Giám sát huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ gây bệnh lở mồm long móng trên địa bàn huyện quảng ninh, tỉnh quảng bình

Chương trình quốc gia của nước ta hiện nay chỉ sử dụng vaccine type O.Trong khi diễn biến dịch bệnh LMLM ở nước ta hiện nay đang diễn biến phứctạp, đặc biệt trong vùng Bắc Trung bộ có sự

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nằm ở vùng nhiệt đới có độ ẩm cao rất phù hợp với

sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật và chính vì thế con người và động vật dễdàng bị mắc các bệnh truyền nhiễm Hằng năm, các bệnh truyền nhiễm ở vậtnuôi, đặc biệt là bệnh lở mồm long móng, bệnh tụ huyết trùng, bệnh Newcastle

và bệnh do Salmonella gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi nước ta.

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lâylan mạnh, nhanh và rộng của các loài động vật móng guốc chẻ đôi (trâu, bò, lợn,

dê, cừu) Bệnh LMLM gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng ảnh hưởng trực tiếpđến các hoạt động thương mại, đặc biệt là việc buôn bán gia súc và sản phẩmđộng vật; bệnh được Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) xếp đầu danh mục bảng Acác bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc [1], [6]

Bệnh LMLM gây ra bởi loài virus thuộc họ Picornaviridae, giống Aphthovirus Virus có 7 chủng là chủng A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia1

nhưng có chủng phụ được phân biệt bằng miễn dịch học và huyết thanh học,chúng có độc lực khác nhau [5], [7] Thời gian gần đây, có nhiều bằng chứngcho thấy rằng có thể trong nguồn virus LMLM gây bệnh ở Việt Nam đã xuấthiện các chủng/serotype/ topotype mới làm phức tạp hóa chương trình khốngchế bằng vaccine và khoanh vùng dịch tễ học, cần chẩn đoán, xét nghiệm kịpthời để khống chế [9]

Quảng Ninh là một huyện của tỉnh Quảng Bình, phía Nam giáp huyện LệThủy, phía Bắc giáp thành phố Đồng Hới, phía Đông giáp biển Đông, phía Tây

là dãy Trường Sơn, giáp biên giới Lào Sông ngòi chính chảy qua huyện này chủyếu là sông Long Đại, một chi lưu của sông Nhật Lệ Huyện Quảng Ninh cótuyến quốc lộ 1A chạy qua, đường Hồ Chí Minh, đường sắt Bắc-Nam chạy quakhu vực trung du của huyện Trung tâm huyện nằm cách 12 km về phía namcủa sân bay Đồng Hới Địa hình Quảng Ninh hẹp và dốc từ phía Tây sang phíaĐông, 85% tổng diện tích tự nhiên là đồi núi Toàn bộ diện tích được chia thànhvùng sinh thái cơ bản: Vùng đồi núi, vùng bán sơn địa, vùng đồng bằng và venbiển, tập quán chăn nuôi trâu bò của người dân vùng núi chủ yếu chăn thả tự dotrong rừng, rất khó kiểm soát và triển khai biện pháp tiêm phòng Mặt khác, do thờitiết khắc nghiệt, đặc biệt là lũ lụt, mạng lưới giao thông giao lưu hàng hoá Bắc-Nam, vận tải xuất, nhập khẩu, quá cảnh và luân chuyển hàng hoá nội tỉnh thuận lợi

nên việc buôn bán vận chuyển gia súc rất phát triển Đây cũng là điều kiện phátsinh và lây lan mạnh dịch bệnh cho gia súc, nhất là dịch bệnh lở mồm longmóng [49].

Trong những năm gần đây, bệnh LMLM thường xuyên xảy ra trên địa bàncác tỉnh Bắc Trung bộ Sáu tháng đầu năm 2014 trong vùng Bắc Trung bộ bệnhLMLM đã xảy ra tại 15 xã, 10 huyện, 03 tỉnh: Hà Tĩnh, Quảng Trị và Nghệ Anlàm mắc bệnh 219 con (63 con trâu, 138 con bò), chết và tiêu huỷ 03 con QuảngBình là một tỉnh tiếp giáp, nguy cơ nhiễm dịch bệnh LMLM là rất cao, songchưa có báo cáo về dịch bệnh Đáng lưu ý, theo điều tra cuối tháng 6/2014 dịchLMLM bắt đầu xuất hiện tại tại một số thôn thuộc xã Vạn Ninh, huyện QuảngNinh, Quảng Bình gây bệnh cho đàn trâu bò của địa phương này, có nguy cơ lâylan trên diện rộng [4]

Chương trình quốc gia của nước ta hiện nay chỉ sử dụng vaccine type O.Trong khi diễn biến dịch bệnh LMLM ở nước ta hiện nay đang diễn biến phứctạp, đặc biệt trong vùng Bắc Trung bộ có sự lưu hành cả 2 type O và A sẽ là vấn

đề khó khăn cho chiến lược Quốc gia và các tỉnh trong vùng về phòng chốngbệnh lở mồm long móng, nhiều khi ổ dịch đã tiêm phòng vẫn tái mắc làm chongười dân không tin tưởng vào việc tiêm phòng [5]

Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Giám sát huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ gây bệnh lở mồm long móng trên địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình”.

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Cung cấp thông tin và số liệu cụ thể, cùng những luận chứng khoa học

về sự lưu hành của virus LMLM ở trâu, bò trên địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnhQuảng Bình

- Kết quả nghiên cứu của đề tài đánh giá đúng tình hình dịch bệnh, mức

độ lưu hành virus LMLM trên địa bàn nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhà chănnuôi, cơ quan quản lý nhà nước về thú y đưa ra giải pháp, xây dựng kế hoạch

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quát về bệnh LMLM

2.1.1 Giới thiệu chung về bệnh LMLM

Bệnh lở mồm long móng có nhiều tên gọi khác nhau:

- Foot and mouth disease (tiếng Anh)

- Aphtae Epizooticae (tiếng La tinh)

- Feivre Aphteuse (tiếng Pháp)

- Feivre Aftosa (tiếng Tây Ban Nha)

Bệnh lở mồm long móng là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vậtmóng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, hươi, nai…[1], [6], [7] Sự nguy hiểmcủa bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh Sự lây lan không chỉ do tiếpxúc giữa động vật khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều con đường kể

cả qua không khí Vì vậy, bệnh thường phát thành đại dịch gây thiệt hại về chănnuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thếgiới Do bệnh không lây lan sang người nên đôi khi công tác phòng chống dịchbệnh không nhận được sự hưởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng

Bệnh thường gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản như

bò sữa, bò thịt, lợn hướng nạc Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảmsản lượng sữa và là động vật mang trùng, vì vậy các nước có nền chăn nuôi,kinh tế phát triển rất quan tâm Mặc dù xuất hiện như một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ

tử vong thấp ngoại trừ những con vật non, từ 2-5% đối với gia súc trưởng thành

và 20-50% ở đàn gia súc như bê, nghé, lợn con Ở gia súc sinh sản, bệnh LMLMlàm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, sản lượng sữa giảm 50% do viêm vú

và lượng sữa thu được phải trải qua nhiều khâu khử trùng phức tạp mới sử dụngđược Điều này cho thấy sự thiệt hại rất trầm trọng về kinh tế do bệnh LMLMgây ra [46]

Bệnh LMLM được đặt ở vị trí số 2 bảng A trong danh mục các bệnhtruyền nhiễm ở gia súc vì khi dịch bệnh xảy ra gây hậu quả nghiêm trọng chonền kinh tế, xã hội cũng như các vấn đề về môi trường ở khu vực có dịch

2.1.2 Lịch sử bệnh LMLM

Lần đầu tiên trên thế giới bệnh LMLM được Fracstorius phát hiện và mô

tả ở Italia vào năm 1514, sau đó bệnh lan sang nhiều nước ở châu Âu VirusLMLM được hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu đầu tiênvào năm 1897 [39] Cho đến năm 1922, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Caréelần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò đượcgọi là type O (phân lập được tại vùng Oisée – Pháp) và type A (phân lập đượctại vùng Ardène – Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức Năm 1926, hai nhà khoahọc Đức là Waldmann và Trautwein đã phân lập được 3 type virus LMLM vàđặt tên là A, B, C [2] Nhưng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B

có đặc tính giống với 2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập đượctrước đó Cho đến năm 1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọicác type là O, A, C [16] Những type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern AfricanTeritoties) tìm thấy ở Nam Phi và được giám định tại viện nghiên cứu Pirbright(Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và Bắc Rhodesia Các type này chủyếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông Phi, Saudan, Ai cập…) phổbiến nhất là các type SAT1 Cuối cùng, type Asia 1 do Brooksby và Rogere(1957) tìm thấy ở Pakistan, đây là type hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á(cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…) [2]

2.2 Tình hình dịch bệnh LMLM trong nước và trên thế giới

2.2.1 Tình hình dịch bệnh LMLM ở trên thế giới

Bệnh LMLM đã xuất hiện ở nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Phi, Mỹ Latinh và Châu Âu Điển hình là trong những năm 1981-1985, dịch xuất hiện ở 80nước, gây nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của những nước này [45] Năm 1997,dịch xảy ra ở lợn trên toàn lãnh thổ Đài Loan, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và

để lại hậu quả xấu cho ngành chăn nuôi lợn trong nhiều năm Các nước NhậtBản và Hàn Quốc là những nước từ lâu không có bệnh LMLM nhưng đến năm

2000 đã xuất hiện bệnh này [12] Tại Châu Âu năm 2001, dịch đầu tiên xảy ra ởAnh, sau đó lan sang Pháp, Hà Lan, Ireland qua con đường vận chuyển gia súc

Từ khi ngừng việc sử dụng vaccine ở các nước thuộc Liên minh Châu Âu (EU)

1991, đã có những ổ dịch nhỏ xảy ra ở Italia 1993; Hy Lạp 1994-1996; Nga

1995 Tính đến tháng 4 năm 2000 ở Nga đã phát hiện một ổ dịch tại một làng ởViễn Đông, 625 trong số 965 con lợn của đàn bị mắc bệnh, 111 con bị chết dovirus LMLM type O gây ra Nga tiếp tục dùng vaccine xung quanh Moscow vì ởđây có sân bay quốc tế và gần các nhà máy sản xuất vaccine Việc tiêm phòng

dịch bệnh LMLM Các ổ dịch nổ ra lặp đi lặp lại, một số đó được khẳng định vàmột số vẫn chưa có bằng chứng xác đáng Nguyên nhân chính của việc tái phátcác vụ dịch được cho là do sự di chuyển bất hợp pháp gia súc sống từ vùngAnatolia của Thổ Nhĩ Kỳ vào phần lãnh thổ của Thổ Nhĩ Kỳ ở Châu Âu [2], [17].

Trong thập kỷ 90 và trong khoảng 8 năm trở lại đây tại Nam Mỹ, Chile,Guyana, Suriname không thấy bệnh LMLM cho thấy đã có những tiến bộ đáng

kể về hiệu quả của các chương trình khống chế bệnh LMLM Mặc dù các bằngchứng đưa ra kém thuyết phục hơn nhưng một số nước khác như Argentina,Paraguay, Uruguay, Bolivia, Colombia, Brazil… cũng rất cố gắng trong việcphòng chống bệnh LMLM với kết quả làm giảm thiểu số lượng ổ dịch đượccông bố [47]

Tại Châu Á, virus LMLM thuộc type O và A có mặt ở hầu hết các nướcvùng Trung Đông, cùng với sự thâm nhập của type Asia 1 vào Saudi Arabia Ở

Ấn Độ số lượng đầu gia súc là rất lớn, ước tính 164 triệu cừu, dê; 200 triệu bò;

80 triệu trâu… việc khống chế bệnh LMLM là rất khó Virus type O, A, C, Asia

1 lưu hành khắp nơi và những cố gắng của người chăn nuôi bò sữa tìm cáchkhống chế bệnh một cách riêng rẽ đều không đem lại kết quả Hơn nữa các nướcláng giềng như Pakistan, Bhutan, Nepal, Bangladesh đã làm lây nhiễm nhiềuchủng loại virus LMLM của họ cho Ấn Độ [40]

Trung Quốc và Việt Nam là hai nước láng giềng, có chung đường biêngiới rất dài, là nước thường xuyên có bệnh LMLM, việc buôn bán trao đổihàng hóa giữa Việt Nam và Trung Quốc, nhất là việc buôn bán vận chuyểntrái phép động vật và sản phẩm động vật là nguyên nhân lây lan dịch bệnhgiữa hai nước [50]

Ở khu vực Đông Nam Á, một số nước có dịch như Lào, Campuchia, TháiLan, Myanmar, Philippines, Malaysia và Viêt Nam đã chịu những thiệt hại rấtlớn do dịch gây ra Ở Thái Lan, khi bị dịch này, chính phủ đã chi mỗi năm hàngtriệu USD để khống chế dịch Ngoài ra, Liên Hợp Quốc còn hỗ trợ thêm 36 triệuUSD để thành lập Trung tâm chẩn đoán LMLM để định chủng virus, nghiên cứudịch tễ và sản xuất vaccine Thái Lan đã có 7/9 vùng kinh tế đã sạch bệnh và ở 7vùng này vẫn xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và nông sản đi nhiều nướcvới số lượng lớn Indonesia đã thanh toán được bệnh này từ năm 1983,Phillippines đã được Tổ chức Thú ý Thế giới OIE công nhận an toàn ở vùngMindanao, Visay và Luzon [41]

Theo báo cáo tình hình dịch bệnh LMLM hàng tháng trên thế giới của tổchức FAO vào tháng 6 năm 2013, từ năm 2010 đến 2013 sự lưu hành của virusLMLM được chia làm 7 vùng (pool) tùy thuộc vào đặc điểm của virus Cácnước thuộc vùng Đông Nam Á và Trung Quốc thuộc vùng 1 (pool 1) VirusLMLM có 07 serotype : O, A, Asia 1, SAT 1, SAT 2, SAT3 và C, từ 2004không phát hiện được serotype C Virus LMLM lưu hành tại vùng 1 và vùng 2

là O, A và Asia 1, nhưng đặc điểm của các virus này là khác nhau giữa hai vùng[48]

Virus LMLM type A/ASIA Sea - 97 đã lưu hành trong khu vực giữaĐông Á vào năm 2012 - 2013 Phân tích di truyền của loại virus LMLM type A(A GDMM -CHA - 2013- S ( LVRI )) thu thập vào tháng 3 năm 2013 từ gia súc

và lợn ở Bắc Trung Quốc (Quận Chengbey, Tây Ninh, Thanh Hải ) và kiểu gencủa một virus phân lập ở Nga (A/Zabaikalsky/RUS/2013) được lấy mẫu vàotháng ba năm 2013 từ gia súc vùng Molodezhny, huyện Priargunsky,Zabaikalsky kray, Đông - Nam Liên bang Nga (gần biên giới Trung Quốc) chothấy có mối quan hệ di truyền gần gũi (đặc tính di truyền của cả hai chủng có tỷ

lệ tương đồng 99,06 % trong vùng mã hóa VP1) [48] Sự lưu hành virus LMLMthành các vùng theo đặc điểm của virus trên thế giới từ 2010-2013 được trìnhbày trong bản đồ hình 2.1

Hình 2.1 Sự lưu hành virus LMLM thành các vùng theo đặc điểm của virus

trên thế giới từ 2010-2013 [48]

Nhiều nước trên thế giới đã thanh toán được bệnh dịch LMLM nhưAustralia, New Zealand, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nướcthuộc EU, các nước thuộc vùng Bắc Trung Mỹ Các nước trên đều phải thựchiện một chương trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biệnpháp khác theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới [41]

Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đã tồn tại và phát triển trên địa bàn

107 trong tổng số 229 huyện thuộc 26 tỉnh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm chohàng chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh

Từ đầu năm 2009-2010 dịch đã xảy ra ở 221 xã thuộc 84 huyện của 26tỉnh, thành phố với tổng số 7519 gia súc mắc bệnh, 416 con phải tiêu hủy Trong

số gia súc mắc bệnh gồm: Trâu 2993 con, bò 4085 con và lợn 494 con DịchLMLM xảy ra trên địa bàn các tỉnh Bắc Trung bộ (Nghệ An, Hà Tĩnh, ThừaThiên Huế, Quảng Trị), Duyên hải miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam,Quảng Ngãi, Phú Yên, Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông); các tỉnh miền núi phíaBắc (Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Hà Giang, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Sơn

La, Lạng Sơn) Dịch xảy ra trên quy mô rộng vào tháng 9/2009, cao điểm nhất

có 90 ổ dịch xuất hiện trong tháng, sau đó ổ dịch đã giảm trong các tháng tiếptheo [15]

Dịch LMLM đã xảy ra trên diện rộng tại một số tỉnh: Đăk Lăk (15 xã của

9 huyện/thị với 583 con bò, 24 con trâu mắc bệnh), Kon Tum (35 xã của 7huyện/thị với 701 con trâu, 747 con bò, 66 con lợn mắc bệnh), Nghệ An (21 xãcủa 7 huyện/thị với 314 con trâu, 285 con bò, 121 con lợn mắc bệnh), Hà Giang(23 xã của 5 huyện/thị với 51 con trâu và 318 con bò mắc bệnh), Quảng Ninh(11 xã của 4 huyện với 201 con trâu mắc bệnh), Quảng Ngãi (10 xã của 4 huyện/thị với 249 con bò mắc bệnh) Đáng lưu ý là dịch LMLM đã tái phát và dây dưakéo dài tại một số tỉnh: Kon Tum, Gia Lai, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tuyên Quang,Phú Thọ, Sơn La, Quảng Ninh, Quảng Nam [15]

Kon Tum: Diễn ra từ ngày 9/1/2009 kéo dài đến tháng 3/2009 Trong đợtnày số xã có dịch là 34 xã thuộc 6 huyện với tổng số gia súc mắc bệnh là 1140

gia súc (401 con trâu, 673 con bò và 66 con lợn) Số gia súc chết và tiêu hủy là

185 con (12 con trâu, 72 con bò và 66 con lợn)

Gia Lai: Từ 27/4/2009 đến cuối tháng 5/2009, trong đợt dịch này có 1 xãthuộc 1 huyện có dịch với 70 gia súc mắc bệnh Từ 27/9/2009 đến cuối tháng10/2009 có 3 xã thuộc 2 huyện có dịch với tổng gia súc mắc bệnh là 5 con trâu,

118 con bò

Hà Tĩnh: Ngày 24/9/2009 dịch đã xảy ra ở 1 xã thuộc 1 huyện có dịch với

số gia súc mắc bệnh là 9 con trâu, bò Ngày 5/8/2009 đến đầu 2010, dịch đã xảy

ra tại 5 huyện với 17 xã có dịch với tổng số gia súc mắc bệnh là 309 con (99 contrâu, 162 con bò và 48 con lợn)

Nghệ An: Từ đầu năm 2009- 2010, có 16 xã thuộc 5 huyện có dịch vớitổng số 298 con trâu, 281 con bò va 121 con lợn [15]

Hiện nay, Virus LMLM type O hiện lưu hành tại các tỉnh: Bắc Kạn , BắcNinh, Cà Mau, Cao Bằng, Đăk Lăk, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Long An,Nghệ An, Phú Yên, Quảng Nam, Quảng Trị, Sơn La, Tiền Giang, Thanh Hóa vàVĩnh Long Virus LMLM type A hiện lưu hành chủ yếu tại các tỉnh: Hà Tĩnh(mẫu được lấy tại thị xã Hồng Lĩnh và huyện Can Lộc), Thanh Hóa (huyệnQuảng Xương), Quảng Nam (huyện Tây Giang) và Quảng Trị (huyện TriệuPhong) [51]

Thời gian gần đây, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng có thể trong nguồnvirus LMLM gây bệnh ở Việt Nam đã xuất hiện các chủng/serotype/ topotypemới làm phức tạp hóa chương trình khống chế bằng vaccine và khoanh vùngdịch tễ học

2.3 Đặc điểm sinh học của virus LMLM

2.3.1 Đặc điểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Picornaviridae

Đây là virus nhỏ không có áo ngoài, đối xứng khối 20 mặt đều, đườngkính 22 - 30 nm Capsid có mặt ngoài nhẵn, tròn, lõi gồm RNA một sợi dương,duỗi thẳng, dài 7,5 - 8,5 kb, và protein VPg liên kết với RNA

Genome cấu tạo từ 1 phân tử RNA một sợi dương trực tỏa, phân tử lượng2,4 - 2,7 x 106 (khoảng 7,5 - 8,5 kb), có chuỗi poly-A ở đầu 3', còn đầu 5' kếthợp cộng hóa trị với phân tử protein VPg có phân tử lượng khoảng 2.400 Da.RNA virus có tính cảm nhiễm

Capsid các Picornavirus cấu thành từ 60 tiểu đơn vị protein (protomer) có

protein cấu trúc này có được nhờ phân cắt một protein khổng lồ duy nhất.Protomer (tiểu đơn vị protein) có phân tử lượng từ 80 đến 97 kDa, nhưng cũng

có loại virus có sự phân cắt không hoàn toàn [10]

2.3.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của virus LMLM

Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae, nhóm Aphthovirus, có kích thước 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt

virus chứa 30% acid nucleic, là một đoạn RNA Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi làcapsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1

có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyênchính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM [19] Vì thế, người ta đãtiến hành giải trình tự 1 phần hoặc toàn bộ gen mã hoá VP1 để phân chia chúngthành các serotype và các subtype [37] Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhântạo ra các biến type, đặc biệt thông qua sự đa dạng của phân tử VP1 Hình thái

và cấu trúc của virus LMLM được trình bày ở hình 2.2

A Virus LMLM dưới kính

hiển vi điện tử

B Mô hình cấu trúccủa hạt virion LMLM C Cấu tạo khángnguyên

D Hạt virion của virus LMLM

F Sơ đồ cấu trúc gen của virus LMLM

Hình 2.2 Hình thái và cấu trúc của virus LMLM

Hằng số lắng (S) của hạt virus như sau: Hạt virus hoàn chỉnh (virion) cóhằng số lắng 140S; phần vỏ capsid không có RNA là 75S; mảnh protein củacapsid bao quanh RNA (dài 8 kilobases) là 12S khi bị tác động bởi nhiệt độ, môitrường acid hoặc nồng độ ion thấp

Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của chúngđược cấu tạo bởi một màng lipid [43] Do vậy chúng có sức đề kháng cao đốivới các loại dung môi hữu cơ (như cồn, ete…) Tuy nhiên, virus LMLM lại rấtmẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol…

2.3.3 Phân loại virus LMLM

Bệnh gây ra bởi chủng virus thuộc họ Picornaviridae, nhóm Aphthovirus.

Virus có 2 đặc tính quan trọng là tính đa type và tính dễ biến đổi kháng nguyên.Virus LMLM có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1, các typekhác nhau có độc lực khác nhau [2], [7] Những virus này thường biến hóakhông ngừng thành những chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên,tồn tại bền vững, đã có hơn 70 phân type được xác định , vì vậy phải thườngxuyên chẩn đoán định chủng virus chính xác qua xét nghiệm tại phòng thínghiệm thì mới chọn được loại vaccine thích hợp để phòng cho từng vùng vàtừng thời kỳ Các type virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giốngnhau, nhưng không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau Đây chính là một khókhăn về kỹ thuật và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòngbệnh thích hợp cho từng khu vực dịch

Phương pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên Cho đếnnay chưa phát hiện thêm type nào mới nhưng các chủng virus LMLM do cógenome là RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới Trước đâycác subtype thường được ký hiệu bằng số mũ như O1, A32…thì nay người tathống nhất ký hiệu là O1, A32…[8]

2.3.4 Đặc tính kháng nguyên của virus LMLM

Virus có cấu trúc kháng nguyên một sợi, không có tính sinh kháng thể vàđặc tính kháng nguyên nhưng có vai trò trong gây nhiễm Những protein tạo nêncapside có tính chất kháng nguyên và tạo nên kháng thể, gồm 4 loại: VP1, VP2,VP3, VP4 VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân

tử 12S) còn VP4 là protein bên trong capside VP1 ở ngoài cùng tham gia trongviệc cố định virus trên những tế bào và tạo nên một trong những yếu tố cấu trúcsinh miễn dịch cơ bản VP1 đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh và làkháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM [19]

Các type và subtype có kháng nguyên bề mặt khác nhau và chúng không

có miễn dịch chéo Mặt khác, bản chất virus là ARN, với áp lực của hệ thốngmiễn dịch, virus có thể biến đổi về vật chất di truyền lẫn kháng nguyên bề mặtlàm xuất hiện chủng mới [1]

Đối với virus LMLM, mọi chủng virus đều được coi là cường độc, không

có chủng nhược độc Về mặt lâm sàng, động vật nhiễm virus có thể biểu hiệntriệu chứng lâm sàng dưới nhiều mức độ khác nhau, từ nặng đến nhẹ hay thậmchí là ở thể ẩn Ngay trong cùng một ổ dịch (do cùng một loại virus gây ra), ta

có thể thấy nhiều dạng bệnh khác nhau [19]

Ở virus LMLM, tính kháng nguyên và độc lực là hai phạm trù hoàn toànđộc lập với nhau Đối vói một số virus khác, khi bị nhược độc thì tính khángnguyên có khả năng giảm đi hoặc khả năng gây bệnh cho một loài động vật này

có thể gắn liền với một tính kháng nguyên riêng biệt nào đó Virus LMLMkhông có các đặc điểm trên Do vậy, ta có thể thấy các hiện tượng sau: mộtchủng virus có cùng một tính kháng nguyên lần này hoặc nơi này thì chỉ gâybệnh cho lợn nhưng lần khác hoặc nơi khác thì lại chỉ gây bệnh cho bò hay cho

cả hai loài

2.3.6 Nuôi cấy và lưu giữ virus LMLM

Virus LMLM là virus có tính hướng thượng bì, nên nhiều tác giả đã nuôicấy chúng trên da của thai lợn, thai bò còn sống (giữ thai sống bằng phươngpháp nhân tạo)

Nếu nuôi cấy virus trên động vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang,chuột nhắt trưởng thành thì virus hay bị biến đổi và thường mất đặc tínhgây bệnh [17].

Nuôi cấy trên màng niệu của nang trứng thì kết quả không chắc chắn, cókhi được có khi không

Tổ chức để nuôi cấy thích hợp nhất cho virus LMLM là thượng bì lưỡi bòtrưởng thành, lưỡi phải lấy ngay khi mổ bò, giữ lạnh ở 2-3ºC và chỉ sử dụngđược trong vòng 8 ngày Phương pháp này cho kết quả tốt và ưu điểm là độc lựccủa virus sau nhiều lần tiếp đời vẫn cao đối với bò và động vật thí nghiệm Do

đó, người ta thường dùng phương pháp này để chế vaccine vô hoạt

Ngoài ra, có thể nuôi cấy virus LMLM trên môi trường tế bào Tốt nhất là

tế bào lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, thận bê hoặc cừu non hoặc các dòng

tế bào mẫn cảm như tế bào BHK (Baby Hamster Kidney) Sau khi cấy virus vàocác môi trường tế bào này, để tủ ấm 37ºC trong 24-72 giờ, virus sẽ làm huỷ hoại

tế bào nuôi [27]

2.3.7 Sức đề kháng của virus LMLM

Virus LMLM là loại không có vỏ bọc, do vậy chúng có sức đề kháng caođối với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…) Điều này có ý nghĩa thực tiễn làkhông nên dùng cồn để sát khuẩn vì virus LMLM không bị cồn phá hủy Virusbền vững trong khoảng 7- 7.7, nhanh chóng bị vô hoạt ở nhiệt độ cao hoặc thấp(pH<2 hoặc pH>11) Virus mất hoàn toàn khả năng phơi nhiễm ở pH<6 [19]

Virus tồn tại dai dẳng qua các năm ở vùng nhiễm bệnh (chuồng trại, bãichăn,…), 10-12 tuần trên các quần áo, thức ăn, 1 tháng trên lông

Virus kém chịu nhiệt Nhiệt độ từ 30-37 ºC virus sống 4-9 ngày, ở 70ºC thì virus chết sau 5-10 phút, đun sôi 100 ºC virus chết ngay Trong mặt đất

60-ẩm, virus có thể duy trì độc lực 42 ngày về mùa hè, 146-163 ngày về mùa đông.Trong tủy xương, nước bọt virus có thể sống 40 ngày Virus có thể tồn tại lâutrong da muối và thịt đông lạnh [6]

Tuy nhiên, virus LMLM bị phá hủy nhanh bởi ánh sáng mặt trời, acid,NaOH, formol, glutaraldehyde, gốc phenol… nên có thể dùng các loại acid nhẹnhư dấm ăn, phèn chua, chanh, khế, acid lactic… để diệt virus LMLM ở các vếtthương trên cơ thể của động vật bệnh và sử dụng thuốc sát trùng dạng NaOH,formol, glutaraldehyde, gốc phenol… để tiêu độc khử trùng môi trường và vậtdụng chăn nuôi Trong thực tiễn, người ta dùng NaOH 0,5% để sát trùng thân

2.4 Dịch tễ học bệnh LMLM

2.4.1 Động vật cảm nhiễm

Virus LMLM gây bệnh tự nhiên ở các loài động vật có móng guốc chẵn(trâu, bò, heo, dê, cừu,…) Người và động vật ăn thịt cũng có thể mắc bệnhLMLM Tuy nhiên, bệnh LMLM ở người không có ý nghĩa về mặt lâm sàng vàbệnh lý

Động vật ở các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh, nhưng gia súc non thườngmắc bệnh nặng hơn gia súc trưởng thành [27]

Mức độ mẫn cảm giữa các loài không giống nhau Các loài động vậtmóng guốc có độ mẫn cảm ngang nhau nhưng mức độ phát bệnh lâm sàng khácnhau Trâu bò mắc bệnh nhiều nhất, bệnh thường biểu hiện rõ và nặng hơn, sau

đó đến lợn và sau cùng là dê cừu Chó mèo rất ít khi nhiễm bệnh, ngựa và giacầm, chim không mắc bệnh nhưng người ta có thể gây bệnh cho vịt, voi, lạc đà

và nhiều loại sơn dương cũng mắc bệnh Trong phòng thí nghiệm, chuột lang,chuột bạch, chuột đồng, chuột Hamster dễ cảm nhiễm Khía da bàn chân củachuột lang rồi chà xát bệnh phẩm có virus lên thì sau 12-24 giờ quan sát thấy cónổi mụn nhỏ, màu đỏ, có thủy thũng, đau chỗ khía, sau 48-72 giờ thấy nổi mụnnước đặc trưng, nhiễm trùng toàn thân, xuất hiện nhiều mụn ở miệng, lưỡi, lợi

và có tình trạng thần kinh với triệu chứng tê liệt, co giật [19], [23]

2.4.2 Chất chứa virus

Ở cơ thể động vật bị bệnh, virus LMLM có nhiều ở trong các bệnh tíchđặc hiệu, các mụn nước, các dịch mụn nước và màng bọc mụn Virus chứa nhiềunhất trong mụn sơ phát nhưng sẽ không còn độc lực vào ngày thứ 4 sau khi vỡ

ra Virus được thải ra ngoài qua nước miếng lẫn dịch mụn và mảnh ngoại bị củamụn bị vỡ ra trên niêm mạc lưỡi và miệng Mụn nước ở chân, đầu vú và các nơikhác như sữa, nước tiểu, nước mắt, nước mũi…thì chứa ít virus hơn và có thểkéo dài 11-13 ngày

Ở lợn, virus tồn tại rất nhiều ở hầu và họng Chính vì vậy mà nguy cơvirus thải ra đường hô hấp là rất cao [35]

Tường, nền, máng ăn, độn lót chuồng, rơm cỏ, các đồ vật dụng cụ chănnuôi và chuồng nuôi động vật bệnh đều có thể chứa virus Sự lan tràn của virus

là do chất bài tiết và bài xuất có trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng [2]

2.4.3 Đường xâm nhập

Virus LMLM có thể xâm nhập vào cơ thể động vật cảm nhiễm bằng nhiềucon đường

Theo Lê Anh Phụng (2006), trong tự nhiên, hai con đường xâm nhậpchính của virus là đường hô hấp và đường tiêu hóa Ngoài ra, virus còn xâmnhập qua vết thương, qua đường sinh dục,…[3]

Ở đường hô hấp, sau khi virus phát triển ở vùng cuống họng, virus lansang vùng kế cận, vào hệ thống tuần hoàn và hệ lâm ba dẫn tới các tế bào, cơquan khắp cơ thể Trong phòng thí nghiệm, người ta gây cảm nhiễm bằng cáchtiêm nội bì và có hiệu quả nhất Bò và lợn, tiêm virus ở nội bì niêm mạc lưỡi.Chuột lang thì tiêm vào nội bì gan bàn chân Những đường tiêm bắp thịt, dưới

da, tĩnh mạch,… cho kết quả không chắc chắn và đòi hỏi liều virus cao hơn [2]

2.4.4 Đường truyền lây

Bệnh có thể truyền trực tiếp giữ động vật ốm và động vật khỏe, lây truyềnqua phân, nước tiểu, dụng cụ chăn nuôi Chó mèo, gia cầm không mắc bệnhnhưng cũng là môi giới truyền mầm bệnh Bệnh có thể lây truyền qua phươngtiện vận tải như xe máy, ô tô Ngoài ra, động vật khỏi bệnh luôn là nguồngieo rắc mầm bệnh, do đó thời gian dịch bệnh kéo dài khó dập tắt ở một địaphương [7]

Dịch lây lan mạnh là do việc buôn bán vận chuyển động vật, sản phẩmđộng vật từ các nước láng giềng qua biên giới vào nước ta và giữa các vùngmiền trong cả nước Việc giao lưu buôn bán càng được đẩy mạnh, các hoạt độngkiểm dịch động vật, kiểm soát giết mổ chưa đúng quy trình dịch bệnh càng cóđiều kiện phát triển Ngoài ra, bệnh còn phát do đưa động vật măc bệnh từ các ôdịch về địa phương để nuôi hoặc giết mổ, qua thức ăn, nước uống

Sự lây lan từ lợn sang bò hoặc từ bò sang bò thường qua đường khôngkhí Virus có thể tồn tại trong không khí một thời gian dài Tốc độ gió và hướnggió là những yếu tố quan trọng trong việc lây lan mầm bệnh qua không khí.Theođường không khí, virus LMLM có thể phát tán với khoảng cách 60 km ở đất liền

và 200 km ở biển so với nơi xảy ra [44]

Ở vùng dịch, các ổ dịch xảy ra mang tính chất chu kỳ Dịch xảy ra rồilắng xuống do đàn gia súc hết miễn dịch, bệnh phát triển thành dịch và bất ngờbùng lên từ ổ dịch nhỏ khi đàn gia súc trở nên mẫn cảm [6] Dịch thường bùngphát sau những trận mưa lũ kéo dài, dưới tác động của thời tiết, khí hậu của

Thời kì nung bệnh thường từ 1-3 ngày sau khi gây bệnh thực nghiệm, 2-7ngày hoặc 11 ngày khi gây bệnh trong tự nhiên [21].

Virus LMLM xâm nhập vào động vật chủ theo đường hô hấp hoặctheo vết xước trên da, đầu tiên chúng nhân lên với số lượng nhỏ tại nơi xâmnhập [34]

Vùng yết hầu của động vật nhai lại được coi như vùng sinh bệnh ban đầucủa virus LMLM, sau đó virus LMLM xâm nhập vào tổ chức lympho vùng hầuhay các hạch liên quan rồi đi vào máu Sau khi vào máu, virus LMLM được đưatới các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan tuyến, các hạch lympho khác và biểu môquanh miệng, chân, nơi phát sinh các mụn nước Mụn nước dày đặc sẽ xuất hiện

ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm, lưỡi, đầu vú

Sau khi mụn vỡ, những vết tích trên thượng bì nhanh chóng được lấpbằng, không để lại sẹo do tế bào Manpighi vẫn nguyên vẹn Mụn nước chỉ loétkhi nhiễm khuẩn kế phát, vi khuẩn sinh mủ, gây hoại tử xâm nhập gây bệnh lýcục bộ ăn sâu vào trong, có khi gây bại huyết, con vật có thể chết

Virus có thể xâm nhập vào phôi thai qua đường tuần hoàn con mẹ, nên giasúc chửa thường sẩy thai [20]

2.5 Triệu chứng, bệnh tích của bệnh lở mồm long móng

2.5.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày

Trâu bò: Triệu chứng lâm sàng thay đổi tùy theo thời gian mắc bệnh.Khi mắc bệnh trâu bò sốt cao 40-41,5ºC kéo dài trong 2-3 ngày Con vật

lờ đờ, uể oải, kém ăn, lông dựng, bứt rứt, khó chịu và run rẩy cơ Khi đã tạomụn nước ở miệng, lưỡi, bờ và kẽ móng, con vật có biểu hiện lâm sàng đặctrưng: Nhai nhóp nhép, run môi, chảy nước dãi liên tục như bọt xà phòng, runchân và đi khập khiễng, đứng lên nằm xuống khó khăn Khi các mụn nước vỡ ra

có màu vàng nhạt, thân nhiệt hạ xuống bình thường Quan sát thấy mụn nước vàsau này là vết loét ở mõm, lưỡi, xoang miệng, núm vú và trên da giữa móng trên

và móng dưới của bàn chân [24]

Trâu bò cái thấy xuất hiện mụn nước ở núm vú, đầu vú làm vú bị sưng, datấy đỏ và đau Ở bê nghé bệnh có thể nặng hơn, con vật sốt cao 41-43°C viêmruột, viêm phổi làm cho con vật khó thở chết Ở nuôi trâu, bò sữa thì bệnh gâythiệt hại hết sức nghiêm trọng, lượng sữa cạn dần [20]

Ở lợn: Con vật sốt cao 41-43°C, xuất hiện các mụn nhỏ ở miệng, bọngnước, sau vỡ ra, có màu đỏ xám, có phủ lớp bựa, ở quang móng chân mọc cácmụn nước giống như ở miệng Nếu là con cái thì mụn mọc quanh núm vú, bệnhnặng thì loét dạ dày và nhiễm khuẩn kế phát.

Ở dê, cừu: Bệnh thường nhẹ, mụn mọc ở miệng rất nhỏ và biến mất rấtnhanh, có khi không rõ, mụn ở chân tương tự như bò

Ở người: Người cũng có thể mắc bệnh do tiếp xúc với con vật bị bệnh vàbiểu hiện triệu chứng: sốt, mụn mọc ở đầu ngón tay, bàn tay, cánh tay, có khimột nửa trên người hay ở mặt, chân, đùi, vú, mụn ở người rất ngứa, gãi nhiều,

có khi mụn nhỏ li ti ở lợi, viêm miệng Bệnh có thể kéo dài 10 ngày đến 3 tuần.Trường hợp nặng, người có thể nôn mửa, tiêu chảy [7]

2.5.2 Bệnh tích

Bệnh ở đường tiêu hóa thì niêm mạc có mụn loét ở miệng, lợi, phía trong

má, mép chân răng, lưỡi, hầu, thực quản, dạ múi khế, dạ cỏ, ruột non, có khi có,những mảng xuất huyết, thối nát, tụ huyết Ở bộ máy hô hấp bệnh gây viêm khíquản, cuống phổi, màng phổi và phổi Cơ tim biến chất, mềm, dễ nát, có vếtxám, trắng nhạt hay vàng nhạt (tim có vằn) do mắc bệnh nhiều lần Màng timsung, có nước trong hay hơi đục Màng tâm nhĩ có chấm xuất huyết đỏ bằng đầuđinh ghim, lá lách sưng đen, chân xuất hiện mụn nước ở kẽ móng, móng long rađằng sau Khi con vật chết do biến chứng, thường thấy các bệnh tích mưng mủ

và tự hoại, nhất là ở các ngón chân, thối xương, thối gân, sưng khớp xương.Những con vật khỏi bệnh, có thể có những vết sẹo ở miệng, niêm mạc màuhồng, chỗ sẹo không có màu trong 2-3 tháng sau khi khỏi bệnh [2]

A Hoại tử cơ tim vằn da hổ B Vết loét ở lợi

C Nghé có dấu hiệu xùi bọt mép D Vết loét ở lưỡi

E Vết loét ở kẽ chân F Vết loét ở lưỡi

Bệnh LMLM có những triệu chứng rõ rệt dễ phân biệt với các bệnh khácvới những triệu chứng đặc trưng như con vật sốt cao, chảy nước bọt nhiều, cóbiểu hiện què, có các mụn nước ở niêm mạc miệng, lợi, chân răng, lưỡi, kẽmóng, gờ móng, ở vú Những gia súc mới khỏi bệnh thì trên niêm mạc miệng,lợi, chân răng, lưỡi, kẽ móng có các vết sẹo Đối với lợn da trắng, có thể xuấthiện các vệt đen trên móng chân màu trắng, thông thường lợn mắc bệnh dễ bị tụtmóng chân hơn bò Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng thường bị nhầm với cácbệnh khác như: viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước lợn, bệnh dịch tả trâu

bò, bệnh tiêu chảy do virus của bò, bệnh đậu bò Khi trâu bò mắc bệnh, chẩnđoán thông qua triệu chứng lâm sàng là tương đối chính xác, ở lợn thì cần phảichẩn đoán phân biệt với các bệnh mụn nước [25]

2.6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Tại những nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, triệu chứng lâm sàngchỉ có tính chất định hướng trong chẩn đoán và nhất thiết phải dùng biện phápchẩn đoán bằng xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để khẳng định bệnh

Bệnh phẩm thích hợp để phân lập virus LMLM là biểu mô và dịch tiết ởcác mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ Lượng tối thiểu phải từ 3-5g tổ chức tươi

Để phát hiện kháng thể thì bệnh phẩm là máu những con nghi mắc bệnhvới lượng 3-5 ml, để máu đông chắt lấy huyết thanh Bệnh phẩm phải được bảoquản ở nhiệt độ lạnh

Mẫu giám sát lưu hành virus là mẫu dịch hầu họng (Probang) bảo quảntrong dung dịch BHI, MEM:

2.6.2.2 Chẩn đoán bằng các phản ứng trung hoà virus

Trong cơ thể động vật mắc bệnh, virus gây bệnh kích thích sản sinh rakháng thể tương ứng, kháng thể này có khả nămg trung hoà chính virus kíchthích sinh ra nó, làm virus không còn khả năng gây bệnh thí nghiệm và phá hủy

tế bào mẫn cảm

Căn cứ vào có hay không có sự biến đổi tế bào sau khi cấy hỗn hợp khángnguyên-kháng thể để xác định con vật không hay có bị bệnh và bị bệnh do typevirus LMLM nào

Phản ứng trung hoà virus thường rất nhạy và đặc hiệu, chỉ cần 2- 3 ngày

là có kết quả nhưng nếu lượng huyết thanh ít, hiệu giá thấp, dương tính giả cóthể xảy ra

2.6.2.3 Chẩn đoán bằng phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)

Phản ứng KHBT được thực hiện nhờ hệ thống dung huyết và hệ thốngdung khuẩn với sự tham gia của bổ thể Bởi vì, sự dung khuẩn mắt thườngkhông nhìn thấy được, do vậy phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kếtquả qua quan sát bằng mắt thường

- Huyết thanh miễn dịch của từng type được chế trên chuột lang bằngphương pháp gây tối miễn dịch Tiêm vaccine LMLM của từng type virusLMLM khác nhau vào trong da dưới gan bàn chân chuột lang (mỗi type mộtchuột) hai lần mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt huyết thanh cóchứa kháng thể

- Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩmcấy vào trong môi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bàothận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tương đương, khi tếbào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tích tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp

* Phân loại phản ứng ELISA

Phản ứng ELISA được phân thành ba loại chính như sau:

- Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): Dùng kháng thể gắn enzym

để xác định kháng nguyên nghi cố định trên đĩa chuyên dụng

- Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): Dùng kháng nguyên chuẩn

và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi

- Phản ứng sandwich ELISA gồm 2 loại:

+ Phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp (direct Sandwich ELISA): Khángnguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể gắn emzym

+ Phản ứng Sandwich ELISA gián tiếp (indirect Sandwich ELISA):Kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể nghi, sau đókháng thể nghi được nhận diện bằng kháng kháng thể loài gắn enzym

* Ứng dụng phản ứng ELISA trong chẩn đoán bệnh LMLM

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên virus LMLM

Phương pháp ELISA thường được sử dụng để xác định sự có mặt củakháng nguyên virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm lấy từ gia súc bị nghi ngờnhiễm virus

Kháng nguyên của virus LMLM có thể xác định bằng phương phápELISA trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm biểu mô hay dịch tiết ở các mụn nước chưa

vỡ hoặc mới vỡ

Còn mẫu được lấy từ nơi chứa ít virus hay chất lượng mẫu không đảmbảo thì trước khi định type virus bằng phương pháp ELISA sẽ tiến hành nuôi cấyvirus trên môi trường tế bào sau đó phân lập virus từ môi trường nuôi cấy

- Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM

Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để phát hiện và giám định cácserotype của virus LMLM trong huyết thanh gia súc Trong phản ứng, mỗi đĩaELISA chỉ làm với một type virus LMLM chuẩn, để phát hiện kháng thể nghitrong huyết thanh của gia súc cần chẩn đoán

Có thể sử dụng cả ba phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể khángvirus LMLM Nhưng hiện nay phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp thườngđược sử dụng phổ biến hơn cả Bởi vì, kĩ thuật ELISA này có thuận lợi hơn hẳncác phản ứng thông thường khác do có tính đặc hiệu rất cao, rất nhạy lại kinh tế

vì nhiều ứng dụng:

+ Trong chẩn đoán phát hiện bệnh, với phương pháp Sandwich ELISAgián tiếp chúng ta có thể phát hiện và định type kháng nguyên virus LMLM từmẫu bệnh phẩm biểu mô, dịch tiết hay có thể phát hiện kháng thể và giám địnhserotype virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm huyết thanh

+ Đối với gia súc đã tiêm phòng vaccine, để đánh giá khả năng đáp ứngmiễn dịch của gia súc sau tiêm phòng cũng như hiệu quả sử dụng vaccine người

ta cũng sử dụng phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp để định lượng khángthể kháng virus LMLM

Phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA)

Trong chẩn đoán huyết thanh học, phương pháp Sandwich ELISA giántiếp được sử dụng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là phương pháp LPB -ELISA Phương pháp này được nghiên cứu và đưa ra lần đầu tiên bởi Hamblin

và cộng sự vào năm 1986 Độ nhạy của phản ứng LPB - ELISA tương đươngvới phản ứng trung hòa virus nhưng lại không phải nuôi cấy tế bào trong xétnghiệm Do đó, đây là một phương pháp xét nghiệm hiệu quả, an toàn và ít tốnkém hơn so với phương pháp trung hòa virus rất nhiều

Kỹ thuật chẩn đoán này cho kết quả nhanh trong vòng 3-4 giờ, không phụthuộc môi trường mô, tỷ lệ phần trăm dương tính giả thấp Do có thể sử dụngkháng nguyên vô hoạt nên xét nghiệm được với số lượng chủng virus nhiều hơn

Hiện nay, để thuận lợi cho việc chẩn đoán tại các phòng thí nghiệm, người

ta đã sản xuất các bộ kít chẩn đoán dựa trên kỹ thuật LPB - ELISA Các thànhphần và nguyên liệu cho phản ứng vẫn có thể thực hiện được xét nghiệm dễdàng Có hai loại bộ kít đã được sản xuất là bộ kít LPB - ELISA bao gồm bộkháng thể chuẩn để phát hiện 7 serotype virus và bộ kít LPB - ELISA phát hiện

3 hoặc 4 serotype virus LMLM

Hiện bộ kít LPB - ELISA chẩn đoán đang được sử dụng tại Việt Namgồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4 serotype virus O, A, C và Asia1

* Phương pháp NSP - ELISA (Non Structural Protein ELISA)

Những năm trước đây tổ chức Thú y thế giới (OIE) vẫn còn chưa cóhướng dẫn quy trình chính thức để phân biệt gia súc bị nhiễm virus (sau khi đãlành bệnh) với gia súc đã tiêm phòng vaccine LMLM Các phương pháp huyếtthanh học chính thức được hướng dẫn chỉ để định lượng kháng thể khángprotein cấu trúc (Structural proteins – SP) của virus LMLM, nhưng không thể

phân biệt kháng thể tạo ra do gia súc nhiễm bệnh LMLM hay do tiêm phòngvaccine

Tìm các phương pháp huyết thanh học có thể phân biệt kháng thể có tronghuyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM với kháng thể có trong huyếtthanh của gia súc được tiêm phòng vaccine là trọng tâm nghiên cứu trong nhiềuthập niên qua

Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu và tìm ra được mộtphương pháp phát hiện được kháng thể có trong huyết thanh của gia súc bịnhiễm virus LMLM, kể cả những con vật đã được tiêm phòng vaccine Đây làphương pháp ELISA định lượng kháng thể kháng kháng nguyên không cấu trúc(Non-structural Proteins-NSP) của virus LMLM trong huyết thanh gia súc.Phương pháp này được gọi là phương pháp NSP - ELISA

Phương pháp NSP-ELISA được dùng trong chẩn đoán phân biệt khángthể trong huyết thanh của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với khángthể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phòng vaccine

Phương pháp NSP-ELISA dựa trên nguyên lý sau: Sau khi virus LMLMnhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra Trong quátrình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo thành các hạt virus mới, vừatạo ra các thành phần không tham gia kết hợp thành các hạt virus mới mà chỉđóng vai trò các enzym giúp cho quá trình nhân lên Các thành phần kết hợpthành bản thân các hạt virus có tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên cấu trúc(SP) Các thành phần không tham gia kết hợp thành các hạt virus mới có tínhkháng nguyên gọi là kháng nguyên không cấu trúc (NSP)

Trong đó một số kháng nguyên không cấu trúc có khả năng kích thích giasúc tạo ra kháng thể với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanhgia súc (nhất là trâu bò) đã nhiễm bệnh Còn gia súc được tiêm phòng vaccine,đặc biệt những loại vaccine vô hoạt có độ tinh khiết cao (đã được loại bỏ nhữngkháng nguyên không cấu trúc) sẽ chỉ sản sinh kháng thể đặc hiệu chống virusLMLM chứ không có kháng thể kháng lại kháng nguyên không cấu trúc Vì vậy,việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên không cấu trúc cho phépkết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM

Phương pháp NSP – ELISA được sử dụng chẩn đoán cho nhiều loại giasúc như trâu bò, dê, cừu Kháng nguyên không cấu trúc xuất hiện sớm nhất sau 8

đặc hiệu kháng kháng nguyên không cấu trúc của virus LMLM, chúng ta có thểxác định được động vật nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào, cả nhữngcon chưa tiêm hay đã tiêm phòng vaccine, những con không có triệu trứng lâmsàng, thậm chí cả ngay khi ổ dịch nổ ra 1 năm

Phương pháp NSP-ELISA hoàn toàn nhạy khi sử dụng chẩn đoán cho mộtđàn gia súc với số lượng lớn Nhiều bộ kít chẩn đoán dựa trên kĩ thuật NSP-ELISA của các hãng khác nhau trên thế giới đã được sản xuất và sử dụng.Nhưng đến 10/2001 sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, Tổ chức thú y thế giới(OIE) đã chính thức công nhận bốn bộ kít chẩn đoán có độ chính xác và đặc hiệucao trong chẩn đoán xác định gia súc nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thểtrong huyết thanh của gia súc do tiêm phòng vaccine là: Chekit- FMD-3ABCcủa Bommeli Diagnostics, FMDV NSP ELISA của UBI, Ceditest FMDV - NScủa Cedi Diagnostics, Priocheck®FMDV NS của Prionics

- Phương pháp 3ABC - ELISA

Một trong những phương pháp chẩn đoán dựa vào việc xác định khángnguyên không cấu trúc được sử dụng rộng rãi trên thế giới và đem lại hiệu quảcao là phương pháp 3ABC-ELISA Phương pháp chẩn đoán này nhằm xác địnhkháng nguyên không cấu trúc 3ABC của virus LMLM 3ABC được xác định làmột trong những kháng nguyên có khả năng kích thích gia súc sinh đáp ứngmiễn dịch cao nhất Phương pháp 3ABC - ELISA được Bergmann cùng cáccộng sự nghiên cứu, đưa ra lần đầu tiên vào năm 1993 đã thu được nhiều thànhcông khi ứng dụng rộng rãi ở Nam Mỹ

Bộ kít thương mại được xây dựng dựa trên kĩ thuật 3ABC-ELISA được

sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm này là bộ Chekit–FMD-3ABC củaBommeli Diagnostics – Thụy Sỹ Bộ kít này có những ưu điểm:

+ Cho phép phát hiện kháng thể 3ABC ở bò và cừu bị nhiễm virusLMLM với bất kỳ serotype nào sau 10-14 ngày và kéo dài 1 năm với độ chínhxác tới 99,95% Vì vậy, khi kết quả dương tính ta có thể kết luận trâu, bò bịnhiễm virus LMLM

+ Dễ sử dụng do các thành phần phản ứng đã có sẵn, đồng thời phươngpháp tiến hành đơn giản

+ Kiểm tra khối lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

+ Mỗi lần làm xét nghiệm có thể kiểm tra các mẫu của nhiều loài (trâu,

bò, cừu)

2.6.2.5 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT- PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sựphát minh ra vào năm 1985 Kỹ thuật PCR là một phương pháp tạo dòng invitro,cho phép khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và tươngđối dài, mà không cần đến việc tách và nhân dòng (cloning) Với những virusthuộc loại virus RNA thì phải tiến hành thêm phản ứng sao chép ngược nhờ vàomen sao chép ngược RT (Reverse Transcriptase) để chuyển RNA thành DNA.Sau đó tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thông thường [39] Do đó

kỹ thuật này được gọi là RT- PCR

2.6.2.6 Phương pháp Realtime PCR

Nguyên lý phản ứng Realtime PCR

Phản ứng Realtime PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm củaquá trình sao chép DNA Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếchđại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gelagarose khi phản ứng kết thúc Ngược lại, RT-PCR cho phép phát hiện và địnhlượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năngnày được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang.Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA vànhững trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe KhiDNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượngtín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA Khi sử dụng máyRealtime PCR, hệ thống ghi được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuyếchđại xảy ra Ban đầu tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể pháthiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuyếch đại và sản phẩm đã tăngtheo hàm mũ Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tínhiệu huỳnh quang có thể phát hiện được Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng

Ct (Cycle of threshold) Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng

Virus lở mồm long móng có vật chất di truyền là RNA nên trong phảnứng Realtime PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA sang DNA gọi làReverse trancription nên phương pháp này gọi là Realtime RT- PCR

Nguyên lý hoạt động của Probe

Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóachất được sử dụng trong phản ứng Realtime RT-PCR là Taqman Probe, TaqmanProbe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh

Taqman Probe gắn một chất huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụhuỳnh quang ở đầu 3’ Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang

bị hấp phụ do nó nằm gần chất hấp phụ Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéodài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạtđộng 5’- 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắnchất huỳnh quang Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tínhiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuyếch đại trong mẫu [28]

Khai báo ngay khi có dịch hoặc nghi có dịch LMLM

Cách ly triệt để gia súc ốm, điều trị tích cực, sau khi khỏi 45 ngày mớicho nhập đàn nếu số lượng gia súc mắc bệnh nhiều

Thực hiện tích cực việc bao vây dập tắt ổ dịch bằng mọi biện pháp Xử lýtriệt để gia súc mắc bệnh bằng cách tiêu diệt hoàn toàn tránh lây lan ra diệnrộng, có thể đem gia súc đi chôn ở nơi xa dân cư hoặc thiêu đốt

Tiêu độc định kỳ môi trường, nơi liên quan đến chăn nuôi động vật, nhất

là vùng ổ dịch cũ hoặc nơi phát sinh để diệt mầm bệnh Xử lý vệ sinh thú y triệt

để các phương tiên vận chuyển thức ăn chăn nuôi, vật dụng (quần áo) và nướcuống

Sử dụng các chất sát trùng như NaOH 2%, formol 1-2%, Prophyl 0,5%,Biodine 0.33%, Halamid 0,5%, Antec 1%,… để tiêu độc khử trùng

Vận chuyển và giết mổ: Cấm mua bán, xuất nhập động vật trong vùng códịch Việc mua bán, giết mổ phải có sự đồng ý của các cơ quan chức năng cóthẩm quyền

2.7.1.2 Phòng bệnh bằng vaccine

Để có hiệu quả tiêm phòng phải sử dụng các loại vaccine LMLM có hiệulực, tương đồng về tính kháng nguyên chống các chủng virus đang gây bệnhhoặc đe dọa gây bệnh.Yêu cầu phải tiêm đúng type/ subtype Tốt nhất nên định

kỳ tiêm phòng vaccine LMLM, 2 lần/năm [26]

2.7.2 Điều trị

* Sử dụng huyết thanh miễn dịch

Huyết thanh miễn dịch tức là lấy huyết thanh của động vật khỏi bệnh đểđiều trị cho động vật bị bệnh Đối với trâu bò, tiêm dưới da 120-150 ml/ ngàytùy theo trọng lượng [20]

* Điều trị

Việc điều trị chủ yếu là chữa trị các triệu chứng (các vết thương ở miệng,vùng rìa móng, giảm sốt…) và sử dụng các loại kháng sinh để ngăn ngừa phụnhiễm và các biến chứng xảy ra trên gia súc

Dùng các chất chua như nước dấm ( acid acetic 2%), thuốc tím 0,1% haydùng các quả chua như chanh, khế, quất sát vào các mụn nước trong miệng.Dùng nước muối 2-3% để rửa các vết loét ở chân, dùng nước lá chát sắc đặc như

lá ổi, lá sim, lá cây cứt lợn Bôi các vết loét bằng một trong các chất sau: cồn iod3-5%, xanh methylene Dùng kháng sinh chống nhiễm trùng [20]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Trâu bò nuôi tại các xã của huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại Cơ quan Thú y vùng III

- Mẫu giám sát được lấy tại các xã của huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình

- Kết quả điều tra được thực hiện tại các xã của huyện Quảng Ninh, tỉnhQuảng Bình

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2014 đến tháng 5/2015

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sự lưu hành kháng thể 3ABC của virus lở mồm long móng trênđàn trâu, bò nuôi tại các xã của huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình

- Đánh giá một số yếu tố nguy cơ có khả năng làm phát sinh, lây lan dịchbệnh LMLM trên địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Vật liệu nghiên cứu

+ Micropipet một kênh lấy được thể tích từ 25-50 µl, 100-1000 µl

+ Micropipet đa kênh lấy được thể tích từ 25-50 µl, 50-300 µl

+ Đĩa nhựa chữ U 96 giếng; nắp đậy đĩa; tip phù hợp với micropipet.Reservoirs (máng chứa nguyên liệu); lọ nhựa hoặc thủy tinh 20 ml, 50 ml, 100

ml, 200 ml

+ Dụng cụ lấy mẫu: Bơm tiêm, kim tiêm 18, ống chắt huyết thanh 2 ml,hộp xốp, bình ni-tơ lỏng, dụng cụ bảo hộ lao động

* Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm

- Mẫu giám sát: Mẫu huyết thanh

- Kít xét nghiệm phát hiện kháng thể lở mồm long móng 3ABC bằngphương pháp ELISA: PrioCHECK® FMDV NS

3.4.2 Phương pháp thu thập thông tin

Điều tra hồi cứu các hộ chăn nuôi trâu, bò tại địa phương nghiên cứu bằngphiếu điều tra để xác định các yếu tố nguy cơ

3.4.3 Phương pháp giám sát sự lưu hành của virus

3.4.3.1 Thiết kế mẫu đại diện

Mẫu huyết thanh dùng để đánh giá tỷ lệ lưu hành kháng thể 3ABC đượcthu thập theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên [18], từ vùng trọng điểm củadịch LMLM type A trong tháng 7, 8 năm 2014 là 3 xã Vạn Ninh, Vĩnh Ninh vàTrường Xuân

3.4.3.2 Phương pháp lấy mẫu

- Phương pháp lấy máu và thu huyết thanh: Máu được lấy từ tĩnh mạch

cổ, tĩnh mạch tai, tĩnh mạch đuôi đối với trâu và bò; dùng xi ranh và kim tiêm18G vô trùng, lượng máu tối thiểu là 3 ml, rút xi lanh để có khoảng không khígần bằng lượng máu, để nghiêng 45º trong điều kiện nhiệt độ phòng, khoảng 1-2giờ, khi huyết thanh tiết ra chắt vào ống chắt huyết thanh 2 ml, bảo quản ở trongthùng xốp lạnh, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm

- Bảo quản và vận chuyển mẫu: mẫu được bảo quản ở 40ºC trong phíchlạnh vận chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt hoặc được bảo quản ởnhiệt độ âm của tủ lạnh nếu chưa chuyển kịp về phòng thí nghiệm; tại phòng thínghiệm nếu chưa xét nghiệm thì bảo quản ở -200ºC đến -800ºC

3.4.3.3 Phát hiện kháng thể LMLM 3ABC bằng phương pháp ELISA

Để phát hiện kháng thể LMLM 3ABC trong huyết thanh chúng tôi sửdụng bộ kít PrioCHECK ® FMDV NS

PrioCHECK ® FMDV NS là một kít ELISA dùng để phát hiện kháng thểkháng lại protein không cấu trúc 3ABC (nonstructural 3ABC) của virus lở mồmlong móng

nghiệm sau đó sẽ được thêm vào một MAB thứ hai có gắn với một loại enzymtạo ra tín hiệu màu.

Nếu có kháng thể trong huyết thanh xét nghiệm thì kháng thể này sẽ ngăncản kháng thể có gắn enzym (MAB thứ hai) gắn vào protein không cấu trúc3ABC của virus LMLM Do đó, các mẫu dương tính thì sẽ không thể hiện màu(hình 3.1)

Thành phần bộ kít PrioCHECK ® FMDV NS và các bước chuẩn bị tiếnhành phản ứng được trình bày ở phần phụ lục 2

Hình 3.1 Sơ đồ mô phỏng phản ứng phát hiện kháng thể LMLM 3ABC bằng

phương pháp ELISA, bộ kít PrioCHECK ® FMD NS

* Các bước tiến hành

- Ngày 1: Ủ huyết thanh xét nghiệm

Bước 1: Cho 80 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngBước 2: Cho 20 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl Strong Positive-Component 7 vào giếng A1 và B1Bước 3: Cho 20 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl Weak Positive-Component 8 vào giếng C1 và D1Bước 4: Cho 20 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl Negative-Component 9 vào giếng E1 và F1

Bước 5: Cho 20 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl huyết thanh xét nghiệm vào các giếng còn lại

Bước 6: Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít

Bước 7: Lắc đều đĩa

Bước 8: Ủ qua đêm (16-18 giờ) ở nhiệt độ 22±3ºC

- Ngày 2:

+ Ủ với Conjugate

Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200-300 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl/giếng của nước rửa

Bước 2: Cho 100 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl Conjugate đã pha loãng vào tất cả các giếng

Bước 3: Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít

Bước 4: Ủ 60±5 phút ở nhiệt độ 22±3ºC

+ Ủ với chất phát màu Chromogen-Substrate TMB

Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200-300 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl/giếng của nước rửa

Bước 2: Cho 100 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứngl TMB (Component 10) vào tất cả các giếng

A PCtr-Str Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

B PCtr-Str Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

C PCtr-W Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

D PCtr-W Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

E NCtr Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

F NCtr Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

G Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

H Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu

Hình 3.2 Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng thể 3ABC

Chú thích: PCtr-Str: đối chứng dương mạnh; PCtr-W: đối chứng dươngyếu;

NCtr: đối chứng âm; các giếng còn lại là mẫu nghiên cứu

* Đọc phản ứng và tính kết quả

Phản ứng có màu sau khoảng 15 phút và dừng phản ứng bằng dung dịchStop và đo OD (optical density) ở bước sóng 450 nm

Tính giá trị trung bình OD450nmmax = giá trị OD450 trung bình ở giếng E1

và F1 (Negative Control = ODmax)

Giá trị PI (percentage Inhibition) của mẫu đối chứng và mẫu huyết thanhxét nghiệm được tính bởi công thức:

* Các điều kiện để chấp nhận kết quả:

(1) Giá trị PI trung bình của Positive Control phải >70%

(2) Giá trị PI trung bình của Weak Positive Control phải >50%

(3) Giá trị trung bình OD450 Negative Control >1

(4) Các đĩa không đạt các tiêu chuẩn nêu trên thì kết quả xét nghiệmkhông được chấp nhận

* Đánh giá kết quả:

(1) Nếu PI < 50% đánh giá mẫu không có kháng thể (negative)

(2) Nếu PI ≥ 50% đánh giá mẫu có kháng thể (positive)

3.4.4 Phương pháp xác định các yếu tố nguy cơ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng trong việc xác định cácyếu tố nguy cơ

Các yếu tố nguy cơ xem xét bao gồm: Không tiêm phòng vaccine LMLM;

hộ chăn nuôi gần chợ; hộ chăn nuôi gần hộ đã có dịch LMLM; hộ chăn nuôi sửdụng nguồn nước ao, hồ, sông, suối cho đàn gia súc

Bố trí thí nghiệm: Chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 9 xã của huyện QuảngNinh, tỉnh Quảng Bình để tiến hành nghiên cứu Chín xã trên được chia làm 2nhóm ngẫu nhiên:

Nhóm 1: 34 hộ chăn nuôi có trâu bò mắc bệnh LMLM trong giai đoạn

2010 – 2014

Nhóm 2: 86 hộ chăn nuôi không có trâu bò mắc bệnh LMLM giai đoạn

2010 - 2014 Các hộ có trâu bò mắc bệnh LMLM được chọn một cách ngẫunhiên dựa vào danh sách hộ chăn nuôi trâu bò của huyện và phân bố bắt cặptheo tỷ lệ với hộ có trâu bò mắc bệnh của từng xã

Thiết kế bảng câu hỏi điều tra các yếu tố nguy cơ gây phát sinh và lây landịch LMLM tại huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình giai đoạn 2010 – 2014

Giá trị OD450 mẫu xét nghiệm

PI = 100 - ( * 100)

Giá trị OD450 max