Xây dựng quy trình nhân giống hoa hồng nhung bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== NGƠ THỊ QUỲNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG NHUNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI - 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== NGƠ THỊ QUỲNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG NHUNG BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học TS LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh – KTNN tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân xin gửi lời cảm ơn Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, góp ý kiến cho tơi q trình học tập hồn thành đề tài Trong q trình nghiên cứu khoa học khơng thể tránh khỏi thiếu sót Kính mong đóng góp ý kiến thầy, bạn đọc Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên NGÔ THỊ QUỲNH LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi thực hướng dẫn TS La Việt Hồng Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên NGÔ THỊ QUỲNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.1.1 Nguồn gốc 1.1.1.2 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Điều kiện sinh thái 1.2 Tình hình sản xuất hoa hồng giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình sản xuất hoa hồng giới 1.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa hồng Việt Nam 1.3 Giá trị hoa hồng 1.3.1 Giá trị sử dụng hoa hồng 1.3.2 Giá trị kinh tế hoa hồng 10 1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống hoa hồng nuôi cấy mô giới Việt Nam 10 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 12 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 14 2.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 14 2.3.1 Thiết bị 14 2.3.2 Dụng cụ 14 2.4 Môi trường nuôi cấy 14 2.5 Điều kiện phòng ni cấy 15 2.6 Phương pháp nghiên cứu 15 2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 15 2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 18 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19 3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 21 3.3 Tạo in vitro hoàn chỉnh 29 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi điều kiện tự nhiên 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 Kết luận 32 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT BA Benzyl adenine C Than CS Cộng CT Công thức ĐC Đối chứng LSD0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS Murashige and Skoog NAA – naphthalene acetic acid NXB Nhà xuất TB Trung bình DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Cơng thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu 15 Bảng 2.2 Cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng sucrose agar đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro 17 Bảng 3.1 Kết tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cho nuôi cấy in vitro giống hoa hồng Nhung 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi in vitro giống hoa hồng Nhung (sau tuần) 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng agar, sucrose đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro 24 Bảng 3.4 Ảnh hưởng than hoạt tính đến đến q trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro 27 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến trình rễ - tạo hoa hồng in vitro hoàn chỉnh 29 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Quy trình tạo vật liệu khởi đầu cho nhân giống in vitro giống hoa hồng Nhung 21 Hình 3.2 Kết tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng sau 14 ngày 23 Hình 3.3 Ảnh hưởng agar, sucrose đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro 26 Hình 3.4 Ảnh hưởng than hoạt tính đến đến q trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro 28 Hình 3.5 Ảnh hưởng NAA đến trình rễ - tạo hoa hồng in vitro hoàn chỉnh 30 Hình 3.6 Rèn luyện hoa hồng cấy mơ thích nghi với điều kiện tự nhiên 31 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hình 3.2 Kết tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa hồng sau 14 ngày a, b, c, d: đốt thân cấy môi trường MS0, MS0+BA 0,5, MS0+BA 1,0, MS0+BA 1,5 b Ảnh hưởng sucrose agar đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Các chồi tái sinh đem cắt thành đoạn dài ÷ cm cấy mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 20 ÷ 30 g/l sucrose kết hợp với 3,5 ÷ g/l agar bổ sung mg/l BA Sau tuần nuôi cấy, chúng tơi nhận thấy chồi in vitro có phản ứng khác môi trường Kết thu bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng agar, sucrose đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro C ô n g M S C , S h S ố S i ố a A c c g h ề l c a u2 á3 , , , , 3 , , 3 , , , , , , 00 , , , , , 0 , Với thí nghiệm, cột chữ a,b,c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 Trong nghiên cứu này, việc bổ sung agar với nồng độ khác có ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng chồi tái sinh tiêu số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số lá/mẫu Công thức MS chứa 1,0 mg/l BA, 25 g/l sucrose 3,5 g/l agar cho kết nhân nhanh chồi tốt nhất, thể qua tiêu số chồi/mẫu đạt 3,80, chiều cao chồi đạt 1,70 cm số lá/chồi đạt 4,20 Công thức MS chứa 1,0 mg/l BA, 30 g/l sucrose 5,0 g/l agar cho kết nhân nhanh chồi thấp nhất, thể qua tiêu số chồi/mẫu đạt 2,20, chiều cao chồi đạt 1,34 cm số lá/chồi đạt 3,00 24 Với công thức MS bổ sung g/l agar kết hợp với 20 - 30 g/l sucrose (CT4 - 6) số chồi/mẫu giảm dần từ 3,0 chồi/mẫu (20 g/l sucrose) xuống 2,8 chồi/mẫu (25 g/l sucrose) 2,2 chồi/mẫu (30 g/l sucrose) Đối với công thức MS bổ sung g/l agar kết hợp với 20 - 30 g/l sucrose (CT - 9) số chồi/mẫu tăng lên từ 2,6 chồi/mẫu (20 g/l sucrose) đến 2,8 chồi/mẫu (25 g/l sucrose) 3,4 chồi/mẫu (30 g/l sucrose) nhiên chiều cao chồi số lá/mẫu lại giảm dần với chiều cao chồi giảm từ 1,38 cm (20 g/l sucrose) xuống 1,14 cm (25 30 g/l sucrose), số lá/mẫu giảm từ 3,4 lá/mẫu (20 g/l sucrose) xuống 3,2 lá/mẫu (25 g/l sucrose) 2,6 lá/mẫu (30 g/l sucrose) (bảng 3.3, hình 3.3) 25 Hình 3.3 Ảnh hưởng agar, sucrose đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro a-c: tương ứng với CT 1-3 (môi trường chứa 20, 25 30 g/l saccarozơ + 3,5 g/l agar) d-f: tương ứng với CT 4-6 (môi trường chứa 20, 25 30 g/l saccarozơ + 5,0 g/l agar) g-i: tương ứng với CT 7-9 (môi trường chứa 20, 25 30 g/l saccarozơ + 7,0 g/l agar) Như vậy, môi trường bán lỏng (lượng agar 3,5 g/l) phù hợp với giai đoạn nhân nhanh chồi hoa hồng Nhung Điều giải thích mẫu dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng mơi trường bán lỏng [12] c Ảnh hưởng than hoạt tính đến trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Theo số nghiên cứu, việc bổ sung than hoạt tính có tác dụng tăng sinh trưởng mẫu hoa hồng ni cấy mơ [12, 15] chúng tơi bổ sung than hoạt tính vào mơi trường nhân nhanh với nồng độ 0,1 ÷ 0,4 mg/l than hoạt tính cho thấy phản ứng chồi hoa hồng khác công thức thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng than hoạt tính đến đến q trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro C ô n M S C S Cô ố h B ố A h c i o 1/ , , , , , , , , , , , , L 0 , , Với thí nghiệm, cột chữ a,b,c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 Kết cho thấy bổ sung than hoạt tính vào mơi trường nuôi cấy làm cho chồi hoa hồng tăng lên chiều cao Công thức bổ sung 0,1 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 1,9 cm, cơng thức bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 2,7 cm, công thức bổ sung 0,3 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 1,84 cm, cơng thức bổ sung 0,4 mg/l than hoạt tính chiều cao đạt 1,9 cm cao so với công thức tương tự (MS + 3,5 g/l agar + 25 g/l sucrose + 1mg/l 27 BA) khơng bổ sung than hoạt tính (1,7 cm) (bảng 3.3, bảng 3.4) Trong cơng thức bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính) cho chiều cao chồi lớn (đạt 2,70 cm), số đạt 5,2 lá/mẫu, cơng thức bổ sung 0,3 mg/l than hoạt tính cho chiều cao chồi thấp 1,84 cm, số đạt 4,0 lá/mẫu (bảng 3.4, hình 3.4) Tóm lại, mơi trường MS bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose, 1,0 mg/l BA bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính môi trường tốt cho tăng chiều cao chồi hoa hồng in vitro Hình 3.4 Ảnh hưởng than hoạt tính đến đến q trình nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro a,b,c,d: tương ứng với CT 1, 2, 3, 3.3 Ra rễ - tạo in vitro hoàn chỉnh Chồi in vitro cứng cáp ni cấy mơi trường ½ MS có bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose có bổ sung NAA với nồng độ khác (0 ÷ 1,0 mg/l) để hình thành rễ cho thấy tỷ lệ rễ, số rễ/chồi chiều dài rễ công thức khác khác Kết thu bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến trình rễ - tạo hoa hồng in vitro hồn chỉnh C n T S C Aỷ ố h i A l r 0, 0, 0 4, 6 1, 0, 0, Với thí nghiệm, cột chữ a,b,c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 Hầu hết chồi hoa hồng ni cấy mơ có khả rễ cơng thức có bổ sung NAA (0,25; 0,50 0,75 mg/l), ngoại trừ CT (NAA 1,0 mg/l), Trong đó, CT cho tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 67,50%; CT cho số rễ/chồi tốt nhất; đạt 4,62; CT cho chiều dài rễ tốt nhất; đạt 4,75 (hình 3.5 bảng 3.5) Theo nghiên cứu số nhà khoa học khác Naphaporn NakUdom cs., (2009) cho thấy môi trường thích hợp cho rễ hoa hồng Rosa hybrid L cv “Perfume Delight” ¼ MS khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho tỷ lệ hình thành rễ 70,05% Trong nghiên cứu Bùi Thị Thu Hương cs., (2017), cho mơi trường ¼ MS mơi trường thích hợp cho rễ giống hoa hồng cổ Sapa (Rosa gallica L.) với 29 tỷ lệ rễ đạt 98,89% sau tuần nuôi cấy Theo Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), hình thành rễ hoa hồng đạt hiệu tốt môi trường chứa mg/l NAA mg/l IBA cho tỷ lệ rễ 60% Như vậy, mơi trường thích hợp cho rễ hoa hồng Nhung ½ MS, agar 3,5 g/l, 25 g/l đường saccarozơ NAA 0,5 mg/l Hình 3.5 Ảnh hưởng NAA đến trình rễ - tạo hoa hồng in vitro hoàn chỉnh a Ra rễ CT (NAA 0,25), b Ra rễ CT (NAA 0, 50), c Ra rễ CT (NAA 0,75) 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi điều kiện tự nhiên Trong nghiên cứu này, in vitro trồng lên giá thể khác nhau, che đậy túi nilon (hình 3.5a), sau ngày bắt đầu mở dần túi nilon cho thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Kết cho thấy tỷ lệ sống sót sau 14 ngày rèn luyện đạt 66,2; 60,0 75,5 (%) tương ứng với giá thể đất + trấu hun (1:1), đất phù sa giá thể TS1 (hình 3.5 b, c, d) Đồng thời in vitro giá thể TS1 có màu xanh đậm, phát triển nhanh, giá thể đất + trấu hun (1:1) có màu xanh nhạt, phát triển chậm, còi cọc, giá thể đất phù sa có màu xanh nhạt hơn, phát triển chậm Ở giống hồng khác nhau, tỷ lệ sống sót cho giai đoạn rèn luyện giá thể khác Cụ thể theo kết nghiên cứu Saklani Kumud cs., (2015), giá thể rèn luyện chứa cát đất vườn với tỷ lệ 1:1 cho thấy tỷ lệ sống sót chồi hoa hồng in vitro cao đạt 60% Như vậy, giá thể TS1 giá thể phù hợp cho rèn luyện hoa hồng Nhung in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Hình 3.6 Rèn luyện hoa hồng cấy mơ thích nghi với điều kiện tự nhiên a, b, c: rèn luyện giá thể đất+trấu hun (1:1), đất phù sa, giá thể TS1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 32 - Chất khử trùng thích hợp cho đốt thân hoa hồng Nhung khử trùng bề mặt cồn 70% 10 phút, xử lý tiếp dung dịch javen 5% phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt 86,95% - Môi trường phù hợp để tái sinh chồi in vitro từ đốt thân hoa Hồng nhung MS, 30 g/l sucrose, 7g/l agar, mg/l BA, chồi tái sinh có màu xanh đậm, phát triển nhanh - Mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro MS, 1,0 mg/l BA, 25 g/l sucrose 3,5 g/l agar (pH 5,8), bổ sung 0,2 mg/l than hoạt tính thể qua tiêu số chồi/mẫu đạt 3,60; chiều cao chồi đạt 2,70 cm số lá/chồi đạt 5,20 - Mơi trường ½ MS, 25 g/l saccarozơ 3,5 g/l agar, bổ sung NAA (0,5 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, tỷ lệ hình thành rễ cao nhất, đạt 67,50% - Cây trồng giá thể hỗn hợp TS cho tỷ lệ sống sót cao 75,5 (%) sau tuần rèn luyện Kiến nghị - Thực nghiên cứu đánh giá sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro đưa vườn ươm 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 34 Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương (2006), Kỹ thuật giâm, chiết, ghép hoa hồng, NXB Thành phố Hồ Chí Minh, 36 trang Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Nguyễn Quang Thạch (2002), Cây hoa hồng Kỹ thuật trồng, NXB Lao động xã hội Đồng Huy Giới, Dương Thị Mến (2017), “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano ni cấy mơ hoa hồng cổ Sapa”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, (78): 59 – 65 Bùi Thị Thu Hương, Đồng Huy Giới, Nguyễn Thị Trang, Hồ Thị Quyên (2017), “Nhân nuôi Hồng cổ Sapa (Rosa gallica L.) kỹ thuật ni cấy mơ invitro”, Hội nghị khoa học tồn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 7, trang 1229 – 1235 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Mai Thị Ngoan (2009), “Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển số giống hoa Hồng (Rosa indica L.) nhập nội ảnh hưởng biện pháp cắt tỉa, xử lý chế phẩm đến suất chất lượng hoa Hồng VR41 Gia Lâm – Hà Nội”, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Nguyễn Quang Thạch (2000), “Trồng hoa xuất miền Bắc, hội thách thức”, Tạp chí Khoa học Tổ quốc, số 12 Nguyễn Thị Kim Thanh (2005), “Nhân giống hoa hồng kỹ thuật nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 1: 39 – 41 Nguyễn Thị Phương Thảo, Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Thu Hằng, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Lâm Hải, Nguyễn Thanh Hải (2015), “Nhân nhanh cảm ứng hoa invitro hoa hồng cơm (Rosa sericea Lindl.)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13 (4): 606 – 613 Tiếng nước 35 10 A A Asadi, C Vedadi, M, Rahimi, B Naserian (2009), “Effect of plant growth hormones on root and shoot regeneration in Rose (Morrasia) under in vitro conditions”, Bioscience Research, (1): 40 – 45 11 Dhawan V, Bhojwani SS, (1986), Micropropagation in crop plants, Glimpses Plant Res, 7:1 – 75 12 Kumud S, Hem1 P, Vijay R (2015), “Micropropagation of rose cultivars: biotechnological application to floriculture”, J Environ Res Develop, 10 (01), 40 – 46 13 Naphaporn Nak-Udom, Kantamaht Kanchanapoom, Kamnoon Kanchanapoom (2009), “Micropropagation from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrida L cv ‘Perfume Delight’)”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 (6): 583 – 586 14 Omidi M, Yadollahi A, Eftekhari M (2016), “Comparative study of Rosa damascenes Mill And R Gallica micro-propagation”, Biological Forum – An International Journal, (1): 135 -145 15 Pati P.K, Rath S.P, Sharma M, Sood A, Ahuja P.S (2006), In vitro propagation of rose – a review, Biotechnology Advances, 24: 94 – 114 16 Rashida S., Yasmin S and Aleem R (2003), “In vitro propagation of Rosa Indica”, Pakistan Journal of Biological Sciences, (9): 826 – 830 17 S K Senapati, G R Rout (2008), “Study of culture conditions for improved micropropagation of hybrid rose”, Hort Sci (Prague), 35 (1): 27 – 34 Tài liệu internet 18 https://www.vietnamplus.vn/ha-noi-phat-trien-thuong-hieu-hoa-hong-ganvoi-vung-dat-me-linh/291529.vnp 19 https://hoadepviet.com/cay-hoa-hong-nhung-hong-truyen-thong-cuanguoi-viet/ 20 https://nongnghiep.vn/benh-hai-cay-hoa-hong-bien-phap-phong-trupost62461.html 21 https://caytrongvatnuoi.com/cac-loai-hoa/san-xuat-hoa-o-viet-nam/ 22 https://caytrongvatnuoi.com/cac-loai-hoa/gia-tri-va-y-nghia-cua-hoahong/ 36 PHỤ LỤC Một số hình ảnh q trình ni cấy Đốt thân hoa hồng Nhung sau tuần nuôi cấy Chồi hoa hồng môi trường MS bổ sung 3,5 g/l agar, 25 g/l sucrose bổ sung mg/l BA (pH 5,8) ... chọn đề tài Xây dựng quy trình nhân giống hoa hồng Nhung kỹ thuật ni cấy mơ” Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu - Mục đích: Xây dựng quy trình nhân giống hoa hồng Nhung kỹ thuật nuôi cấy mô phục vụ... KHOA SINH – KTNN ====== NGƠ THỊ QUỲNH XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA HỒNG NHUNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa... điều kiện tự nhiên 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: + Kết đề tài góp phần xây dựng quy trình ni cấy in vitro nhân giống hoa hồng Nhung giống hoa hồng khác + Cung cấp tài liệu