XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY NGUYỄN THỊ KHÁNH TRANG CN ĐẶNG HÒA THỌ Tháng 7/2010   BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY NGUYỄN THỊ KHÁNH TRANG CN ĐẶNG HÒA THỌ Tháng 7/2010   LỜI CẢM ƠN   Tôi xin chân thành cảm ơn: Cô Lê Huyền Ái Thúy tận tình hướng dẫn dẫn dắt tơi từ ngày đầu hồn tất khóa luận tốt nghiệp Công Ty Việt Á tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập cơng ty để tơi hồn thành khóa luận Các anh chị phòng nghiên cứu phòng dịch vụ công ty, người hỗ trợ, hướng dẫn, bảo tơi tận tình thời gian thực tập đặc biệt chị Đặng Hòa Thọ trực tiếp hướng dẫn tơi q trình làm khóa luận cơng ty Các Thầy Cơ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm hết lòng truyền đạt cho tơi kiến thức q báu thời gian tơi theo học trường Gia đình người bạn ủng hộ tơi chia khó khăn suốt thời gian qua TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2010 Nguyễn Thị Khánh Trang               i   TĨM TẮT   Bệnh đường tình dục vấn đề đáng ý Việt Nam nói riêng giới nói chung Tại Việt Nam, theo ước tính có khoảng 800.000 đến 1.000.000 trường hợp mắc bệnh đường tình dục năm (trong lậu chlamydia hai bệnh phổ biến chưa có số thống kê cụ thể) Bệnh lậu chlamydia có triệu chứng lâm sàng giống nhau, dễ chẩn đoán nhầm dẫn đến điều trị sai gây bệnh mạn tính để lại nhiều biến chứng Hiện nay, phương pháp soi tươi, nuôi cấy hay kháng nguyên để chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis (gây bệnh Chlamydia) Neisseria gonorrhoeae (gây bệnh lậu) không đủ nhạy đối tượng nhiễm chlamydia, nhiễm lậu cầu mạn tính Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực nghiên cứu “Xây dựng quy trình phát đồng thời Neisserria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis kỹ thuật realtime PCR” để chẩn đốn nhanh, sớm xác tác nhân gây bệnh Với mục tiêu này, thiết kế hệ mồi (F2, R2), mẫu dò (probe2) đặc hiệu gene porA N gonorrhoeae hệ mồi (primerF-C, primerR-C), mẫu dò (probeC) đặc hiệu gene MOMP C trachomatis Với hỗ trợ chương trình máy tính (Blast, ClustalX, Annhyb…), đặc tính, khả hoạt động, nhiệt độ lai tối ưu hai hệ mồi, mẫu dò kiểm tra lý thuyết thực nghiệm Kết cho thấy hai hệ mồi, mẫu dò hoạt động tốt nhiệt độ lai 550C khuếch đại đặc hiệu gene porA vi khuẩn N gonorrhoeae gene MOMP vi khuẩn C trachomatis Độ nhạy độ đặc hiệu quy trình khảo sát để đánh giá hiệu quy trình, kết thu độ nhạy quy trình 3x103copies/ml độ đặc hiệu 100% Cuối cùng, quy trình ứng dụng 45 mẫu bệnh phẩm (thu thập từ Viện Da Liễu Bệnh Viện Từ Dũ) phát 17 mẫu dương tính với bệnh lậu, 10 mẫu dương tính với bệnh chlamydia mẫu dương tính với đồng thời hai bệnh     ii   SUMMARY   Sexually transmitted diseases are a attracted problem in Viet Nam and in the world In Viet Nam, it is estimated that there are approximately from 800 thousand to a million cases infected the sexually transmitted diseases every year (gonorrhea and chlamydia are both general diseases but there still are not specific statistics) Because gonorrhea and chlamydia have the same clinical symtoms, it is easy to make wrong diagnosis between gonorrhea and chlamydia and lead to the wrong treatment It will cause a chronic disease At present, the microscopy, culture or antigen methods are not enough sensitivity on the patients infected the chronic gonorrhoe and chlamydia Therefore, we carried out the research with title “Setting protocol co-detect Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis by real-time PCR” in order to diagnose faster, ealier and more accurate these diseases With this target, we designed the specific primer pair (F2, R2) and probe (probe2) on N gonorrhoeae porA pseudogene and the specific primer pair (primerF-C, primerR-C) and probe (probeC) on C trachomatis MOMP gene With the helping of the computer programs (Blast, ClustalX, Annhyb…), we tested a characteristic, activitive possibility, optimal temperature annealing of the two primer pairs and probes on the theoretical and experimental research Both primer pairs and probes active well at 550C and amplify specifically the N gonorrhoeae porA pseudogene and C trachomatis MOMP gene To evaluate the effective of the protocol, we investigated the specificity and sensitivity of the protocol The sensitivity obtain 3.103copies/ml and the specificity obtain 100% Finally, we tested the optimal protocol on 45 specimens (collected from Institude of Dermaeology and Tu Du Hospital) and detected 17 possitive specimens with gonorrhea, 10 possitive specimens with chlamydia and possitive specimens with both diseases iii   MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn…………………………………………………………………………………i Tóm tắt…………………………………………………………………………………….ii Summary………………………………………………………………………………….iii Mục lục………………………………………………………………………………… iv Danh sách chữ viết tắt………………………………………………………………viii Danh sách bảng……………………………………………………………………… x Danh sách hình……………………………………………………………………….xi Chương MỞ ĐẦU x 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh chlamydia bệnh lậu 2.2 Tác nhân gây bệnh 2.2.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis 2.2.1.1 Phân loại khoa học 2.2.1.2 Đặc điểm 2.2.1.3 Sinh bệnh học 2.2.1.4 Các yếu tố gây độc 2.2.2 Vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae 2.2.2.1 Phân loại khoa học 2.2.2.2 Đặc điểm 2.2.2.3 Sinh bệnh học iv   2.2.2.4 Các yếu tố gây độc 11 2.3 Tình hình bệnh chlamydia bệnh lậu giới nước 12 2.3.1 Trên giới 12 2.3.2 Trong nước 14 2.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh chlamydia bệnh lậu 16 2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 16 2.4.2 Các phương pháp chẩn đốn phòng thí nghiệm 16 2.4.2.1 Phương pháp kính hiển vi nhuộm gram 16 2.4.2.2 Phương pháp nuôi cấy truyền thống 17 2.4.2.3 Phương pháp miễn dịch (phương pháp ELISA 17 2.4.3 Các phương pháp sinh học phân tử 17 2.4.3.1 Ligase chain reaction (LCR) 17 2.4.3.2 Transcription mediated amplification (TMA) 18 2.4.3.3 DNA strand displacement amplification SDA (BD) 19 2.4.3.4 Nucleic acid amplification tests (NAAT) 19 2.4.3.5 Polymerase chain reaction (PCR) 19 2.5 Phương pháp real-time PCR 20 2.6 Gene porA N gonorrhoeae gene MOMP C trachomatis 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 24 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Vật liệu 24 3.2.1 Mẫu 24 3.2.2 Dụng cụ, thiết bị 24 3.2.3 Hóa chất 24 3.2.3.1 Hóa chất dùng tách chiết DNA 24 3.2.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR 25 v   3.3 Phương pháp 25 3.3.1 Phương pháp thiết kế mồi mẫu dò 25 3.3.1.1 Nguyên tắc 25 3.3.1.2 Các phần mềm máy tính sử dụng 26 3.3.1.3 Phương pháp tiến hành 26 3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 28 3.3.2.1 Nguyên tắc 28 3.3.2.2 Cách tiến hành 28 3.3.3 Phương pháp real time PCR 29 3.3.3.1 Nguyên lý 29 3.3.3.2 Cách tiến hành 29 3.3.4 Phương pháp đánh giá khả hoạt động mồi mẫu dò 30 3.3.5 Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu mồi 30 3.3.6 Phương pháp khảo sát độ nhạy qui trình 31 3.3.7 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu qui trình 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết thiết kế khảo sát đặc tính hệ mồi mẫu dò 32 4.1.1 Kết thiết kế mồi mẫu dò 32 4.1.1.1 Kết thiết kế mồi mẫu dò cho N gonorrhoeae 32 4.1.1.2 Kết thiết kế mồi mẫu dò cho C trachomatis 32 4.1.2 Kết khảo sát đặc tính hệ mồi mẫu dò 33 4.1.2.1 Kết kiểm tra Annhyb mồi mẫu dò 33 4.1.2.2 Kết BLAST kiểm tra tính đặc hiệu mồi mẫu dò 33 4.1.2.3 Chiều dài, nhiệt độ nóng chảy (Tm) %GC 34 4.1.2.4 Cấu trúc thứ cấp 36 4.2 Kết xây dựng quy trình real-time PCR 38 vi   4.2.1 Kết thử hoạt động hệ mồi mẫu dò 38 4.2.2 Kết khảo sát nhiệt độ lai 41 4.2.3 Kết khảo sát độ nhạy quy trình 43 4.2.4 Kết khảo sát độ đặc hiệu quy trình 45 4.2.5 Ứng dụng quy trình lên mẫu bệnh phẩm 47 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC vii   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST: Basic local alignment tool CRP: cysteine-rich proteins CDC: Centers for disease control and prevention Ct: Cycle of Threshold (chu kỳ ngưỡng) DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate EB: elementary body ELISA: Enzyme link immunosorbent assay HPA: Health Protection Agency Centre for Infections IDT: Intergrated Device Technology LCR: Ligase chain reaction LOS: Lipopolysaccharide MOMP: major outer membrane protein NAAT: Nucleic acid amplification tests NAD: Nicotinamide adenine dinucleotide NCBI: National Center for Biotechnology Information OMCs: outer membrane complexes PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RB: reticulate body SDA (BD): DNA strand displacement amplification STI: sexually transmitted infections STD: Sexually Transmitted Diseases TMA: Transcription mediated amplification viii   PHỤ LỤC Phụ lục Kết so sánh ClustalX mồi xi, mồi ngược mẫu dò Kết so sánh mồi xi, mồi ngược mẫu dò N gonorrhoeae   Kết so sánh mồi xuôi C trachomatis   Kết so sánh mẫu dò C trachomatis   Kết so sánh mồi ngược C trachomatis   Phụ lục Kết kiểm tra annhyb mồi xi, mồi ngược mẫu dò Kết kiểm tra annhyb cho mồi mẫu dò N gonorrhoeae   Kết kiểm tra annhyb cho mồi mẫu dò C trachomatis   Phụ lục Kết BLAST kiểm tra độ đặc hiệu mồi xi, mồi ngược mẫu dò NCBI Kết Blast mồi xuôi F2 N gonorrhoeae     Kết Blast mồi ngược R2 N gonorrhoeae   Kết Blast mẫu dò probe2 N gonorrhoeae   Kết Blast mồi xuôi primerF-C C trachomatis   Kết Blast mồi ngược primerR-C C trachomatis   Kết Blast mẫu dò probeC C trachomatis   Phụ lục Hồ sơ bệnh lý Kết STT Tên Chlamydia   Phương pháp Ngày Loại mẫu Lậu Phùng Quốc Minh - Soi tươi 6/4/2010 Mẫu phết Võ Văn Quân - Soi tươi 6/4/2010 Mẫu phết Trần Quốc Dũng + Soi tươi 6/4/2010 Mẫu phết Nguyễn Quốc Long - Soi tươi 6/4/2010 Mẫu phết Nguyễn Văn Bảy - - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết Tiêu Ngọc Nguyên - - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết Nguyễn Đăng Khoa - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết Trần Văn An - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết Nguyễn Anh Dũng - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết 10 Nguyễn Trọng Nguyên - Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết 11 Nguyễn Anh + Soi tươi 7/4/2010 Mẫu phết 12 Trần Đảng - Soi tươi 8/4/2010 Mẫu phết 13 Phạm Văn Thuyên - Soi tươi 8/4/2010 Mẫu phết 14 Nguyễn Văn Thô + Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 15 Nguyễn Đình Chiến - - Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 16 Sean Richar - - Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 17 Nguyễn Văn Tăng - - Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 18 Trương Quốc Đạt - Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 19 Chiến Trồng Mằn + Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 20 Hoàng Quốc Thịnh - Soi tươi 9/4/2010 Mẫu phết 21 Nguyễn Đức Hoàng + Soi tươi 12/4/2010 Mẫu phết 22 Nguyễn Hùng Phong + Soi tươi 12/4/2010 Mẫu phết 23 Phạm Thanh Tùng + Soi tươi 12/4/2010 Mẫu phết 24 Phan Bá Tiến + Soi tươi 15/4/2010 Mẫu phết 25 Nguyễn Thanh Tuấn + Soi tươi 15/4/2010 Mẫu phết 26 Lê Văn Chiến + Soi tươi 16/4/2010 Mẫu phết 27 Ngô Kim Đường + Soi tươi 16/4/2010 Mẫu phết 28 Huỳnh Hữu Lâm + Soi tươi 16/4/2010 Mẫu phết   29 Phạm Văn Hùng + Soi tươi 21/4/2010 Mẫu phết 30 Trần Văn Hải + Soi tươi 16/4/2010 Mẫu phết 31 Nguyễn Văn Xuân - Soi tươi 22/4/2010 Mẫu phết 32 Lê Công Giang + PCR 26/4/2010 Mẫu phết 33 Võ Thành Ninh + PCR 21/4/2010 Mẫu phết 34 Nguyễn Huy Khiêm - PCR 13/4/2010 Mẫu phết 35 Đinh Xuân Phú - PCR 5/4/2010 Mẫu phết 36 Hồ Lê Kim Huyền + PCR 5/4/2010 Mẫu phết 37 Mai Văn Phong + PCR 31/3/2010 Mẫu phết 38 Võ Thị Hải Yến + PCR 31/3/2010 Nước tiểu 39 Hoàng Mạnh + Soi tươi 31/3/2010 Mẫu phết 40 Lê Văn Điệp - Soi tươi 31/3/2010 Mẫu phết 41 Nguyễn Đình Dũng + Soi tươi 31/3/2010 Mẫu phết 42 Bùi Văn Dương + Soi tươi 31/3/2010 Mẫu phết 43 Mai Hưng Trung + Soi tươi 5/5/2010 44 Nguyễn Văn Lê PCR 15/4/2010 Mẫu phết 45 Trần Văn Nam Soi tươi 15/4/2010 Mẫu phết (+) (+) (+) Mẫu phết Phụ lục Kết khảo sát quy trình mẫu bệnh phẩm Tín hiệu dương tính với N gonorrhoeae (gây bệnh lậu) mẫu bệnh phẩm Tín hiệu dương tính với C trachomatis (gây bệnh Chlamydia) mẫu bệnh phẩm   ... 32 4.1 Kết thi t kế khảo sát đặc tính hệ mồi mẫu dò 32 4.1.1 Kết thi t kế mồi mẫu dò 32 4.1.1.1 Kết thi t kế mồi mẫu dò cho N gonorrhoeae 32 4.1.1.2 Kết thi t kế mồi mẫu... xác hai tác nhân gây bệnh 1.3 Nội dung thực Thi t kế hệ mồi mẫu dò chuyên biệt cho gene porA vi khuẩn N gonorrhoeae gene MOMP vi khuẩn C trachomatis Thi t lập qui trình real-time PCR nhằm phát... cầu Thành tế bào vi khuẩn gram âm có chứa màng lipopolysaccharide bên ngồi lại thi u peptidoglycan thành tế bào, thi u peptidoglycan đưa đến khơng có khả phát acide muramic kháng thể trực tiếp