pháp kháng thể huỳnh quang trục tiếp 12 1.2.3 Phuơng pháp miễn dịch liên kết enzyme 12 1.2.4 Phuơng pháp PCR multiplex PCR .13 1.2.5 Phuơng pháp real-time PCR multiplex real-time PCR 13 1.3 .Một số nghiên cứu giới Việt Nam 16 1.3.1 Trên giới 16 1.3.2 Tại Việt Nam .17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2 Vật liệu 19 2.2.1 Mẩu thực nghiệm 19 2.2.2 Mồi, mẫu dò amplicon 19 2.2.3 Hóa chất 19 V 2.2.4 Thiết bị dụng cụ 20 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 20 2.4 Bố trí thí nghiệm 22 Trang 29 Kết - Biện luận 3.I.2.3 Kết khảo sát nồng độ mồi phản ứng CT, NG IC Nồng độ mồi yếu tố cần khảo sát quy trình tối ưu hóa phản ứng Nồng độ mồi cao có khả ức chế phản ứng Dựa vào kết thực nghiệm, cơng trình nghiên cứu khuyến cáo nồng độ mồi ửong phản ứng PCR từ 0,2 - 1,0 pM [23] Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng monoplex nồng độ: 200 nM, 400 nM, 600 nM, 800 nM 1000 nM Mỗi nồng độ lặp lại lần, đánh giá kết dựa giá trị Ct, kết Ct trung bình phản ứng trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Giá trị ct phản ứng CT, NG IC nồng độ mồi Nồng độ mồi (nM) 200 Nồng độ (bản sao/phản ứng) 400 600 35,89 ± 34,35 35,43 ± 0,02 ± 0,01 0,28 28,90 ± 28,29 28,80 ± Phản ứng CT 104 ± 0,08 0,02 0,05 21,45 ± 21,44 22,03 ± 106 0,06 ±0,11 0,02 36,25 ± 35,10 35,63 ± 102 0,03 ± 0,08 0,23 28,89 ± 28,51 28,78 ± 104 Phản ứng NG 0,05 ±0,10 0,23 22,17 ± 22,01 22,24 106 0,01 ± 0,03 ± 0.07 34,21 33,20 33,23 ± 102 ±0,25 ±0,10 0,67 27,33 26,54 ± 26,55 104 Phản ứng IC ± 0,24 0,24 ±0,19 20,17 19,67 19,83 106 ±0,13 ±0,31 ± 0,06 Từ kết khảo sát nồng độ mồi ưong Bảng 3.5 cho thấy: 102 800 1000 35,85 ± 0,21 29,19 ± 0,09 22,48 ± 0,08 35,18 ±0,13 28,83 ±0,13 22,27 ±0,13 34,07 ± 0,67 26,45 ± 0,20 19,96 ±0,17 35,78 ± 0,41 28,84 ± 0,32 22,25 ± 0,04 36,05 ±0,17 29,03 ±0,19 22,20 ± 0,01 33,97 ±0,17 26,07 ± 0,40 19,80 ±0,31 - Đối với phản ứng CT NG: nồng độ mồi 400 nM có giá trị Ct nhỏ nồng độ mẫu khảo sát, nên chọn nồng độ mồi cho phản ứng CT phản ứng NG 400 nM - Đối với phản ứng IC sử dụng nồng độ mồi thấp khoảng chấp nhận Nhằm tránh cạnh tranh trình nhân trình tự mục tiêu Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 30 Kết - Biện luận CT NG phản ứng multiplex Mặt khác, hàm lượng trình tự DNA dùng làm chứng nội tách chiết từ dịch phết tế bào thu nhiều nên không cần độ nhạy cao Từ đó, chúng tơi chọn nồng độ mồi cho phản ứng IC 200 nM giá trị Ct nồng độ mồi 400 - 600 nM cho kết tốt 3.I.2.4 Kết khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng CT, NG IC Tương tự mồi, nồng độ mẫu dò thơng số cần khảo sát nồng độ mẫu dò thấp ảnh hưởng đến hiệu phản ứng Ngược lại nồng độ mẫu dò cao gây tốn không cần thiết làm ảnh hưởng đến giá thành phản ứng Chúng khảo sát nồng độ mẫu dò nồng độ 100 nM, 200 nM, 300 nM Mỗi nồng độ lặp lại lần, đánh giá kết dựa giá trị Ct, kết Ct trung bình phản ứng trình bày Bảng 3.6 Hình 3.2 Bảng 3.6 Giá trị ct phản ứng CT, NG IC nồng độ mẫu dò 100 200 300 102 35,86 ± 0,25 34,98 ±0,12 34,73 ±0,13 104 28,76 ±0,17 28,01 ±0,10 27,90 ± 0,05 10 22,01 ± 0,07 21,33 ± 0,03 21,18 ±0,08 10 36,69 ± 0,23 35,47 ±0,18 35,01 ± 0,29 104 29,19 ±0,05 28,63 ± 0,06 28,57 ±0,10 106 22,49 ± 0,06 22,10 ±0,04 21,99 ± 0,05 10 33,90 ± 0,21 33,97 ± 0,30 33,93 ± 0,20 10 27,29 ±0,15 27,16 ±0,09 27,23 ± 0,08 10 20,36 ± 0,06 20,28 ± 0,03 20,25 ± 0,08 Nồng độ mẫu dò (nM) Nồng độ (bản sao/phản ứng) Phản ứng CT Phản ứng NG Phản ứng IC Ghi chú: N'-mg độ mẫu dò :100nM Luận văn Thạc sĩ :200nM :300nM Đỗ Trung Hậu Trang 31 Kết - Biện luận Hình 3.2 Kết khảo sát nồng độ mẫu dò phản ứng CT, NG IC Dựa vào kết ửong Bảng 3.6 Hình 3.2 cho thấy: - Phản ứng CT phản ứng NG có giá trị Ct cường độ huỳnh quang tốt nồng độ 200 - 300 nM không khác biệt nhiều Để giảm giá thành cho phản ứng, chúng tơi chọn nồng độ mẫu dò cho phản ứng CT NG 200 nM - Đối với phản ứng IC, giá trị Ct cường độ huỳnh quang không khác biệt nồng độ mẫu dò khảo sát nên chúng tơi chọn nồng độ mẫu dò thấp cho phản ứng IC 100 nM 3.1.2.5 Kết khảo sát nồng độ enzyme Taq DNA polymerase phản ứng CT, NGvà IC Enzyme Taq polymerase nhân tố quan trọng PCR ảnh hưởng đến hiệu suất độ nhạy phản ứng Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase ttong phản ứng: 1,0 U; 1,5 U; 2,0 U; 2,5 u Mỗi nồng độ lặp lại lần, đánh giá kết dựa giá trị Ct, kết Ct trung bình phản ứng trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Giá trị ct phản ứng CT, NG IC nồng độ enzyme Tag DNA polymerase 34,77 ± 0,07 34,76 ±0,15 104 28,11 ±0,01 27,89 ± 0,04 27,87 ± 0,07 27,85 ± 0,02 21,23 ±0,04 21,22 ±0,08 21,20 ±0,02 21,21 ±0,06 10 36,17 ±0,15 35,43 ± 0,46 34,65 ± 0,12 34,64 ±0,13 104 28,77 ± 0,01 28,63 ± 0,20 28,31 ±0,07 28,35 ± 0,02 106 22,18 ±0,01 10 Phản ứng NG Phản ứng IC 21,99 ±0,02 21,90 ±0,08 21,65 ±0,07 34,24 ± 0,22 34,43 ± 0,21 33,79 ±0,18 33,50 ± 0,26 26,98 ±0,18 26,92 ± 0,01 26,89 ±0,13 26,88 ±0,13 20,25 ± 0,05 20,20 ± 0,06 20,16 ±0,07 20,09 ± 0,09 10 10 106 Dựa vào kết Bảng 3.7, chúng tơi nhận thấy phản ứng CT có giá trị Ct không khác biệt nồng độ từ 1,5 - 2,5 u Đối với phản ứng NG, giá trị Ct không Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 32 Kết - Biện luận khác biệt nồng độ từ 2,0 - 2,5 giá trị Ct phản ứng IC khác biệt không nhiều nồng độ từ 1,0 - 2,5 Tuy nhiên, nồng độ 2,0 - 2,5 phản ứng có giá trị Ct tốt sụ khác biệt không đáng kể nồng độ Do đó, chúng tơi chọn nồng độ 2,0 Taq DNA polymerase làm nồng độ chung cho phản ứng monoplex nồng độ để thiết lập phản ứng multiplex 3.I.2.6 Kết kiểm tra hiệu nhân ngưỡng phát phản ứng monoplex CT, NG IC Một phản ứng real-time PCR sau tối ưu cần phải nhạy đạt hiệu nhân tốt, sau chu kỳ nhiệt số lượng sản phẩm nhân tăng gấp đôi Hiệu nhân đánh giá qua việc xây dựng đường chuẩn từ dãy nồng độ pha loãng mẫu biết Đối với phản ứng real-time PCR, giá trị hệ số tương quan R2 phải lớn hom 0,980 giá trị hiệu nhân cần đạt từ 90% - 105% [18], [25] Trong thí nghiệm này, chúng tơi kết hợp kiểm tta hiệu nhân ngưỡng phát phản ứng monoplex CT, NG IC thông Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 33 Kết - Biện luận qua dãy nồng độ trình tự mục tiêu pha loãng bậc 10 từ 108 giảm dần đến 10° sao/phản ứng Mỗi nồng độ lặp lại lần, kết thể Bảng 3.8, Hình 3.3, Hình 3.4 Hình 3.5 Bảng 3.8 Hiệu nhân ngưỡng phát phản ứng CT, NG, IC Nồng độ (bản sao/phản ứng) Kết ct trung bình Phản ứng CT Phản ứng NG Phản ứng IC Chứng âm 10° NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt 101 102 37,63 ± 0,09 34,30 ± 0,03 38,31 ±0,11 34,98 ± 0,05 37,56 ±0,13 34,61 ± 0,07 103 104 31,19 ±0,04 27,34 ± 0,02 31,85 ±0,03 28,37 ± 0,01 30,65 ± 0,03 27,05 ± 0,03 105 106 24,06 ± 0,02 20,78 ± 0,01 24,80 ± 0,04 21,47 ±0,05 23,52 ± 0,02 19,76 ± 0,03 107 17,49 ± 0,01 18,34 ±0,07 16,69 ± 0,02 10 Hệ số tương quan R2 13,91 ±0,01 1,000 15,01 ±0,11 1,000 13,50 ± 0,03 0,999 Độ dốc (Slope) -3,378 -3,336 -3,524 Hiệu nhân PCR (%) 97,8% 99,4% 92,3% Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 34 Kết - Biện luận hiệu nhân phản ứng CT NG đạt hiệu cao 97,8% 99,4% với hệ số 1133 ■■ tương quan R2 Đối với phản ứng IC hiệu nhân 92,3% với hệ số tương quan R2 =0,999 Độ dốc (Slope) phản ứng nằm ttong giới hạn của1O phản ■5T 23 + 133] - ứng real-time PCR (-3,1 đến -3,6), khoảng £ cách để chứng minh thao tác pha loãng 103 333 mẫu trình PCR đạt hiệu cao Như vây, phản ứng cho thấy 2độ 10 tuyến tính hiệu nhân cao Loụ Hsmg QMiHy 1O Kết cho thấy, phản ứng CT, NG IC đều23Cpctn khơng Wcho tín «3hiệu huỳnh 13 aa quang vượt tín hiệu nồng độ 10° sao/phản ứng nồng độ 10 nồng độ thấp cho tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu Do ngưỡng phát phản ứng xác định 10 sao/phản ứng, ngưỡng phát phù hợp với cơng trình công bố Dhawan cộng (2015) phát CT phản ứng real-time PCR 10 sao/phản ứng, đồng thời nghiên cứu Dhawan công bố Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 35 Kết - Biện luận phù hợp với với độ nhạy kit COBAS TaqMan c trachomatis Test [24] Vì vậy, xác định ngưỡng phát phản ứng monoplex CT, NG IC 10 sao/phản ứng ngưỡng phát làm độ nhạy để đánh giá phản ứng multiplex 3.1.3 Kết đánh giá tính hiệu tối ưu hóa phản ứng multiỉex realtime PCR Từ thông số tối ưu nhiệt độ lai, nồng độ MgCl 2j nồng độ mồi, nồng độ mẫu dò nồng độ enzyme phản ứng monoplex CT, NG IC Chúng tiến hành thiết lập phản ứng multiplex real-time PCR phát đồng thời CT NG cách kết hợp thành phần tối ưu hóa phản ứng monoplex lại với Kết thiết lập phản ứng multiplex real-time PCR trình bày Bảng 3.9 Bảng 3.9 Thành phần phản ứng multiplex real-time PCR Thành phần Nồng độ ban đầu MgCl2 25 mM 3,0 mM Sau thiết lập phản ứng multiplex, thực đánh giá tính hiệu phản ứng multiplex real-time PCR cách so sánh phản ứng multiplex với phản ứng monoplex CT, NG IC: tất phản ứng monoplex multiplex chạy với nhau, sử dụng mẫu chứng dương, phản ứng PCR lặp lại lần chạy máy real-time PCR Sửatagene MX3005P với chương trình sau: chu kỳ: 95°c - 15 phút 40 chu kỳ: 95°c - 20 giây 60°C - 60 giây (Đọc tín hiệu FAM, HEX CY5) Chúng tơi đánh giá tính hiệu phản ứng cách so sánh giá trịĐỗCtTrung giữaHậu phản Luận văn Thạc sĩ Trang 36 Kết - Biện luận Bảng 3.10 Kết đánh giá tính hiệu phản ứng multiplex real-time PCR Nồng độ (bản sao/phản ứng) CT (HEX) NG (FAM) Phản ứng Multiplex real-time PCR Monoplex real-time PCR 102 104 34,17 ±0,02 27,72 ± 0,01 34,20 ± 0,03 27,64 ± 0,03 106 20,96 ± 0,01 20,97 ± 0,01 102 34,31 ±0,02 34,33 ± 0,02 104 27,90 ± 0,02 21,28 ±0,01 27,96 ±0,01 21,27 ± 0,02 33,71 ±0,03 33,69 ± 0,04 26,35 ± 0,01 19,56 ±0,01 26,40 ±0,01 19,80 ± 0,03 106 102 IC (CY5) 104 106 Hình 3.6 Kết đánh giá tính hiệu phản ứng multiplex real-time PCR Kết Bảng 3.10 Hình 3.6 cho thấy giá trị Ct phản ứng multiplex real-time PCR phát đồng thời CT (màu HEX), NG (màu FAM) IC (màu CY5) với giá trị Ct phản ứng monoplex CT, NG IC không khác biệt nên không tiến hành tối ưu hóa phản ứng multiplex [18] Như vậy, chúng tơi thiết lập thành công phản ứng multiplex real-time PCR với thành phần phản ứng Bảng 3.9 Sau chúng tơi tiếp tục so sánh phương pháp tách chiết DNA để chọn phương pháp phù hợp cho quy trình phát CT NG 3.1.4 Kết so sánh phưong pháp tách chiết DNA Quy trình phát CT NG bao gồm bước tách chiết DNA mẫu dịch phết tế bào thực phản ứng multiplex real-time PCR Nhằm lựa chọn phương pháp tách chiết DNA phù hợp, so sánh hiệu phát CT NG quy trình tách chiết DNA từ kít (kít tách chiết DNA tủa, kít tách chiết DNA sử dụng cột silica kít Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 37 Kết - Biện luận tách chiết DNA bán tự động) Thí nghiệm tiến hành cách tách chiết DNA mẫu dịch phết tế bào đồng nhiễm CT/NG từ nồng độ thấp đến nồng độ cao mẫu lặp lại lần phương pháp tách chiết Sau thu DNA, tiến hành đặt phản ứng real-time PCR chạy với nồng độ chứng dương 102, 104, 106 sao/phản ứng có trình tự CT NG để xây dựng đường cong chuẩn xác định nồng độ mẫu dịch phết Vì phương pháp tách chiết sử dụng lượng mẫu dịch phết tế bào ban đầu khác (tách chiết tủa sử dụng 100 pl, cột silica sử dụng 200 pl, bán tự động sử dụng 300 pl) thu lượng DNA khác nhau, nên sau kết thể nồng độ sao/phản ứng đường cong chuẩn (Hình 3.7) phải nhân với hệ số pha lỗng mẫu để đơn vị đồng sao/ml dịch phết tế bào Đối với phương pháp tách chiết tủa nhân với hệ số K=50 để nồng độ sao/ml dịch phết tế bào, tương tự tách chiết DNA sử dụng cột silica nhân với hệ số K=25 tách chiết bán tự động nhân với hệ số K=80/3 Tiêu chuẩn đánh giá chọn phương pháp tách chiết DNA phát CT NG có kết định lượng trung bình mẫu cao nhất, kết định lượng xem khác biệt chênh lệch nồng độ sao/ml dịch phết tế bào mẫu phương pháp lớn bậc pha loãng theo hệ số 10 (1 logio) [11] Ket nồng độ trung bình mẫu trình bày Bảng 3.11 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 38 Kết - Biện luận Hình 3.7 Biểu đồ đường cong chuẩn màu HEX (phải) màu FAM (trái) Bảng 3.11 Bảng kết so sánh phưong pháp tách chiết DNA Mầu Chứng âm Phát hiên CT/NG Kết (bản sao/ml) Tủa Cột silica Bán tự động CT N/A N/A N/A NG N/A N/A N/A CT 3,Ố7E+O1 4,52E+01 4,30E+01 NG 1J2E+02 345E+02 2,92E+02 CT 240E+02 2,53E+02 2,42E+02 NG l,38E+03 l,89E+03 l,59E+03 CT 2,01E+03 3,02E+03 2,35E+03 NG 1J2E+04 l,55E+04 1J7E+04 CT 2,32E+04 2,7ỐE+O4 2,48E+04 NG l,15E+05 l,33E+05 M3E+05 CT 3,11E+O5 2,54E+05 3,31E+05 NG l,48E+06 l,23E+06 l,38E+06 CT 3,09E+06 3,24E+06 3,53E+06 NG l,41E+07 l,37E+07 l,40E+07 CT 5,13E+07 4,31E+07 3,97E+07 NG l,75E+08 l,68E+08 l,47E+08 *sổ liệu quy đổi nồng độ ỉog10và độ lệch chuẩn xem phụ lục 2.6 Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 39 Kết - Biện luận Hình 3.8 Biểu đồ kết so sánh phuong pháp tách chiết DNA Bảng 3.12 Bảng thống kê hệ số tưong quan “r” phưong pháp tách chiết DNA Tủa Tủa Cột silica Bán tự động 0,999359602 0,999597556 Cột silica 0,999835744 Bán tự động Dựa vào kết Bảng 3.11 so sánh phương pháp tách chiết DNA mẫu dịch phết tế bào, phương pháp cho hiệu tương đương (các nồng độ chênh lệch nhỏ 0,3 logio), hệ số tương quan phương pháp 0,99 xác định phần mềm Microsoft Excel 2010, kết khơng có trường hợp mẫu bị ức chế phương pháp tách chiết DNA Do đó, phương pháp tách chiết DNA sử dụng quy trình tách chiết mẫu dịch phết tế bào để phát CT NG Tuy nhiên, chọn phương pháp tách chiết sử dụng cột silica để tiến hành tách chiết DNA mẫu lâm sàng cho nghiên cứu tránh độc hại so với phương pháp tách chiết DNA tủa, đồng thời tiết kiệm chi phí so với phương pháp tách chiết DNA bán tự động 3.2 Kết xác định thông số kỹ thuật phản ứng multiplex real-time PCR 3.2.1 Độ nhạy phân tích Độ nhạy phân tích đánh giá qua số LOD (limit of detection), giới hạn lượng mẫu phân tích có chất đặc trưng cho kết dương tính Trong thí nghiệm này, giới hạn phát tính theo nguyên tắc xác định giới hạn 50% (LOD50) với độ tín cậy 95% Chúng tơi sử dụng nồng độ chứng dương có Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 40 Kết - Biện luận trình tự (CT, NG IC) pha loãng gồm: 1, 5, 10, 20 100 sao/phản ứng Mỗi nồng độ lặp lại 10 lần thực lần chạy khác ngày khác dòng máy Stratagene Mx3005P để xác định độ nhạy LOD50 phản ứng multiplex real-time PCR Kết xác định thông qua số lần cho kết dương tính 10 lần lặp lại nồng độ chứng dương pha loãng Độ nhạy LOD50 tính phần mềm Kaber-Spearman [61], kết trình bày Bảng 3.13, Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.13 Độ nhạy phân tích phản ứng multiplex phát CT (HEX) Lần chạy Nồng độ (bản sao/phản ứng) 10 20 100 0/10 7/10 10/10 10/10 10/10 LOD50 (bản sao/phản ứng) 3,159 (2,177-4,584) 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 3,545 (2,443-5,144) 3,545 (2,443-5,144) 0/10 7/10 10/10 10/10 10/10 3,159 (2,177-4,584) Bảng 3.14 Độ nhạy phân tích phản ứng multiplex phát NG (FAM) Lần chạy Nồng độ (bản sao/phản ứng) 10 20 100 0/10 5/10 10/10 10/10 10/10 LOD50 (bản sao/phản ứng) 3,977 (2,741-5,772) 0/10 5/10 10/10 10/10 10/10 3,977 (2,741-5,772) 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 3,545 (2,443-5,144) 0/10 5/10 10/10 10/10 10/10 3,977 (2,741-5,772) Bảng 3.15 Độ nhạy phân tích phản ứng multiplex phát IC (CY5) Lần chạy Nồng độ (bản sao/phản ứng) 10 20 100 0/10 7/10 10/10 10/10 10/10 LODso (bản sao/phản ứng) 3,159 (2,177-4,584) 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 3,545 (2,443-5,144) 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 3,545 (2,443-5,144) 0/10 6/10 10/10 10/10 10/10 3,545 (2,443-5,144) Kết Bảng 3.13, 3.14 3.15 cho thấy phản ứng multiplex phát 100% (dương tính 10/10) CT, NG IC tất lần chạy nồng độ 10 sao/phản ứng, phù hợp với giới hạn phát phản ứng monoplex mà Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 41 Kết - Biện luận tối ưu thành công Giới hạn phát phù hợp với cơng trình công bố tác giả Tabrizi cộng (2013) phát đồng thời CT NG phương pháp real-time PCR [55], Đồng thời phản ứng multiplex có khả phát CT IC giới hạn 50% từ 3,159 - 3,545 sao/phản ứng, phát NG từ 3,545 - 3,977 sao/phản ứng lần chạy Do đó, chúng tơi xác định giới hạn phát LOD50 phản ứng multiplex real-time PCR phát đồng thời CT NG sao/phản ứng 3.2.2 Độ đặc hiệu phân tích Độ đặc hiệu phân tích khả phân biệt trình tự mục tiêu trình tự khác xuất mẫu Để kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng multiplex realtime PCR thực nhóm mẫu: Mẩu có vi sinh vật mục tiêu gồm CT NG với 21 mẫu có trình tự vi sinh vật khác Đánh giá độ đặc hiệu cách so sánh kết thực tế thu tiến hành phản ứng realtime PCR với kết dự đốn Kết trình bày Hình 3.9 Bảng 3.16 CT NG 21 DNA vi sinh vật khác lfl ị - í* — pj——ị Hình 3.9 Kết kiểm tra độ đặc hiệu phân tích Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu Trang 42 Kết - Biện luận Bảng 3.16 Kết độ đặc hiệu phân tích phản ứng multiplex real-time PCR STT HEX (CT) Chủng FAM (NG) CY5 (IC) Ket Chlamydia trachomatis 21,91 ± No Ct 0,01 21,17 ±0,01 (+) CT Neisseria gonorrhoeae No Ct 22,11 ± 0,01 22,48 ± 0,01 (+)NG Herpes simplex vius (HSV) No Ct No Ct 22,35 ± 0,02 (-) CT/NG Human (HPV) Virus No Ct No Ct 22,11 ±0,02 (-) CT/NG Hepatitis B Virus (HBV) No Ct No Ct 24,45 ± 0,01 (-) CT/NG Helicobacter pylori (HPY) No Ct No Ct 23,36 ± 0,03 (-) CT/NG Mycobacterium tuberculosis (MTB) No Ct No Ct 25,23 ± 0,02 (-) CT/NG Escherichia coll No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG Salmonella ATTc 13311 No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 10 Shigella dysenteria No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 11 Shigella flexeri No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 12 Shigella sonnei No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 13 Shigella boydii No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 14 Staphylococcus aureus No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 15 Vibrio cholerae No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 16 Vibrio parahaemolyticus No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 17 Listeria monocytogenes No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 18 Listeria ivanovii No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 19 Listeria innocua No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 20 Campylobacter coll No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 21 Campylobacter jejuni No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 22 Bacillus subtilis No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 23 Clostridium botulinium No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG 24 Chứng âm No Ct No Ct No Ct (-) CT/NG Luận văn Thạc sĩ Papilloma Đỗ Trung Hậu Trang 43 Kết - Biện luận Kết Bảng 3.16 cho thấy mồi nhân trình tự mục tiêu khơng gây tượng dương tính giả CT cho kết dương tính với mẫu nhiễm CT, NG cho kết dương tính với mẫu nhiễm NG IC cho kết dương tính với mẫu DNA có mẫu thu từ người (CT, NG, HSV, HPV, HBV, HPY, MTB), 21 mẫu DNA vi sinh vật khác cho kết âm tính với CT/NG Như vậy, mẫu vi sinh vật kiểm tra đặc hiệu 100 % so với dự đoán 3.2.3 Độ lặp lại Độ lặp lại xác định cách đánh giá thay đổi kết lặp lại thể qua hai hệ số, hệ số biến thiên nội phản ứng hệ số biến thiên liên phản ứng Hệ số biến thiên thấp độ lặp lại cao Để kiểm tra độ lặp lại phản ứng, sử dụng mẫu chứng dương 10 2, 104 107 sao/phản ứng, nồng độ lặp lại lần lần chạy lặp lại lần chạy với lơ hóa chất khác dòng máy real-time PCR khác (Stratagene Mx3005P, CFX 96, AriaMx) Xác định hệ số biến thiên dựa giá trị Ct Kết hệ số biến thiên nội phản ứng xác định lần chạy, hệ số biến thiên liên phản ứng đánh giá lơ hóa chất khác lần chạy 1, 2, (Phụ lục - Bảng 3.1, Bảng 3.2, Bảng 3.3) hệ số biến thiên liên phản ứng dòng máy khác lần chạy 4, 5, (Phụ lục - Bảng 3.4, Bảng 3.5, Bảng 3.6) Tiêu chí đánh giá độ lặp lại hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏ 10% hệ số biến thiên liên phản ứng nhỏ 15% [52], Kết trình bày bảng sau: %12 lữ B H 10 0.41 0,32 0,37 0.74 0.77 0.72 Ùn Un Un Un ũn Un Giỉtrị chạy chạy chạy ỉ chạy chạy chạy cháp nhận Hình 3.10 Hệ số biến thiên nội phản ứng Luận văn Thạc sĩ Đỗ Trung Hậu ... TÀI: Xây dựng quy trình phát đồng thời Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae phương pháp multiplex real- time PCR II NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng quy trình phát đồng thời Chlamydia trachomatis. .. tơi xây dựng quy trình multiplex real- time PCR phát đồng thời hai tác nhân gây bệnh Phản ứng multiplex real- time PCR xây dựng có giới hạn phát LOD50 sao/phản ứng, với độ đặc hiệu cao cho CT NG Quy. .. phương pháp multiplex real- time PCR với nội dung sau: Thiết lập quy trình multiplex real- time PCR phát CT NG Xác định thông số kỹ thuật phản ứng multiplex real- time PCR Đánh giá hiệu quy trình phát