PHÁT HIỆN VIRÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MĨNG BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM THANH TÙNG Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS LÊ THỊ THU HÀ PHẠM THANH TÙNG KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học, trƣờng Đại học Nông Lâm chăm lo tạo điều kiện cho sinh viên đƣợc học tập nghiên cứu Tất thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm truyền dạy cho kiến thức vô quý giá lĩnh vực công nghệ sinh học Lãnh đạo Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam lãnh đạo Phòng Cơng Nghệ Sinh học cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài sở Viện Phòng ThS Lê Thị Thu Hà KS Võ Khánh Hƣng, ngƣời tận tình dạy hƣớng dẫn tơi thực đề tài Anh Nguyễn Xuân Nam, chị Nguyễn Thị Bích Hiền, ngƣời giúp đỡ tơi nhiều trình thực đề tài Cuối cha mẹ tôi, ngƣời sinh thành nuôi dƣỡng tôi, chăm lo, chia sẽ, động viên ngƣời dẫn dắt đến lĩnh vực cơng nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh, năm 2012 Phạm Thanh Tùng i TÓM TẮT Bệnh lở mồm long móng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gia súc Bệnh lây lan nhanh đòi hỏi phải có phƣơng pháp chẩn đốn nhanh chóng hiệu để phát sớm nhằm giảm thiệt hại bệnh gây Kỹ thuật RT-PCR đáp ứng yêu cầu cho phép phát nhanh chóng hiệu diện vi-rút gây bệnh Xây dựng quy trình phản ứng RT-PCR phát vi-rút gây bệnh lở mồm long móng sử dụng cặp mồi 3DF/3DR Cặp mồi 3DF/3DR đƣợc thiết kế dựa trình tự gen 3D quy định protein khơng cấu trúc vi-rút lở mồm long móng, cặp mồi khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc 204 bp Phản ứng RT-PCR với cặp mồi 3DF/3DR phát vi-rút lở mồm long móng sử dụng kit one-step RT-PCR (AccessQuick™ RT-PCR System (Promega)) với chu trình nhiệt: ủ 450C 45 phút, 920C phút, 35 chu kỳ (940C 30 giây, 520C phút, 680C phút), cuối 680C phút Phản ứng RT-PCR đƣợc tiến hàng mẫu dƣơng chủng O, A, Asia1 vi-rút lở mồm long móng 24 mẫu thực địa đƣợc thu thập tỉnh Lâm Đồng Kết mẫu dƣơng chủng O, Asia1 vi-rút lở mồm long móng cho sản phẩm PCR có kích thƣớc 204 bp Kết giải trình tự BLAST sản phẩm PCR thuộc hai chủng O, Asia1 cho thấy gen 3D vi-rút lở mồm long móng Kết PCR 24 mẫu thực địa không cho sản phẩm PCR Cần xem xét việc ứng dụng quy trình phản ứng RT-PCR phát vi-rút lở mồm long móng xây dựng vào thực địa ii SUMMARY Foot and mouth disease is a dangerous contagious disease in cattle The disease spreads rapidly so a rapid effective and diagnostic methods is required for the early detection to reduce damage caused by the disease RT-PCR technique can meet these requirements for rapid detection the virus RT-PCR reactions to detect the virus that causes foot and mouth with 3DF/3DR primers was developed The 3DF/3DR primers were designed based on the sequence encoding 3D structure a protein of the foot and mouth virus, primer pairs amplified fragments with the size of 204 bp RT-PCR reaction was performed using the kit one-step RT-PCR (RT-PCR AccessQuick ™ System (Promega)) with thermal cycles: 450C for 45 minutes incubation , 920C for min, followed by 35 cycles (940C for 30 sec, 520C for min, 680C for min), and finally extention at 680C for minutes RT-PCR reaction was carried on three positive samples of type O, A, Asia1 of foot and mouth disease virus and 24 field samples collected in Lam Dong province Result positive samples type O, Asia1 of foot and mouth virus for PCR showed bands with the size of 204 bp on agarose gel The results of the sequencing and BLAST PCR products from two strains of O, Asia1 proved that thay were 3D gene of foot and mouth disease virus Amplification of 24 field samples resulted no PCR products Amplication of RT-PCR technique to detect foot and mouth virus should be put in consideration Keyword: foot and mouth disease, RT-PCR, FMDV, 3D iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh lở mồm long móng 2.1.1 Biểu lâm sàng bệnh lở mồm long móng 2.1.2 Đƣờng xâm nhập bệnh lở mồm long móng 2.1.3 Cơ chế sinh bệnh lở mồm long móng 2.1.4 Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng giới Việt Nam 2.1.5 Một số nghiên cứu bệnh lở mồm long móng 2.2 Vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 2.2.1 Hình thái học vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 2.2.2 Phân bố chủng vi-rút lở mồm long móng 11 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng 11 2.3.1 Chẩn đốn lâm sàng 11 2.3.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 12 2.3.2.1 Chẩn đoán huyết học 12 2.3.2.1.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 12 iv 2.3.2.1.2 Phản ứng trung hòa vi-rút 13 2.3.2.1.3 Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 13 2.3.2.3 Chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR 14 2.4 Kỹ thuật RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chains reaction) 15 2.4.1 Nguyên tắc kỹ thuật RT-PCR 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm 17 3.2 Vật liệu 17 3.2.1 Bệnh phẩm 17 3.2.2 Hóa chất, vật liệu thiết bị tiến hành phản ứng RT-PCR 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phƣơng pháp thu thập, vận chuyển bảo quản bệnh phẩm 18 3.3.2 Thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR phát vi-rút lở mồm long móng 19 3.3.3 Phƣơng pháp RT-PCR để phát vi-rút lở mồm long móng 20 3.3.3.1 Ly trích RNA vi-rút từ mẫu bệnh phẩm 20 3.3.3.2 Phản ứng RT-PCRphát vi-rút mẫu bệnh phẩm 21 3.3.3.3 kiểm tra sản phẩm PCR 21 3.3.4 Giải trình tự 22 Chƣơng KẾT QUẢ THẢO LUẬN 23 4.1 Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 23 4.2 Đánh giá khả phát vi-rút lở mồm long móng kỹ thuật RT-PCR cặp primer 3DF 3DR 25 4.3 Kết giải trình tự 27 4.4 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi 3DF 3DR để phát vi-rút gây bệnh lở mồm long móng mẫu thực địa 29 v Chƣơng KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BHK-21 : Baby Hamster Kidney 21 cDNA : complementary DNA dATP : Deoxyriboadenosine triphosphate dCTP : Deoxyribocytidine triphosphate dGTP : Deoxyriboguanosine triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP : Deoxyribothymidine triphosphate dUTP : Deoxyribouridine Triphosphate ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay FAO : Food and Agriciltural Organization KHBT : Kết hợp Bổ Thể LMLM : lở mồm long móng NCBI : National Center for Biotechnology Information OIE : World Organisation for Animal Health PCR : Polymerase chain reaction RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction TBE : Tris/Borate/EDTA TCID50 : 50% Tissue Culture Infectious Dose WRL : World Reference Labolatory vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mẫu thực địa ký hiệu 18 Bảng 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 21 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 21 Bảng 4.1 Trình tự primer (3DR, 3DR) 23 Bảng 4.2 Kết PCR mẫu thực địa 31 viii gel đơng lại tháo lƣợc Đổ dung dịch chạy điện di TBE 0,5x vào khoang chạy điện di có chứa gel agarose Bƣớc 2: load mẫu leader vào giếng gel Chuẩn bị mẫu với tỉ lệ: 1µl dung dịch loading dye buffer 6X + µl sản phẩm PCR Load mẫu leader vào giếng gel Bƣớc 3: chạy điện di 180v 60 phút Bƣớc 4: đọc kết Ngâm gel dung dịch Ethidium bromide 10 – 20 phút, sau cho vào vòi nƣớc chảy qua (phải dùng găng tay, tránh tiếp xúc trực tiếp với Ethidium bromide) Quan sát kết điện di máy UVTransiluminator chụp ảnh gel máy Imaging Analyzer (chemidoc, Bio-Rad) 3.3.4 Giải trình tự Giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR mẫu dƣơng vi-rút gây bệnh LMLM Sản phẩm RT-PCR sau điện di có kết đƣợc gửi giải trình tự cơng ty Nam Khoa Từ kết giải trình tự tiến hành BLAST NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov/) so sánh tƣơng đồng với trình tự biết vi-rút thuộc chủng huyết A, O, Asia1 Từ đánh giá khả phản ứng RT-PCR cặp mồi đƣợc thiết kế 22 Chƣơng KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát vi-rút gây bệnh lở mồm long móng Sau tiến hành thiết kế mồi (mục 3.3.2) ta có trình tự mồi để phát phát vi-rút gây bệnh LMLM kỹ thuật RT-PCR (bảng 4.1) Mục tiêu đề tài thiết kế cặp primer phát chung vi-rút LMLM không phân biệt serotype Phƣơng pháp đƣợc phát triển nhƣ cơng cụ chẩn đốn sàng lọc trả lời có hay khơng vi-rút LMLM mẫu bệnh phẩm Vì vị trí cặp primer xi ngƣợc cho phản ứng RT-PCR đƣợc thiết kế nằm vùng bảo tồn vùng gene 3D vi-rút LMLM (hình 4.1 hình 4.2) nhằm đáp ứng yêu cầu bắt cặp phát đồng thời ba chủng vi-rút LMLM hành chủng O, A Asia1 Bảng 4.1 Trình tự primer (3DF 3DR) Mồi Trình tự mồi Vị trí bắt cặp 3DF 5'–GGAACYGGGTTTTAYAAACCTGTRAT–3' 7864 – 7889 3DR 5'–CCCADCGCAGGTAAAGYGATCTGTA–3' 8046 – 8070 Với: Y A T, R G hoặcC Hình 4.1 Vị trí primer 3DF đoạn gen 3D 23 Vị trí primer 3DF gen vi-rút LMLM 7864 – 7889 (vị trí đoạn gen 3D 25 – 50) Theo hình 4.1 Ta thấy trình tự primer 3DF nằm vùng bảo tồn gen 3D thuộc serotype O, A, Asia1 Do primer 3DF phát đƣợc serotype vi-rút gây bệnh LMLM chủng O, A Asia1 Nhƣ primer 3DF hoàn toàn phù hợp với yêu cầu việc thiết kế primer sử dụng cho phản ứng RT-PCR để phát vi-rút gây bệnh LMLM Hình 4.2 Vị trí primer 3DR đoạn 3D Vị trí primer 3DR gen vi-rút LMLM 8046 – 8070 (vị trí đoạn gen 3D 206 – 230) Nhìn vào hình ta thấy primer 3DR nằm vùng bảo tồn gen 3D thuộc serotype O, A, Asia1 Tuy nhiên vùng gen có số vị trí khơng tƣơng đồng serotype O, A, Asia1 đột biến chủng (hình 4.2) Do trình tự primer ngƣợc 3DR đƣợc sử dụng số nucleotide thoái hoá số vị trí nhƣ nucleotide số trình tự primer ngƣợc 3DR (bảng 4.1) ký hiệu D trình tự nucleotide số 17 trình tự primer ngƣợc 3DR (bảng 4.1) ký hiệu Y trình tự Tại vị trí nucleotide số 17 tƣơng ứng với nucleotide số 204 trình tự gen 3D có đột biến trình tự serotype O thay A T Ta sử dụng nucleotide thối hóa Y vị trí Vì vậy, Primer 3DR có khả bắt cặp phát serotype O, A, Asia vi-rút gây bệnh LMLM Primer 3DR sử dụng cho phản ứng RT-PCR để phát virút gây bệnh LMLM 24 Từ kết alignment hình 4.1 hình 4.2 cặp mồi đƣơc 3DF 3DR thiết kế hồn toàn phù hợp cho phản ứng RT-PCR để phát vi-rút gây bệnh LMLM Dựa vào vị trí mồi trình tự gen vi-rút ta dự kiến đƣợc sản phẩm RT-PCR với cặp mồi 3DF 3DR có kích thƣớc khoảng 204 bp Ta ứng dụng cặp mồi vào phản ứng RT-PCR để phát vi-rút gây bệnh LMLM mẫu thực địa Nhằm phát sớm phân biệt với vi-rút gây bệnh khác để ngăn chăn lây lan dich bệnh LMLM 4.2 Đánh giá khả phát vi-rút lở mồm long móng kỹ thuật RTPCR cặp primer 3DF 3DR Nhằm đánh giá cặp primer 3DF 3DR đƣợc kế cho phản ứng RT-PCR có hay khơng có khả bắt cặp vùng gene 3D vi-rút LMLM nhƣ có hay khơng khả phát chung vi-rút LMLM thuộc ba serotype O, Asia1 A Để trả lời câu hỏi trên, thực phản ứng RT-PCR với cặp primer đƣợc thiết kế (bảng4.1) mẫu vi-rút LMLM thuộc serotype O, Asia1, A Đại học Nông nghiệp (Hà Nội) cung cấp Phản ứng RT-PCR đƣợc thực với pirmer 3DF 3DR (bảng 4.1) với thành phần phản ứng theo (bảng 3.2) chu trình nhiệt theo (bảng 3.3) Theo hình 4.3 mẫu dƣơng serotype A không tạo sản phẩm, mẫu dƣơng chủng Asia1 tạo sản phẩm có kích thƣớc khoảng 204 bp nhƣng mờ, mẫu dƣơng chủng O tạo sản phẩm có kích thƣớc khoảng 204 bp băng tƣơng đối sáng Dựa vào kết điện di (hình 4.3), cặp mồi 3DF 3DR thực phản ứng RT-PCR với hai mẫu dƣơng chủng O, Asia1 tạo sản phẩm có kích thƣớc khoảng 204 bp Từ ta kết luận đƣợc cặp primer 3DF 3DR phát vi-rút gây bệnh LMLM thuộc chủng O, Asia1 tạo sản phẩm có kích thƣớc khoảng 204 bp nhƣ dự tính Kết hình chủng A khơng có sản phẩm lƣợng mẫu ban đầu trình tự đột biến khiến primer không thực phản ứng đƣợc 25 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR vi-rút chủng O, A, Asia1 với primer (3DF, 3DR) A: chủng A; As: chủng Asia1; O: chủng O; M: leader, (diện di gel agarose 1,5 %, 180V 60 phút) Sản phẩm RT-PCR với mẫu dƣơng chủng O, Asia từ thí nghiệm đƣợc đƣa giải trình tự Việc giải trình tự sản phẩm tạo thành sau phản ứng RT-PCR mẫu dịch vi-rút LMLM chủng O Asia1 nhằm khẳng định đoạn gen đƣợc khuếch đại primer 3DF 3DR có phải đoạn 3D gene vi-rút LMLM hay không Từ kết ta phần khẳng định tính đặc hiệu phản ứng RT-PCR với cặp primer đƣợc thiết kế Vì vậy, Sản phẩm sau RT-PCR thu đƣợc từ thí nghiệm đƣợc giải trình tự cơng ty Nam Khoa Từ kết giải trình tự tiến hành BLAST NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov) So sánh trình tự với trình tự gen biết để kiểm tra mức độ tƣơng đồng gen so với trình tự biết xác định vị trí đoạn gene đƣợc khuếch đại từ phản ứng RT-PCR với pimer đƣợc thiết kế Qua đánh giá khả phát cặp mồi đƣợc thiết kế quy trình phản ứng RT-PCR phát vi-rút gây bệnh LMLM 26 4.3 Kết giải trình tự + Trình tự sản phẩm RT-PCR mẫu chủng O vi-rút gây bệnh LMLM sau giải trinh tự: CCTCGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGA GAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCTGACGAG TACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAGGGCCTCTTTGAGATTCCAAGCTA CAGATCACTTTACCTGCGATGGGAAAT Hình 4.4a Kết BLAST trình tự mẫu chủng O Sau tiến hành BLAST NCBI ta thấy trình tự sản phẩm RT-PCR với mẫu dƣơng chủng O có mức độ tƣơng đồng cao với trình tự gen 3D virút gây bệnh LMLM NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov) Mức độ tƣơng đồng mức cao 99% so với trình tự gen vi-rút biết Đoạn gen mà cặp mồi quy trình phản ứng RT-PCR khuếch đại vi-rút LMLM thuộc chủng O Điều cho thấy phản ứng RT-PCR với cặp mồi đƣợc thiết kế phát đƣợc vi-rút gây bệnh LMLM Hình4.4b Kết blast mẫu chủng O với trình tự gen biết 27 Từ kết Blast ta thấy vị trí tƣơng đồng trình tự mẫu dƣơng chủng O so với trình tự gen 3D biết (có ID gen bank HQ632768) Trình tự tƣơng đồng có kich thƣớc 167 nucleotide từ nucleotide thứ 7897 – 8063 trình tự gen vi-rút LMLM Vị trí nằm khoảng khuếch đại cặp mồi 3DF 3DR + Trình tự gen sản phẩm RT-PCR mẫu dƣơng chủng Asia1 vi-rút gây bệnh LMLM với cặp primer 3DF 3DR TGGTACGGCTCAAAGAGACGCCGGTACTCGTCAGGTCCAGAGTG GACGGCGAGTCCTGCCACGGAGATCAACTTCTCCTGTATGGTCCCACGG CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTCGAGGGTCTTCGAAGCCATCACAGGT TTATAAAACCCGGTTCCCAA Hình 4.5a Kết BLAST trình tự mẫu dƣơng chủng Asia1 Sau tiến hành BLAST NCBI ta thấy trình tự sản phẩm RT-PCRvới mẫu dƣơng chủng Asia1 có mức độ tƣơng đồng cao với trình tự gen 3D vi-rút gây bệnh LMLM NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov) Mức độ tƣơng đồng mức cao 99% so với trình tự gen vi-rút biết Đoạn gen mà cặp mồi quy trình phản ứng RT-PCR khuếch đại vi-rút LMLM thuộc chủng Asia1 Trên hình 4.5a có trình tự thuộc chủng Asia1 có mức độ tƣơng đồng cao với trình tự gen vừa giải lại chủng khác Điều cho thấy mức độ tƣơng đồng gen 3D chủng lớn 28 Hình 4.5b Kết BLAST mẫu chủng Asia1 với trình tự gen biết Từ kết BLAST cho thấy vị trí tƣơng đồng trình tự mẫu dƣơng chủng Asia1 so với trình tự gen type Asia1 vi-rút LMLM biết Trình tự tƣơng đồng kich thƣớc 152 nucleotide từ nucleotide thứ 7456 – 7608 trình tự gen 3D vi-rút LMLM Vị trí nằm khoảng khuếch đại cặp mồi 3DF 3DR Từ kết giải trình tự BLAST NCBI kết luận đƣợc: cặp primer 3DF 3DR phát đƣợc vi-rút gây bệnh LMLM thuộc chủng khác Nhƣng cặp primer xác định đƣợc chủng giúp phát đƣợc diện vi-rút gây bệnh tạo sản phẩm RT-PCR giống chủng vi-rút Đồng thời gen 3D chủng vi-rút có mức tƣơng đồng cao 4.4 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi 3DF 3DR để phát vi-rút gây bệnh lở mồm long móng mẫu thực địa Để xem xét khả ứng dụng thực tế quy trình phát vi-rút gây bệnh LMLM mẫu thực địa Chúng tơi tiến hành thực quy trình RT-PCR phát vi-rút LMLM đƣợc nghiên cứu với 24 mẫu thực địa thu thập từ tỉnh Lâm Đồng Bao gồm mẫu huyện Đức Trọng, mẫu huyện Đam Rông, 12 mẫu TP Bảo Lộc (bảng 3.1) 29 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm RT-PCR 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF 3DR) M: leader; (+): đối chứng dương; ( – ): đối chứng âm; – 12:mẫu thực địa (Bảng 3.1), (diện di gel agarose 1,5 %, 180V 60 phút) Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm RT-PCR 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF 3DR) M: leader; (+): đối chứng dương; (–): đối chưng âm; 13 – 24: mẫu thực địa (Bảng 3.1), (diện di gel agarose 1,5 %, 180V 60 phút) Tiến hành phản ứng RT- PCR 24 mẫu thực địa đƣơc thu thập lâm đồng Mẫu đƣợc ly trích với kít EZ-10 Spin Column Total RNA MiniPreps Kit (Bio Basic) Tiến hành chạy RT-PCR sử dụng cặp primer 3DF 3DR có trình tự (Bảng 4.1) với thành phần phản ứng chu trình nhiệt (Bảng 3.2, Bảng 3.3) Ta đƣợc kết (hình 4.6) (hình 4.7) Bảng 4.2 Kết PCR mẫu thực địa 30 STT Ký hiệu Địa điểm Đối tƣợng Loại mẫu Kết ĐT Đức Trọng Heo Máu – ĐT Đức Trọng Heo Máu – ĐT Đức Trọng Heo Máu – ĐT Đức Trọng Heo Máu – ĐT 10 Đức Trọng Heo Máu – ĐR1 H2 Đam Rông Heo Máu – ĐR2 H3 Đam Rông Heo Máu – ĐR2 H4 Đam Rông Heo Máu – ĐR3 H6 Đam Rông Heo Máu – 10 ĐR3 H8 Đam Rông heo Máu – 11 ĐR5 H11 Đam Rông Heo Máu – 12 ĐR5 H13 Đam Rông heo Máu – 13 BL9 B1 Bảo Lộc Bò Máu – 14 BL10 B2 Bảo Lộc Bò Máu – 15 BL10 B4 Bảo Lộc Bò Máu – 16 BL10 B5 Bảo Lộc Bò Máu – 17 BL11 B6 Bảo Lộc Bò Máu – 18 BL11 B7 Bảo Lộc Bò Máu – 19 BL12 B9 Bảo Lộc Bò Máu – 20 BL12 B10 Bảo Lộc Bò Máu – 21 BL13 B11 Bảo Lộc Bò Máu – 22 BL13 B12 Bảo Lộc Bò Máu – 23 BL13 B13 Bảo Lộc Bò Máu – 24 BL14 B15 Bảo Lộc Bò Máu – (-) kết âm tính Trong 24 mẫu đƣợc xét nghiệm khơng có mẫu dƣơng tính với vi-rút LMLM Mẫu dƣơng kết với băng có kích thƣớc khoảng 204 bp Kết RTPCR đƣợc thể hình điện di (hình 4.6) (hình 4.7) Từ kết cho thấy mẫu thực địa khơng nhiễm vi-rút LMLM Quy trình phát vi-rút đƣợc ứng dụng thành công Tuy mẫu thực địa dƣơng tính với vi-rút nhƣng 31 quy trình phát ổn mẫu dƣơng cho kết xác Quy trình phát ứng dụng vào thực tiển để phát sớm bệnh LMLM từ có biện pháp phòng chống dịch bệnh thích hợp nhằm giảm thiệt hại cho ngƣời chăn nuôi 32 Chƣơng KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trình tự primer thiết kế quy trình phản ứng RT-PCR với cặp mồi 3DF/3DR sử dụng kit one-step RT-PCR (AccessQuick™ RT-PCR System (Promega)) phát đƣợc vi-rút gây bệnh lở mồm long móng thuộc type O, Asia khuếch đại vùng gen 3D vi-rút cho kích thƣớc 204 bp Kết giải trình tự gen từ phản ứng RT-PCR với cặp primer 3DF 3DR đƣợc thiết kế chủng O Asia1 khẳng định khả bắt cặp tính đặc hiệu phản ứng Ứng dụng quy trình phản ứng RT-PCR cặp mồi để kiểm tra 24 mẫu thực địa tỉnh Lâm Đồng Kết 24 mẫu âm tính với vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 5.2 Đề nghị Tiếp tục hồn thiện quy trình RT-PCR với cặp primer 3DF 3DR đƣợc thiết kế Xác định độ nhạy nhƣ khả phát phản ứng RT-PCR đƣợc phát triển Cần tiến hành phản ứng RT-PCR với quy trình xây dựng mẫu thu thập 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Báo cáo Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2007 – 2011) Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Quyển 1: Phân tích genome NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Bùi Quang Anh Hồng Văn Năm, 2000 Tình hình dịch bệnh LMLM Đơng Nam Á giới năm 2000 Tạp Chí Khoa Học kỹ thuật thú y, tập VIII, số năm 2001 Hội Thú y Việt Nam, 90 – 93 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997 Sinh học phân tử NXB giáo dục Hoàng Văn Năm Văn Dăng Kỳ, 2000 Tình hình dịch lở mồm long móng gia súc giới Tạp chí khoa học kỹ thuạt thú y, 18 (1): 12 – 20 Nguyễn Lân Dũng, 2000 Vi sinh vật học NXB giáo dục Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB nông nghiệp Nguyễn Nhƣ Thanh, 1974 Giáo trình thực tập vi sinh vật học thú y NXB nông nghiệp Nguyễn Tiến Dũng, 2000 Bệnh LMLM (bài tổng hợp) tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập VII, số năm 2000 Hội thú y Việt nam, – 16 10 Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1978 Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc NXB nơng nghiệp, trang 92 11 Sổ tay dịch bệnh động vật, 2002 Chƣơng “Bệnh Lở Mồm Long Móng” Phạm Gia Ninh Nguyễn Đức Tâm dịch NXB Bản Đồ, 198 – 200 12 Thái Thị Thủy Phƣợng, 2008 Khảo sát số đặc điểm dịch tể học biện pháp chống chế bệnh LMLM gia súc tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu, Cần Thơ, Đồng Tháp, Tiền Giang Luận án tiến sỹ Nông Nghiệp Trƣờng đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 13 Tơ Long Thành, Trƣơng Văn Dung, Lê Văn Phan, Đinh Duy Kháng Và Dƣơng Hồng Quân, 2004 Thiết lập phƣơng pháp RT-PCRđể chẩn đoán, định chủng vi-rút LMLM từ bệnh phẩm thực địa Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y, tập XI, số 3/2004 tr:15 – 21 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 34 14 Carrillo, C., Tulman, E.R., Delhon, G., Lu, Z., Carreno, A., Vagnozzi, A., Kutish, G.F., Rock, D.L., 2005 Comparative genomics of foot- and-mouth disease virus J Virol 79, 6487–6504 15 Clavijo, A., Viera-Pereira, p.j., Bergmann, I.,2004 Use of the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for the rapid diagnosis of foot and mouth disease in South America Vet Res Commun 27, 63 – 71 16 Ferris, N.P., Dawson, M., 1988 Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot-and-mouth and swine vesicular diseases Vet Microbiol 16, 201–209 17 Garland A.J.M & Donaldson A.I, 1990 Food and mouth disease surveillance 17 (4), – 18 Grubman, M.J , Baxt B Clin, 2004 Microbiol Rev 17, 465 – 493 19 Hoang, V.N., 2009 In: 15th Meeting of the OIE Sub-Commission for foot and mouth desease in South-East Asia, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia, – 13 Marth 20 Hoffmann, B., Beer, M., Reid, S.M., Mertens, P., Oura, C.A., van Rijn, P.A., Slomka, M.J., Banks, J., Brown, I.H., Alexander, D.J., King, D.P., 2009 A review of RT-PCRtechnologies used in veterinary virology and disease control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health Vet Microbiol 139, 1–23 21 Kitching, R.P., 2005 Global epidemiology and prospects for control of footand-mouth disease Curr Top Microbiol Immunol 288, 133–148 22 Knowles, N.J., A.R., Sanuel, 2003 Molecular epidemiology of foot-andmouth disease virus Virus res 91, 65 – 80 23 Knowles, N.J., Samuel, A.R., Davies, P.R., Midgley, R.J., Valarcher, J.F., 2005 Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O Emerg Infect Dis 11, 1887–1893 24 Le, V P., ctv., A rapid molecular strategy for early detection and characteriation of vietnamese foot-and-mouth disease virus serotype O, A, and Asia1 J Virol Methods (2011) 25 OIE/FAO International Scientific Conference on Avian Influenza OIE Paris, France, 7–8 April 2005 35 26 Valarcher, J.F., Knowles, N.J., Zakharov, V., Scherbakov, A., Zhang, Z., Shang, Y.J., Liu, Z.X., Liu, X.T., Sanyal, A., Hemadri, D., Tosh, C., Rasool, T.J., Pattnaik, B., Schumann, K.R., Beckham, T.R., Linchongsubongkoch, W., Ferris, N.P., Roeder, P.L., Paton, D.J., 2009 Multiple origins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1 outbreaks, 2003–2007 Emerg Infect Dis 15, 1046–1051 TÀI LIỆU INTERNET 39 http://www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=265&detail=16&ucat=42 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ 41 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 42 http://www.promega.com/ 43.http://store.biobasic.com/ 36 ... LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS LÊ THỊ THU HÀ PHẠM THANH TÙNG KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô môn... chia sẽ, động viên ngƣời dẫn dắt đến lĩnh vực công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh, năm 2012 Phạm Thanh Tùng i TĨM TẮT Bệnh lở mồm long móng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gia súc Bệnh lây lan nhanh