* Trang thiết bị:
+ Máy đọc ELISA, máy rửa đĩa ELISA, máy lắc ủ đĩa ELISA.
+ Máy lắc.
+ Tủ lạnh -80ºC, -20ºC và 4ºC.
+ Đồng hồ đếm thời gian có chuông báo khi kết thúc.
* Dụng cụ thí nghiệm:
+ Micropipet một kờnh lấy được thể tớch từ 25-50 àl, 100-1000 àl.
+ Micropipet đa kờnh lấy được thể tớch từ 25-50 àl, 50-300 àl.
+ Đĩa nhựa chữ U 96 giếng; nắp đậy đĩa; tip phù hợp với micropipet.
Reservoirs (máng chứa nguyên liệu); lọ nhựa hoặc thủy tinh 20 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml.
+ Dụng cụ lấy mẫu: Bơm tiêm, kim tiêm 18, ống chắt huyết thanh 2 ml, hộp xốp, bình ni-tơ lỏng, dụng cụ bảo hộ lao động.
* Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm - Mẫu giám sát: Mẫu huyết thanh.
- Kít xét nghiệm phát hiện kháng thể lở mồm long móng 3ABC bằng phương pháp ELISA: PrioCHECK® FMDV NS.
3.4.2. Phương pháp thu thập thông tin
Điều tra hồi cứu các hộ chăn nuôi trâu, bò tại địa phương nghiên cứu bằng phiếu điều tra để xác định các yếu tố nguy cơ.
3.4.3. Phương pháp giám sát sự lưu hành của virus 3.4.3.1. Thiết kế mẫu đại diện
Mẫu huyết thanh dùng để đánh giá tỷ lệ lưu hành kháng thể 3ABC được thu thập theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên [18], từ vùng trọng điểm của dịch LMLM type A trong tháng 7, 8 năm 2014 là 3 xã Vạn Ninh, Vĩnh Ninh và Trường Xuân.
3.4.3.2. Phương pháp lấy mẫu
- Phương pháp lấy máu và thu huyết thanh: Máu được lấy từ tĩnh mạch cổ, tĩnh mạch tai, tĩnh mạch đuôi đối với trâu và bò; dùng xi ranh và kim tiêm 18G vô trùng, lượng máu tối thiểu là 3 ml, rút xi lanh để có khoảng không khí gần bằng lượng máu, để nghiêng 45º trong điều kiện nhiệt độ phòng, khoảng 1-2 giờ, khi huyết thanh tiết ra chắt vào ống chắt huyết thanh 2 ml, bảo quản ở trong thùng xốp lạnh, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
- Bảo quản và vận chuyển mẫu: mẫu được bảo quản ở 40ºC trong phích lạnh vận chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt hoặc được bảo quản ở nhiệt độ âm của tủ lạnh nếu chưa chuyển kịp về phòng thí nghiệm; tại phòng thí nghiệm nếu chưa xét nghiệm thì bảo quản ở -200ºC đến -800ºC.
3.4.3.3. Phát hiện kháng thể LMLM 3ABC bằng phương pháp ELISA
Để phát hiện kháng thể LMLM 3ABC trong huyết thanh chúng tôi sử dụng bộ kít PrioCHECK ® FMDV NS.
PrioCHECK ® FMDV NS là một kít ELISA dùng để phát hiện kháng thể kháng lại protein không cấu trúc 3ABC (nonstructural 3ABC) của virus lở mồm long móng.
Các đĩa phản ứng trong kít được phủ bởi kháng thể đơn dòng (MAB) gắn với protein không cấu trúc 3ABC của virus LMLM. Các mẫu huyết thanh xét nghiệm sau đó sẽ được thêm vào một MAB thứ hai có gắn với một loại enzym tạo ra tín hiệu màu.
Nếu có kháng thể trong huyết thanh xét nghiệm thì kháng thể này sẽ ngăn cản kháng thể có gắn enzym (MAB thứ hai) gắn vào protein không cấu trúc 3ABC của virus LMLM. Do đó, các mẫu dương tính thì sẽ không thể hiện màu (hình 3.1).
Thành phần bộ kít PrioCHECK ® FMDV NS và các bước chuẩn bị tiến hành phản ứng được trình bày ở phần phụ lục 2.
Hình 3.1. Sơ đồ mô phỏng phản ứng phát hiện kháng thể LMLM 3ABC bằng phương pháp ELISA, bộ kít PrioCHECK ® FMD NS
* Các bước tiến hành
- Ngày 1: Ủ huyết thanh xét nghiệm
Bước 1: Cho 80 μl ELISA buffer đến tất cả các giếng trong đĩa phản ứng Bước 2: Cho 20 μl Strong Positive-Component 7 vào giếng A1 và B1 Bước 3: Cho 20 μl Weak Positive-Component 8 vào giếng C1 và D1 Bước 4: Cho 20 μl Negative-Component 9 vào giếng E1 và F1
Bước 5: Cho 20 μl huyết thanh xét nghiệm vào các giếng còn lại Bước 6: Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít
Bước 7: Lắc đều đĩa
Bước 8: Ủ qua đêm (16-18 giờ) ở nhiệt độ 22±3ºC.
- Ngày 2:
+ Ủ với Conjugate
Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200-300 μl/giếng của nước rửa.
Bước 2: Cho 100 μl Conjugate đã pha loãng vào tất cả các giếng Bước 3: Dán kín đĩa bằng tấm dán có sẵn trong bộ kít
Bước 4: Ủ 60±5 phút ở nhiệt độ 22±3ºC.
+ Ủ với chất phát màu Chromogen-Substrate TMB
Bước 1: Rửa đĩa phản ứng 6 lần với 200-300 μl/giếng của nước rửa.
Bước 2: Cho 100 μl TMB (Component 10) vào tất cả các giếng Bước 3: Ủ 20 phút ở nhiệt độ 22±3ºC
Bước 4: Cho 100 μl dung dịch Stop (Component 11) vào tất cả các giếng Bước 5: Lắc đều đĩa trước khi cho vào máy đọc.
Sơ đồ bố trí đĩa phản ứng ELISA được trình bày ở hình 2.2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A PCtr-Str Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu B PCtr-Str Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu C PCtr-W Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu D PCtr-W Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu E NCtr Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu F NCtr Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu G Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu H Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu
Hình 3.2. Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng thể 3ABC
Chú thích: PCtr-Str: đối chứng dương mạnh; PCtr-W: đối chứng dương yếu;
NCtr: đối chứng âm; các giếng còn lại là mẫu nghiên cứu.
* Đọc phản ứng và tính kết quả
Phản ứng có màu sau khoảng 15 phút và dừng phản ứng bằng dung dịch Stop và đo OD (optical density) ở bước sóng 450 nm.
Tính giá trị trung bình OD450nmmax = giá trị OD450 trung bình ở giếng E1 và F1 (Negative Control = ODmax).
Giá trị PI (percentage Inhibition) của mẫu đối chứng và mẫu huyết thanh xét nghiệm được tính bởi công thức:
* Các điều kiện để chấp nhận kết quả:
1 Giá trị PI trung bình của Positive Control phải >70%
2 Giá trị PI trung bình của Weak Positive Control phải >50%
3 Giá trị trung bình OD450 Negative Control >1
4 Các đĩa không đạt các tiêu chuẩn nêu trên thì kết quả xét nghiệm không được chấp nhận.
* Đánh giá kết quả:
1 Nếu PI < 50% đánh giá mẫu không có kháng thể (negative)
2 Nếu PI ≥ 50% đánh giá mẫu có kháng thể (positive) 3.4.4. Phương pháp xác định các yếu tố nguy cơ
Sử dụng phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng trong việc xác định các yếu tố nguy cơ.
Các yếu tố nguy cơ xem xét bao gồm: Không tiêm phòng vaccine LMLM;
hộ chăn nuôi gần chợ; hộ chăn nuôi gần hộ đã có dịch LMLM; hộ chăn nuôi sử dụng nguồn nước ao, hồ, sông, suối cho đàn gia súc.
Bố trí thí nghiệm: Chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 9 xã của huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình để tiến hành nghiên cứu. Chín xã trên được chia làm 2 nhóm ngẫu nhiên:
Nhóm 1: 34 hộ chăn nuôi có trâu bò mắc bệnh LMLM trong giai đoạn 2010 – 2014.
Nhóm 2: 86 hộ chăn nuôi không có trâu bò mắc bệnh LMLM giai đoạn 2010 - 2014. Các hộ có trâu bò mắc bệnh LMLM được chọn một cách ngẫu nhiên dựa vào danh sách hộ chăn nuôi trâu bò của huyện và phân bố bắt cặp theo tỷ lệ với hộ có trâu bò mắc bệnh của từng xã.
Thiết kế bảng câu hỏi điều tra các yếu tố nguy cơ gây phát sinh và lây lan dịch LMLM tại huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình giai đoạn 2010 – 2014.
Giá trị OD450 mẫu xét nghiệm
PI = 100 - ( * 100) Giá trị OD450 max
Số liệu sử dụng để đánh giá các yếu tố nguy cơ được thể hiện dưới dạng bảng tương liên 2 x 2 như sau:
Yếu tố nguy cơ Kết quả xét nghiệm
Bệnh Không bị bệnh Tổng
Phơi nhiễm A b a+b
Không phơi nhiễm C d c+d
Tổng a+c b+d a+b+c+d
Sử dụng chỉ số Khi bình phương (Chi-square) để có kết luận về mối liên quan của yếu tố nguy cơ với khả năng nhiễm bệnh và sử dụng phần mềm Epicalc 2000 để tính toán.
- Tỷ suất chênh (odd ratio - OR) được tính toán theo công thức:
OR ad
= bc
OR là đại lượng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với yếu tố nguy cơ.
OR>1: Yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh (nguy cơ tăng).
OR = 1: Không có ảnh hưởng, khác nhau giữa hai nhóm.
OR < 1: Nguy cơ giảm (khi đối tượng nghiên cứu được bảo vệ) [32].
- Giả thuyết:
Ho: Không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với yếu tố nguy cơ nghiên cứu.
Khi P < 0,05: Khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm bệnh và nhóm chứng với yếu tố nguy cơ nghiên cứu. Nhóm phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng lây nhiễm virus LMLM OR lần so với nhóm không phơi nhiễm.