XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BẮP CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BẮP CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN NGỌC NGÂN Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN BẮP CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN NGỌC NGÂN KS NGUYỄN PHAN THÀNH Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS Huỳnh Văn Biết, ngƣời hƣớng dẫn nhiều kiến thức lý thuyết KS Nguyễn Phan Thành giúp đỡ tơi hồn thiện kỹ thuật thực nghiệm để tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp Viện Công nghệ Sinh học Môi trƣờng tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị hóa chất cho tơi q trình làm thí nghiệm Bạn Nguyễn Hữu Nghĩa, Phạm Văn Lâm bạn làm thí nghiệm Viện Cơng nghệ Sinh học Môi trƣờng giúp đỡ ủng hộ vƣợt qua giai đoạn khó khăn lúc thực đề tài tốt nghiệp ThS Tơn Bảo Linh giảng dạy cho kiến thức sinh học phân tử, giúp tơi có tảng vững thực đề tài Bố, Mẹ động viên ủng hộ tháng thực đề tài Em Nguyễn Hồi Tiến, ngƣời ln nỗ lực để tạo điều kiện tốt để tơi chuyên tâm thực đề tài Ngƣời thực Nguyễn Ngọc Ngân i TÓM TẮT Trong năm gần đây, GMO trở thành vấn đề gây tranh cãi nhà khoa học giới lợi ích to lớn mà đem lại rủi ro chƣa đƣợc xác định rõ Do đó, cần có quy chế việc kiểm sốt thực trạng GMO Việt Nam bao gồm vận chuyển, sản xuất dán nhãn GMO Mục đích nghiên cứu xây dựng đƣợc quy trình phát bắp chuyển gen kỹ thuật Multiplex PCR với cặp mồi 35S Invertase bắp lƣơng thực phổ biến giới Việt Nam Quy trình Multiplex PCR thích hợp đƣợc đề xuất sau tối ƣu hóa cách thay đổi nồng độ mồi, Mg2+ chu trình nhiệt Quy trình gồm có Mg2+ với nồng độ mM, nồng độ mồi IVR – F; IVR – R; 35S – F; 35S – R lần lƣợt 0,13; 0,13; 0,33; 0,33 µM Chu trình nhiệt phản ứng nhƣ sau: tiền biến tính 95oC phút; biến tính 95oC 30 giây; bắt cặp 54oC 30 giây; kéo dài 72oC 20 giây Giai đoạn kéo dài cuối 72oC phút Quy trình Multiplex PCR tối ƣu hóa đƣợc áp dụng thử số mẫu thực phẩm Kết cho thấy phƣơng pháp Multiplex PCR dùng cho việc phát gene Invertase 35S mẫu thực phẩm có chứa thành phần từ bắp ii SUMMARY Recently, GMO is a controversial problem in the world because of its advantages for human and potential risks which cannot be determined So, Vietnam needs a legal basis for importation, processing and labeling instructions for GMO in the near future The purpose of this study is to design a protocol for detection of genetically modified maize by Multiple PCR method using primer pairs which were specific to Invertase gene and 35S gene because maize is the major cereal in all over the world and Vietnam The suitable multiplex PCR protocol was established after optimizing by changing concentration of primer, Mg2+ and cycling conditions This protocol was Mg2+ mM, concentration of primer IVR – F; IVR – R; 35S – F; 35S – R were 0.13; 0.13; 0.33; 0.33 µM The conditions of Multiplex PCR protocol were initial denaturation at 95˚C for min, followed by 35 cycles of amplification at 95˚C for 30 seconds, 54˚C for 30 seconds, 72˚C for 20 seconds and the final extension at 72˚C for Moreover, this protocol was applied to some of food samples As the result, the Multiplex PCR detected the Invertase gene and 35S gene from food samples containing maize Keyword: GM maize, Invertase, 35S, PCR, food iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan sinh vật chuyển gen (GMO) 2.1.1 Định nghĩa GMO 2.1.2 Quá trình tạo GMO 2.1.3 Promoter CaMV 35S 2.1.4 Các hƣớng tạo giống trồng chuyển gen 2.1.4.1 Chuyển gen kháng sâu 2.1.4.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 2.1.4.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh 2.1.4.4 Chuyển gen tạo sản xuất protein động vật 2.1.4.5 Chuyển gen thay đổi hàm lƣợng, chất lƣợng chất dinh dƣỡng 2.1.5 Lợi ích từ trồng chuyển gen 2.1.6 Những nguy tiềm ẩn chuyển gen iv 2.2 Sơ lƣợc bắp 2.3 Tình hình sản xuất bắp chuyển gen ngồi nƣớc Phƣơng pháp PCR phát bắp chuyển gen 10 2.3.1 Giới thiệu chung 10 2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 10 2.3.3 Các thành phần phản ứng PCR 11 2.3.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR để phát bắp chuyển gen 13 2.4 Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đốn bắp chuyển gen ngồi nƣớc 14 2.3.1 Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đốn bắp chuyển gen ngồi nƣớc 14 2.3.2 Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đốn bắp chuyển gen nƣớc 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu 16 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phƣơng pháp ly trích DNA 18 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra diện trình tự 35S, Invertase mẫu 19 3.3.2.1 Thí nghiệm Khảo sát khả hoạt động mồi 19 3.3.2.2 Thí nghiệm Khảo sát nồng độ mồi Invertase 20 3.3.2.3 Thí nghiệm Khảo sát nồng độ Mg2+ 21 3.3.2.4 Thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu 21 3.3.2.5 Thí nghiệm Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR 22 3.3.2.6 Thí nghiệm Khảo sát độ đặc hiệu mồi 22 3.3.2.7 Thí nghiệm Áp dụng thử quy trình PCR mẫu thực phẩm 22 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết ly trích DNA 23 4.2 Kết thí nghiệm Khảo sát khả hoạt động mồi 24 v 4.3 Kết thí nghiệm Khảo sát nồng độ mồi Invertase 25 4.4 Kết thí nghiệm Khảo sát nồng độ Mg2+ 26 4.5 Kết thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu 27 4.6 Kết thí nghiệm Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR 28 4.7 Kết thí nghiệm Khảo sát độ đặc hiệu mồi 29 4.7 Kết thí nghiệm Áp dụng thử quy trình PCR mẫu thực phẩm 30 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 35S Promoter 35S AMV Alfa mosaic virus Bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin Bt Bacillus thuringiensis CaMV Cauliflower mosaic virus CMV Cucumber mosaic virus CTAB Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide CTV Citrus tristeze virus DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxy nucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EU European Union F Forward FAO Food and Agriculture Organization GMO Genetically modified organism PCR Polymerase Chain Reaction PLRV Potato leafroll virus PRSV Papaya ringspot virus R Reverse RNA Ribonucleic acid TBE Tris, Borate, EDTA U Unit UV Ultra violet V Volume vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các mẫu sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 3.3 Các hóa chất sử dụng ly trích 17 Bảng 3.4 Các mồi sử dụng phản ứng Multiplex PCR 18 Bảng 3.5 Các hóa chất sử dụng phản ứng PCR 18 Bảng 3.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thí nghiệm 19 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm 20 Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm 20 Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thí nghiệm 21 Bảng 3.10 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm 21 Bảng 3.11 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm 22 Bảng 3.12 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thí nghiệm 22 viii Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm Thành phần Nồng độ sử dụng Buffer (X) Mg2+ (mM) Mồi F (µM) 0,33 Mồi R (µM) 0,33 dNTP (µM) 0,25 Taq polymerase (U) 1,5 DNA mẫu (ng) 10 - 50 Thêm nƣớc DEPC để thể tích phản ứng 30 µl 3.3.2.2 Thí nghiệm Khảo sát nồng độ mồi Invertase Tiến hành thực phản ứng PCR với nồng độ mồi Invertase khác thành phần phản ứng khác đƣợc giữ nguyên để tìm đƣợc nồng độ thích hợp cho phản ứng Multiplex PCR sử dụng mồi Invertase 35S Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm Thành phần NT NT NT NT Buffer (X) 1 1 Mg2+ (mM) 2 2 35S – F (µM) 0,33 0,33 0,33 0,33 35S – R (µM) 0,33 0,33 0,33 0,33 IVR – F (µM) 0,33 0,2 0,13 0,1 IVR – R (µM) 0,33 0,2 0,13 0,1 dNTP (µM) 0,25 0,25 0,25 0,25 Taq (U) 1,5 1,5 1,5 1,5 10 – 50 10 – 50 10 – 50 10 – 50 DNA (ng) Thêm nƣớc DEPC để đạt tổng thể tích phản ứng 30 µl NT: nghiệm thức Nhiệt độ bắt cặp phản ứng PCR thí nghiệm 54oC, đƣợc chọn dựa nhiệt độ nóng chảy mồi 35S 58oC Các giai đoạn khác đƣợc giữ nguyên nhƣ thí nghiệm khảo sát khả hoạt động mồi 20 Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thí nghiệm Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 95oC phút Biến tính 95oC 30 giây Bắt cặp 54oC 30 giây Kéo dài 72oC 20 giây Kéo dài cuối 72oC phút 35 3.3.2.3 Thí nghiệm Khảo sát nồng độ Mg2+ Áp dụng quy trình PCR với chu trình nhiệt giống với bảng 3.9 mẫu chứng dƣơng, nồng độ mồi đƣợc chọn từ thí nghiệm thay đổi lần lƣợt nồng độ Mg2+ theo hƣớng tăng dần, thấp 1,33 mM cao 2,33 mM Bảng 3.10 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm Thành phần NT NT NT NT Buffer (X) 1 1 Mg2+ (mM) 1,33 1,67 2,33 35S – F (µM) 0,33 0,33 0,33 0,33 35S – R (µM) 0,33 0,33 0,33 0,33 IVR – F (µM) 0,13 0,13 0,13 0,13 IVR – R (µM) 0,13 0,13 0,13 0,13 dNTP (µM) 0,2 0,2 0,2 0,2 Taq (U) 1,5 1,5 1,5 1,5 10 – 50 10 – 50 10 – 50 10 – 50 DNA (ng) Thêm nƣớc DEPC để đạt tổng thể tích phản ứng 30 µl NT: nghiệm thức 3.3.2.4 Thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu Sau chọn đƣợc nồng độ thích hợp từ thí nghiệm 3, bắt đầu tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu cho phản ứng cách thực phản ứng Multiplex với nhiệt độ bắt cặp theo gradient nhiệt độ từ 52oC đến 62oC mẫu chứng dƣơng Thành phần phản ứng đƣợc thể bảng sau: 21 Bảng 3.11 Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm Thành phần Nồng độ sử dụng Buffer (X) Mg2+ (mM) 35S – F (µM) 0,33 35S – R (µM) 0,33 IVR – F (µM) 0,13 IVR – R (µM) 0,13 dNTP (µM) 0,25 Taq polymerase (U) 1,5 DNA mẫu (ng) 10 – 50 Thêm nƣớc DEPC để đạt tổng thể tích phản ứng 30 µl Bảng 3.12 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR thí nghiệm Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Tiền biến tính 95oC phút Biến tính 95oC 30 giây Bắt cặp Từ 52oC đến 62oC 30 giây Kéo dài 72oC 20 giây Kéo dài cuối 72oC phút 35 3.3.2.5 Thí nghiệm Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR Khảo sát phản ứng PCR với thành phần phản ứng giống bảng 3.11 chu trình nhiệt đƣợc lựa chọn từ thí nghiệm thực phản ứng chu kỳ khác 30, 35, 40 45 mẫu chứng dƣơng 3.3.2.6 Thí nghiệm Khảo sát độ đặc hiệu mồi Sử dụng quy trình với thành phần phản ứng chu trình nhiệt tối ƣu từ thí nghiệm 2, 3, 4, mẫu gạo, hành, cà rốt, cá, heo, bò, gà 3.3.2.7 Thí nghiệm Áp dụng thử quy trình PCR mẫu thực phẩm Sau hồn chỉnh quy trình cho phản ứng PCR phát bắp chuyển gen, áp dụng thử nghiệm mẫu thực phẩm bắp rang, thức ăn dinh dƣỡng bột bắp 22 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết ly trích DNA DNA tổng Hình 4.1 Kết điện di DNA ly trích từ mẫu tƣơi Gel agarose 0,8%, hiệu điện 100V; (1), (2), (3) lần lập lại mẫu lá; (4), (5), (6) lần lập lại mẫu hạt 10 11 12 13 14 15 Hình 4.2 Kết điện di DNA ly trích từ mẫu thực phẩm Gel agarose 0,8%, hiệu điện 100V (1) đến (15) Mẫu B1 đến B15 23 Kết ly trích mẫu tƣơi với quy trình sử dụng CTAB cho thấy lần lập lại xuất DNA tổng số bị tạp nhiễm Từ kết luận quy trình ly trích ổn định, sử dụng mẫu lẫn mẫu hạt Tuy nhiên áp dụng quy trình CTAB với mẫu thực phẩm, không thu đƣợc DNA tổng số (kết thể hình 4.2) Điều mẫu thực phẩm qua trình chế biến dƣới tác nhân nhiệt độ tác nhân học khiến DNA bị đứt gãy Ngoài thành phần thực phẩm nhiều phụ gia khác nhƣ đƣờng, muối, dầu ăn Các thành phần gây ảnh hƣởng đến độ tinh sản phẩm 4.2 Kết thí nghiệm Khảo sát khả hoạt động mồi 500 bp 225 bp 190 bp 200 bp 100 bp 50 bp Hình 4.3 Kết khảo sát độ hoạt động mồi Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) Ladder 50 bp; (2) Sản phẩm PCR sử dụng mồi Invertase; (3) Sản phẩm PCR sử dụng mồi 35S Để khảo sát xem mồi có hoạt động tốt hay khơng, phản ứng single PCR với cặp mồi nhiệt độ bắt cặp 60oC đƣợc thực Theo quy trình PCR James (2003) nhiệt độ bắt cặp cho trình tự 35S 59oC nhiệt độ bắt cặp cho trình tự 24 Invertase 61oC, nhiệt độ 60oC đƣợc chọn để thực phản ứng chu trình nhiệt Cũng thí nghiệm James thực hiện, có xuất sản phẩm 35S với kích thƣớc lớn khơng mong đợi (485 bp), có thay đổi trình tự promoter 35S để phù hợp với trình chuyển gen mồi bắt cặp vị trí mạch Trình tự khuếch đại promoter 35S đƣợc giới hạn thông qua việc giới hạn thời gian kéo dài chu trình nhiệt Tăng thời gian kéo dài giúp khuếch đại đƣợc sản phẩm có kích thƣớc lớn Khi giảm thời gian kéo dài, sản phẩm có kích thƣớc nhỏ đƣợc khuếch đại tốt Vì vậy, từ thí nghiệm ban đầu, thời gian kéo dài chu trình nhiệt đƣợc chọn 20 giây nhằm khuếch đại sản phẩm 35S có kích thƣớc 190 bp Kết phản ứng xuất sản phẩm có kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc đƣợc khảo sát phần mềm AnnHyb Vậy cặp mồi hoạt động bình thƣờng, khuếch đại đƣợc trình tự mục tiêu Lƣợng sản phẩm cặp mồi Invertase khuếch đại đƣợc nhiều so với lƣợng sản phẩm mồi 35S khuếch đại Giả thiết đặt mồi Invertase hoạt động tốt có khả gây ức chế mồi 35S Đây sở để điều chỉnh nồng độ mồi thí nghiệm 4.3 Kết thí nghiệm Khảo sát nồng độ mồi Invertase Nhiệt độ nóng chảy chung mồi Invertase trung bình 63oC, cao so với nhiệt độ nóng chảy trung bình 35S 58oC Do đó, để kiểm tra giả thiết từ thí nghiệm 1, thí nghiệm đƣợc thực với phản ứng sử dụng nhiệt độ bắt cặp 54oC để làm giảm ức chế mồi Invertase mồi 35S Nồng độ mồi Invertase sử dụng thí nghiệm đƣợc giảm dần so với nồng độ mồi 35S thành phần phản ứng khác khơng thay đổi Từ hình 4.4 thấy rằng, nghiệm thức cho kết tốt (lƣợng sản phẩm Invertase tƣơng đƣơng với lƣợng sản phẩm 35S) Ở nghiệm thức này, nồng độ mồi Invertase thấp so với mồi 35S Ở nghiệm thức 2, nồng độ Invertase tăng dần, lƣợng sản phẩm 35S dần Từ thấy, giả thiết mồi Invertase hoạt động tốt ức chế mồi 35S điều kiện phản ứng Tuy nhiên, để thuận lợi trình thực phản ứng, nghiệm thức đƣợc chọn để thực thí nghiệm Vậy để khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng Multiplex PCR, gradient nhiệt độ đƣợc chọn dựa theo nhiệt độ nóng chảy mồi 35S 25 500 bp 225 bp 190 bp 200 bp 100 bp 50 bp Hình 4.4 Sản phẩm PCR nồng độ mồi khác Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) NT1; (2) NT2; (3) NT3; (4) NT4; (5) Ladder 50 bp 4.4 Kết thí nghiệm Khảo sát nồng độ Mg2+ Trƣớc khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng Multiplex PCR, cần khảo sát nồng độ Mg2+ ion ảnh hƣởng nhiều đến hoạt động Taq polymerase Ở phản ứng PCR thí nghiệm 2, sử dụng nồng độ Mg2+ mM nồng độ phù hợp với Taq polymerase phòng thí nghiệm Nhƣng để có quy trình tối ƣu nhất, tiến hành phản ứng Multiplex PCR nồng độ Mg2+ khác để tìm nồng độ thích hợp Theo lý thuyết, thiếu hụt ion Mg2+ làm giảm khả hoạt động Taq Điều phù hợp với kết từ hình 4.5, nồng độ Mg2+ giảm lƣợng sản phẩm giảm, đặc biệt sản phẩm 35S cạnh tranh mồi Invertase Lƣợng sản phẩm mồi tƣơng đƣơng nồng độ Mg2+ mM 2,33 mM Khơng có khác biệt nhiều kết PCR nồng độ mM 2,33 mM, nhiên chọn nồng độ Mg2+ mM nồng độ thấp 26 500 bp 225 bp 190 bp 200 bp 100 bp 50 bp Hình 4.5 Sản phẩm PCR nồng độ Mg2+ khác Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) Ladder 50 bp; (2) 1,33 mM; (3) 1,67 mM; (4) mM; (5) 2,33 mM 4.5 Kết thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu 10 11 12 500 bp 225 bp 190 bp 200 bp 100 bp 50 bp Hình 4.6 Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) Ladder 50 bp; (2) đến (12) Gradient nhiệt độ từ 52oC đến 62oC 27 Vì nhiệt độ nóng chảy mồi 35S 58oC nên chọn gradient nhiệt độ từ 52oC đến 62oC để thuận lợi cho hoạt động mồi 35S Nhiệt độ bắt cặp tối ƣu đƣợc thể qua hình 4.6 53oC 54oC, lƣợng sản phẩm mồi 35S tƣơng đƣơng với sản phẩm mồi Invertase Tuy nhiên, để có kết thống với thí nghiệm trên, nhiệt độ bắt cặp 54oC đƣợc chọn 4.6 Kết thí nghiệm Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR Từ quy trình PCR James (2003), phản ứng PCR thí nghiệm chạy 35 chu kỳ Tuy nhiên, mẫu có lƣợng DNA ban đầu thấp gây ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm PCR Khi tăng số chu kỳ phản ứng PCR, thời gian thực phản ứng kéo dài hơn, sử dụng nhiều thành phần phản ứng Nếu tăng số chu kỳ lên nhiều gây ảnh hƣởng ngƣợc lại, cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất sản phẩm phụ gây ức chế sản phẩm q trình PCR Cần trì số chu kỳ vừa phải để thu đƣợc lƣợng sản phẩm tối đa tiết kiệm thời gian thực phản ứng Để tăng lƣợng sản phẩm PCR mẫu có nồng độ DNA ly trích thấp, đặc biệt mẫu thực phẩm, tiến hành thí nghiệm khảo sát số chu kỳ cho phản ứng lần lƣợt 30, 35, 40 45 chu kỳ Phản ứng đƣợc thực với thành phần chu trình nhiệt nhƣ chọn từ thí nghiệm 4 500 bp 225 bp 190 bp 200 bp 100 bp 50 bp Hình 4.7 Kết khảo sát số chu kỳ Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) 30 chu kỳ; (2) 35 chu kỳ; (3) 40 chu kỳ; (4) 45 chu kỳ; (5) Ladder 50 bp 28 Ở 30 chu kỳ lƣợng sản phẩm 35S tƣợng dimer xảy nhiều Càng tăng số chu kỳ tƣợng dimer giảm Tuy nhiên sản phẩm PCR 35, 40 45 chu kỳ khơng có khác biệt nhiều nên chọn quy trình PCR với chu trình nhiệt 35 chu kỳ để tiết kiệm thời gian chạy phản ứng Kết nghiên cứu cho thấy số chu kỳ đƣợc chọn giống với số chu kỳ mà James (2003) sử dụng Một số nghiên cứu khác nhƣ Lipp (1999), Heo (2004) sử dụng quy trình PCR 40 chu kỳ nhƣng nghiên cứu này, từ 35 chu kỳ trở lên số chu kỳ khơng ảnh hƣởng nhiều đến lƣợng sản phẩm PCR Vậy, lựa chọn quy trình Multiplex PCR 35 chu kỳ thích hợp 4.7 Kết thí nghiệm Khảo sát độ đặc hiệu mồi Để khảo sát độ đặc hiệu mồi, tiến hành phản ứng Multiplex PCR với nồng độ thành phần chu trình nhiệt theo kết thí nghiệm số mẫu có khả đƣợc sử dụng chung với bắp trình sản xuất thực phẩm 10 500 bp 100 bp 50 bp Hình 4.8 Kết khảo sát độ đặc hiệu mồi Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) Gạo; (2) Hành; (3) Cà rốt; (4) Cá; (5) Heo; (6) Bò; (7) Gà; (8) Ladder 50 bp; (9) Đối chứng dương Invertase; (10) Đối chứng dương 35S Nếu hoạt động không đặc hiệu, phản ứng PCR bị tƣợng dƣơng tính giả mồi bắt cặp trình tự khác khơng phải trình tự đích khuếch đại đoạn có kích thƣớc 225 bp 190 bp Từ kết thấy mẫu hành, cà rốt, heo gà hồn tồn khơng có sản phẩm PCR Mẫu cá bò có sản phẩm với kích thƣớc lớn, khơng với kích thƣớc Invertase 35S Riêng mẫu gạo có sản phẩm gần kích thƣớc Invertase, nhiên sản phẩm nằm khoảng từ 200 bp đến 225 bp, thấp so với Invertase Từ kết luận trình tự mồi cho 29 Invertase 35S đặc hiệu Vậy, quy trình Multiplex PCR đƣợc sử dụng để phát bắp chuyển gen với DNA mẫu đƣợc ly trích từ mẫu thực phẩm 4.7 Kết thí nghiệm Áp dụng thử quy trình PCR mẫu thực phẩm Sau chọn đƣợc thành phần phản ứng chu trình nhiệt tối ƣu, áp dụng quy trình PCR mẫu thực phẩm mẫu thực phẩm đƣợc chọn từ 17 mẫu đƣợc ly trích theo tiêu chí đại diện cho quy trình xử lý - Xử lý nhiệt: bắp rang bơ - Xử lý học: bột bắp - Mẫu có nhiều dầu: thực phẩm dinh dƣỡng 500 bp 225 bp 190 bp 100 bp 50 bp Hình 4.9 Kết áp dụng quy trình PCR mẫu thực phẩm Gel agarose 3%, hiệu điện 100V (1) Đối chứng dương; (2) Ladder 50 bp; (3) Mẫu B1; (4) Mẫu B14; (5) Mẫu B15 Từ kết thấy đƣợc quy trình PCR ứng dụng mẫu thực phẩm có xuất sản phẩm khuếch đại Invertase 35S dù lƣợng sản phẩm không nhiều Riêng mẫu B15 có sản phẩm mồi 35S Acid nucleic CaMV RNA, để hình thành đƣợc sản phẩm PCR cần trải qua giai đoạn phiên mã ngƣợc với điều kiện cần thiết Một phản ứng PCR thông thƣờng không khuếch đại đƣợc sản phẩm với nguồn mẫu RNA Ngoài ra, promoter 35S nguyên hoạt động chƣa tốt thực vật mầm, đặc biệt ngũ 30 cốc, đó, trƣớc sử dụng để chuyển gen, ngƣời ta thƣờng biến đổi trình tự 35S thêm vào đoạn enhancer để đạt hiệu chuyển gen cao Vậy xuất sản phẩm 35S, kết luận đƣợc sản phẩm có chứa bắp chuyển gen mà khơng phải bị xâm nhiễm CaMV Tuy nhiên, cần thực phản ứng PCR dùng mồi 35S mẫu CaMV để có kết luận xác Đối với mẫu âm tính 35S, chƣa thể kết luận mẫu khơng chứa bắp chuyển gen Theo GS.TS Phạm Thị Anh Thƣ, 95% trồng chuyển gen có mặt promoter 35S nhƣng lƣợng lớn promoter khác đƣợc sử dụng trình chuyển gen thực vật Mẫu âm tính có khả đƣợc chuyển gen nhƣng dùng promoter khác để biểu gen mà 35S Để tránh tƣợng này, nhiều nghiên cứu giới đƣợc thực với mục đích xây dựng quy trình Multiplex PCR có sử dụng mồi cho trình tự terminator NOS kết hợp với 35S Invertase Đây điểm chƣa hồn thiện so với quy trình Multiplex PCR đƣợc thực Lipp (1999), James (2003) Mendoza (2006) Các nghiên cứu Hồ Bích Liên (2003), Nguyễn Hữu Trƣởng (2005) Bùi Văn Hiệu (2008) sử dụng phƣơng pháp PCR phát bắp chuyển gen cách sử dụng mồi 35S nhƣng chƣa đƣa đƣợc phƣơng pháp giải tƣợng âm tính giả thiếu đối chứng nội kiểm soát phản ứng Khi phản ứng khơng có xuất sản phẩm khuếch đại 35S gen chuyển chƣa thể kết luận đƣợc mẫu âm tính có sai sót q trình thực phản ứng Sự phát triển đề tài so với nghiên cứu trƣớc nƣớc có sử dụng mồi Invertase làm đối chứng nội Sự xuất sản phẩm Invertase chứng tỏ phản ứng PCR không bị ức chế nên hạn chế đƣợc tƣợng âm tính giả 31 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tối ƣu đƣợc thành phần phản ứng Multiplex PCR phát bắp chuyển gen với nồng độ Mg2+ mM, nồng độ mồi IVR – F; IVR – R; 35S – F; 35S – R lần lƣợt 0,13; 0,13; 0,33; 0,33 µM Chu trình nhiệt phản ứng nhƣ sau: tiền biến tính 95oC phút; biến tính 95oC 30 giây; bắt cặp 54oC 30 giây; kéo dài 72oC 20 giây Giai đoạn kéo dài cuối 72oC phút Quy trình PCR ứng dụng mẫu thực phẩm Mẫu bột bắp thực nghiệm có chứa phần bắp chuyển gen 5.2 Đề nghị Cần giải trình tự sản phẩm PCR mẫu gạo để xác định xác độ đặc hiệu mồi Invertase 35S Thực phản ứng Multiplex PCR nguồn mẫu RNA CaMV Xây dựng quy trình Multiplex PCR sử dụng mồi cho trình tự 35S, NOS đối chứng nội Invertase để tránh tƣợng âm tính giả Tăng lƣợng mẫu q trình ly trích thực phẩm để sản phẩm PCR đạt kết tốt Khảo sát độ nhạy quy trình PCR mẫu có nồng độ DNA thấp Khảo sát mẫu thực phẩm có chứa bắp địa bàn TPHCM 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bernard R Glick Jack J Pasternak 2007 Cải biến gen thực vật: Phƣơng pháp luận Sinh học phân tử: nguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hồ Bích Liên 2003 Tổng quan tài liệu Xây dựng phương pháp chuẩn đoán bắp chuyển gen nghiên cứu trạng sản phẩm bắp chuyển gen nhập vào Việt Nam Luận văn tốt nghiệp khoa Nông học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TPHCM Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng 2008 Phƣơng pháp PCR Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Lê Trần Bình 2008 Tổng quan tình hình nghiên cứu nƣớc Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Hữu Trƣởng 2005 Tổng quan tài liệu Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen phương pháp Real-time PCR Luận văn tốt nghiệp, ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm TPHCM Nguyễn Văn Mùi 2009 Cơng nghệ Sinh học An tồn Thực phẩm An toàn sinh học Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Phạm Hùng Vân 1996 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đại cách mạng sinh học phân tử Tạp chí y học 1996 – 1997 Trần Thị Lệ 2007 Sản xuất, xác nhận độ bền vững trồng chuyển gen Giáo trình Cơng nghệ gen Nông nghiệp Nhà xuất Nông nghiệp Tài liệu tiếng Anh: Chieuh Lin – Ching 2002 Study on the detection method of six varieties of genetically modified maize and processed foods Journal of Food and Drug Analysis, 10: 25 – 33 10 Heo 2004 Detection of genetically modified maize by Multiplex PCR method Journal of Microbiology and Biotechnology 14: 1150 – 1156 33 11 James Delano 2003 Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by Multiplex PCR analysis Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 5829 – 5834 12 Lipp Markus 1999 IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder Journal of AOAC International 82: 923 – 928 13 Mendoza A 2006 Detection of genetically modified maize food products by the polymerase chain reaction Ciencia y Tecnología Alimentaria 5: 175 – 181 14 Randhawa Gurinder Jit and Firke P K 2006 Detection of transgenes in genetically modified soybean and maize using polymerase chain reaction Indian journal of Biotechnology 5: 510 – 513 15 Shrestha Hari Kumar 2010 Detection of genetically modified maize (Zea mays L.) in seed samples from Nepal African Journal of Biotechnology 9: 5581 – 5589 16 Lin Hsu – Yang 2000 Detection of genetically modified soybeans and maize by the polymerase chain reaction method Journal of food and drug analysis 8: 200 – 207 Tài liệu Internet: 17 Clive James, 2012 2012 ISAAA Report on Global status of Biotech/GM Crops (Truy cập ngày 19 – – 2012) http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/43/pptslides/default.asp 18 FAO, 2002 Biotechnology in food and agriculture: Conference (Truy cập ngày 19 – – 2012) http://www.fao.org/biotech/C7doc.htm 19 Ngân hàng kiến thức trồng ngô, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (Truy cập ngày 19 – – 2012) http://ngo.vaas.org.vn/sanxuatngotrenthegioivavietnam.php 20 http://www.biokurs.de (Truy cập ngày 19 – – 2012) 21 http://www.my.opera.com (Truy cập ngày 19 – – 2012) 22 http://www.biocadmin.otago.ac.nz (Truy cập ngày 19 – – 2012) 23 http://www.en.wikipedia.org (Truy cập ngày 19 – – 2012) 34