Xây dựng quy trình nhân giống lan hoàng thảo ý ngọc (dendrobium transparens wall ex lindl ) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật (2017)

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒNG THẢO Ý NGỌC (Dendrobium transparens Wall ex Lindl.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MƠ THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học TS LA VIỆT HỒNG Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, anh Đào Văn Kiên- Học viên Cao học K18 giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phương tiện để tơi hồn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, góp ý cho tơi q trình học tập hồn thành đề tài Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa cơng bố Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: α- Napthlacetic acid KIN: Kinetin IBA: Indol 3- butyric acid IAA: - Indole- acetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu 4.Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Dendrobium 1.1.1.Vài nét chi Dendrobium 1.1.2 Vài nét lan Hoàng thảo ý ngọc 1.2 Đặc điểm sinh học lan 1.2.1 Hạt lan 1.2.2 Sự nảy mầm cộng sinh với nấm tự nhiên hạt lan 1.2.3 Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro hạt lan 1.3 Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium Việt Nam 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 14 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 14 2.3.1 Thiết bị 14 2.3.2 Dụng cụ 14 2.4 Môi trường nuôi cấy 14 2.5 Điều kiện nuôi cấy 15 2.6 Phương pháp nghiên cứu 15 2.6.1 Nhân nhanh protocorm phát triển chồi từ protocorm 15 2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro: 16 2.6.3 Ra rễ-tạo in vitro hoàn chỉnh: 16 2.6.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: 16 2.7 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 16 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nhân nhanh protocorm tạo chồi từ protocorm 18 3.1.1 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh protocorm 18 3.1.2 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tạo chồi từ protocorm 19 3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 21 3.2.1 Ảnh hưởng KIN lên khả nhân chồi 21 3.2.2 Ảnh hưởng BAP lên khả nhân chồi 22 3.2.3 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi 25 3.3 Tạo rễ - hình thành in vitro hồn chỉnh 26 3.3.1 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ 26 3.3.2 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ 27 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng kinetin đến khả nhân nhanh protocorm loài D transparens 18 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tạo chồi từ protocorm D transparens 19 Bảng 3.3 Ảnh hưởng KIN lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 21 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi D transparens sau tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 26 Bảng 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 27 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Protocorm phát sinh từ protocorm D transparens 18 Hình 3.2 Chồi phát sinh từ protocorm D transparens môi trường MS +10% ND 20 Hình 3.3 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 0,5 mg/l KIN 22 Hình 3.4 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS 23 Hình 3.5 Chồi in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 25 Hình 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 26 Hình 3.7 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro D transparens sau tuần nuôi cấy 28 Hình 3.8 D transparens in vitro rèn luyện tự nhiên 29 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài trồng giá thể xơ dừa miếng cắt nhỏ 1:1:1:1 Theo dõi sinh trưởng phát triển lan D transparens tuần sau in vitro Kết sau tuần bắt đầu hình thành rễ mới, tạo thêm chồi mới, tỉ lệ sống cao, đạt xấp xỉ 85% (Hình 3.8) Hình 3.8 D transparens in vitro rèn luyện ngồi tự nhiên (a,b) D transparens tuần tuổi, (c,d) D transparens tuần tuổi 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 35 Quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium transparens Wall ex Lindl xây dựng : Môi trường MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,3-0,5 mg/l Kinetin thích hợp cho q trình nhân nhanh protocorm Mơi trường MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 10% nước dừa (ND) thích hợp để tạo chồi in vitro từ protocorm Môi trường MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro với hệ số nhân cao 6,33 sau tuần nuôi cấy Môi trường MS, 30g/l saccharose 8g/l agar có bổ sung 0,3 mg/l IAA mơi trường tạo rễ tốt (số rễ/chồi 4,80; chiều dài rễ: 2,07cm) sau tuần Cây rèn luyện giá thể xơ dừa cho tỷ lệ sống sót cao đạt 85% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu rèn luyện lan D transparens giai đoạn sau in vitro loại giá thể khác để tm loại giá thể tối ưu, cho tỷ lệ sống sót cao 36 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng Việt 33 Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ Tp HCM Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang (2010), “ Ảnh hưởng giá thể trồng đến trình sinh trưởng lan Hoàng Thảo trúc đen (Dendrobium hancockii rolfe)”, Tạp chí khoa học phát triển, tập 9, số 6, trang 903-911 Nguyễn Hồng Lộc, Mai Văn Phơ (2000), “Điều tra sơ thành phần loài họ lan Thừa Thiên Huế bước đầu bảo tồn in vitro số lồi phân bố đây”, Tạp chí sinh học, tập 22, số 3, trang 173-178 Vũ Quốc Luận, Dương Tuấn Nhựt (2007), “Bước đầu nghiên cứu khả tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumitrong nuôi cấy in vitro”, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, Nxb Trẻ Tp.HCM Ngơ Thị Nguyệt, Hồng Thị Thế, Tô Phương Thảo, Đinh Thu Huế, Đặng Thị Chinh, Nguyễn Thị Thu Trang, Trần Thùy Dung, Trần Thị Hà (2013), Thu thập lưu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số lồi lan q Quảng Ninh, Chương trình Nghiên cứu Khoa học phát triển Công nghệ năm tỉnh Quảng Ninh, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)- loài lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, Số 64, 34 trang 127-136 10 Nguyễn Bảo Tồn (2004), Ni cấy mơ tế bào thực vật, Nxb Đại học Cần Thơ 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Xuân Trường, Đỗ Văn Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống ni trồng phong lan Phalaenopsis”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 12 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hồi (2004), “Ứng dụng phương pháp ni cấy lát mỏng tế bào nhân nhanh in vitro số giống địa lan có giá trị”, Tạp chí KHKT Nơng nghiệp, số 2, trang 340-343 13 Hà Thị Thúy (2011), “Quy trình ni cấy tế bào lớp mỏng tái sinh giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) địa”, Báo cáo Đề tài khoa học công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp 14 Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân (1998), Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM 15 Dương Thị Thảo Trang, Trương Thị Bích Phượng, Huỳnh Văn Kiệt (2006), “Nghiên cứu nhân giống in vitro bời lời (Litsea rubescens)” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thơn, số15, trang 56-58 *Tài liệu tiếng Anh 16 Adams P (2011), “Systematcs of Dendrobiinae (Orchidaceae) with special reference to Australian taxa”, Botanical Journal of the LinneanSociety, 166: 105–126 17 Asghar S, Ahmad T, Hafi I.A and Yaseen M (2011), “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma White” African Journal of Biotechnology, 10: 3097 – 3103 18 Babu K.N, Sajina A, Minoo D, John C.Z, Mini P.M, Tushar K.V, Rema J, Ravindran P.N (2003), “Micropropagation of camphor tree (Cinnamomum 35 camphora)”, Plant Cell Tiss Org Cult, 74: 179-183 19 Bhata P., Bhatia N.P., Ashwath N (2002), “In vitro propagaton of Stackhousia tryonii Bailey (Stackhousiaceae): A rare and serpentineendemic species of central Queensland, Autralia”, Biodiversity and Conservation 11:1469-1477 20 Benson E.F., Danaher J.E., Pimbley I.M., Anderson C.T., Wake J.E., Daley S, Adams L.K (2000), “In vitro micropropagation of Primula scotica: A rare Scotish plant”, Biodiversity and Conservation, 9: 711726 21 Chen Q.X., Ji Z.H (1998), “Encyclopedia of China orchid Beijing, China”, China Forestry Publishing House 22 Chen J T and Chang W C (2001), “Effect of auxins and cytokinins on direct somatc embryogenesis on leaf explant of Oncidium”, Plant GrowthReg, 34: 229-232 23 Chen J T and Chang, W C (2000), “Efficient plant regeneration through somatcembry genesis from callus cultures of Oncidium (Orchidaceae)”, Plant Sci, 160: 87-93 24 Chen JT and Chang WC (2002), “Effect of tissue culture conditions and explant characteristics on direct somatc embryogenesis in Oncidium Gower Ramsey”, Plant Cell Tiss Org Cult, 69: 41-44 25 Chou L.C., Chang D.C.N (2004), “Asymbiotic and symbiotic seed germinaton of Anoectochilus formosanus and Haemaria discolor and their F1 hybrids”, Botanical Bulletin of Academia Sinica, 45: 143-147 26 Chugh S, Guha S, Rao I U (2009), “Micropropagation of orchids: A review on the potental of different explants”, Sci Hortic, 122: 507–520 27 Dai ChuanYun, Liu TengFei, Guan TianBing, Liu WanHong (2011), “Optmization of medium formula for the proliferation of Dendrobium 36 candidum Wall ex Lindl Protocorm”, Medicinal Plant, 1: 1-2 28 Dearnaley JDW (2007), “Further advances in orchid mycorrhizal research”, Mycorrhiza, 17: 475-486 29 Gaspar T, Kevers C, Penel C, Greppin H, Reid D.M, Thrope T.A (1996), “Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture in vitro”, Cell Dev Biol Plant, 32:272-289 30 Geogre E.F., Hall M.A., Klerk G.J (2008), “Plant Propagaton by TissueCulture”, The Background Springer 31 Goh C J and Loh, C S (1975), “Furtherobservatons on meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 12: 10-13 32 Goh C J (1970), “Tissue culture of Vanda Miss Joaquim”, I Natl Acad Sci, 2: 31-33 33 Goh C.J (1973), “Meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 11: 10-15 34 He SL; DeZheng K, Qiu YS and QiXiang Z (2003), “Effect of carbon sources and organic compounds on the multiplication of Oncidiumaloha var, Iwanaga protocorm-like body”, Lournal of Henan Agricultural University, 37: 154-157 35 José Geraldo ZV, Keiko UL, Kaoro JY, Takashi GN, Tadeu F (2009), “Propagaton and aclimatzation of Catleya Lindl (Orchidaceae) using banana pulp and coconut water”, Científica Jaboticabal, 37(1): 48-52 36 Kull T., Arditi J., Wong S.K (2009), Orchid Biology: Reviews and Perspectives X Springer 37 Loh Goh C J and Rao A N (1978), “Some factors affecting morphogenesis of Aranda orchid tissue culture, Proc Symp Orchidology”, Orchid Soc South East Asia, 4: 43 - 55 38 Luan V.Q., Thien N.Q., Khiem D.V., Nhut D.T (2006), “In vitro germinaton capacity and plant recovery of some native and rare 37 orchids”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agricultur, 7: 38 175-177 39 Maridass M, Mahesh R, Raju G, Benniamin A, Muthuchelian K (2010), “In vitro Propagaton of Dendrobium nanum through rhizome bud culture”, International Journal of Biological Technology, 1: 50-54 40 McKendrick S (2000) “In vitro germination of orchids: amanual”, Ceiba Foundation for Tropical Conservation, 8: 1-17 41 Molnar Z., Virag E and Ordog V (2011), “Natural substances in tissue culture media of higher plants, Acta Biologica Szegediensis”, 55 : 123127 42 Morel G (1964), “A new means ofclonal propagaton of orchids”, Am Orchid Soc Bull, 33: 473-478 43 Morel G (1960), “Producing virus-free Cymbidiums, Am”, Orchid Soc Bull, 29: 495-497 44 Parthibhan S, Rao MV, Kumar TS (2015), “In vitro regeneration from protocorms in Dendrobium aqueum Lindley-An imperiled orchid”, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 13: 227–233 45 Park S.Y., Murth H.N, Paek K.Y (2003), “Protocorm-like body inducton and subsequent plant regeneraton from root tip cultures of Doritaenopsis”, Plant Science, 164: 919-23 46 Ranjan C (2008), “Efffects of different factors on immature embryo culture, PLBs differentiation and rapid mass multiplicaton of Coelogyne suaveolens”, Indian Journal Exp Biol, 46: 243-248 47 Rayle D.L, Ross C.W, Robinson N (1982), “Estmaton of osmotc parameters accompanying zeatin-induced growth of detached cucumber cotyledons”, Plant Physiol, 70: 1634-1636 39 48 Rezend JC, Ferreira EA, Pasqual M, Santos FC (2009), “Growth regulators and saccarose on the loddigesiis” 40 development of Cattleya Revista Agrarian, 2: 99-114 49 Sagawa Y and Kunisaki JT (1982), “Clonal propagaton of orchid by tissue culture”, Plant tissue culture, 8: 683-684 50 Saiprasad G.V.S, Raughuveer P., Khetarpal S., Chandra R (2004), “Effect of various polyamines on production of protocorm-like bodies in orchid Dendrobium „Sonia‟”, Scientia Horticulturae, 100: 161-168 51 Scully R (1967), “Aspects of meristem culture in the Cattleya alliance, Amer”, Orchid Soc Bull, 36: 103-108 52 Sudha C.G., Krishnan P.N., Pushpahgadan P (1998), In vitro propagaton of Holostemma annulare (Roxb.) K Schum, a rare medicinal plant, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 34: 57-63 53 Tuhuteru S, Hehanussa ML (2012), “Pertumbuhan dan Perkembangan Anggrek Dendrobium Anosmum Pada Media Kultur Dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa”, Jurnal Ilmu Budidaya Tanaman, Agrologia, 1: 1-12 54 Yam T.W, Arditti J.(2009), “History of orchid propagation: a mirrior of the history of biotechnology, plant Biotechnol Rep”, Korean Society forPlant Biotechnology and Springer, Published online 2009 41 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY ... gen quý cho nhu cầu nuôi trồng Xuất phát từ thực tế tiến hành thực đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống lan Hồng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. ) kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật để... triển nguồn gen quý Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl. ) nhằm tạo sở cung cấp giống cho trình sản xuất Phạm vi nghiên cứu Tiến... phục vụ nhu cầu nội tiêu xuất nhiệm vụ nhân giống lan phương pháp nuôi cấy mô hướng đắn Nhân giống Hoàng thảo ý ngọc phương pháp nuôi cấy mô cung cấp lượng lớn giống chất lượng cao, đồng đều, bệnh,