Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây củ mài (dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN -***** - PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI ( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật HÀ NỘI, 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN -***** - PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI ( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài khóa luận, nhân tơi xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng thí nghiệm Sinh lí học thực vật trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phương tiện để tơi hồn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, góp ý cho tơi qua trình học tập hoàn thành đề tài Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017 Sinh viên PHẠM THỊ QUY LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017 Sinh viên PHẠM THỊ QUY MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm phân loại Củ mài 1.1.1 Phân loại thực vật Củ mài 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Củ mài 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến 1.1.4 Đặc điểm dược liệu hạt tinh bột Củ mài sau chế biến 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Công dụng 1.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.1 Tính tồn tế bào thực vật 1.2.1.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 1.2.1.3 Cơ chế di truyền thông qua hệ tế bào 1.2.2 Các giai đoạn ni cấy mơ tế bào thực vật 1.2.2.1 Khử trùng mẫu cấy khởi động 1.2.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 1.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 1.2.2.4 Tạo hoàn chỉnh 10 1.2.2.5 Giai đoạn đưa đất 10 1.2.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.2.3.1 Các muối khoáng đa lượng vi lượng 11 1.2.3.2 Nguồn cacbon 12 1.2.3.3 Các vitamin acid amin 12 1.2.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 13 1.2.3.5 Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường 14 1.2.3.6 pH môi trường 15 1.2.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 1.2.4.1 Điều kiện vô trùng 15 1.2.4.2.Môi trường vật lý 15 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Củ mài Việt Nam giới 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng Củ mái Việt Nam 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 18 2.3.1 Thiết bị 18 2.3.2 Dụng cụ 18 2.4 Môi trường nuôi cấy 18 2.5 Điều kiện nuôi cấy 18 2.6 Phương pháp nghiên cứu 19 2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19 2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.6.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19 2.6.2.2 Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều tiết sinh trưởng đến khả tái sinh chồi Củ mài 20 2.6.2.3 Ra rễ tạo Củ mài in vitro hoàn chỉnh 21 2.6.2.4 Huấn luyện Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 22 2.7 Phương pháp thống kê 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 24 3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro củ mài 25 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi 27 3.2.2 Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi 28 3.3 Ảnh hưởng NAA đến hình thành rễ chồi Củ mài in vitro 29 3.4 Huấn luyện Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Cơng thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro Củ mài 28 Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài in tro 29 Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng BAP kết hượp NAA đến khả nhân chồi Củ mài in tro 29 Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Củ mài in vitro 30 Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng giá thể tới thích nghi Củ mài 30 Bảng 3.1: Kết tạo vật liệu khởi đầu đốt thân Củ mài 33 Bảng3.2: Ảnh hưởng BAP lên khả nhân chồi Củ mài sau tuần nuôi cấy 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA lên khả nhân chồi Củ mài nuôi cấy 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng NAA lên khả nhân chồi củ mài sau tuần nuôi cấy 39 Bảng 3.5: Ảnh hưởng giá thể đến hoá Củ mài in vitro 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Củ mài 11 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 27 Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu .34 Hình 3.2: Tái sinh nhân nhanh chồi Củ mài in vitro 35 Hình 3.3: Rễ Củ mài in vitro .39 Hình 3.4: Rèn luyện ngồi tự nhiên 41 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: α- Napthlacetic acid KI: Kinetin IBA: Indol 3- butyric acid IAA: - Indole - acetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất vitro Tạo rễ giai đoạn cuối trình nhân nhanh in vitro Với mục đích tạo có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật auxin sử dụng để kích thích phân chia tế bào phân hoá rễ Những auxin dùng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật NAA Để tăng khả rễ cho chồi củ mài nghiên cứu tiến hành lấychồi củ mài thu từ thí nghiệm tách riêng lẻ cấy lên mơi trường MS bổ sung NAA(0,1;0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l ) để khảo sát khả tạo rễ in vitro Bảng 3.4: Ảnh hưởng NAA lên khả nhân chồi củ mài sau tuần nuôi cấy Chiều dài Công thức Số rễ/ chồi N0,1 5,80 ± 0,84 a 8,84 ± 0,27 N0,2 8,00 ± 1,58 c 15,14 ± 0,29 c N0,3 7,40 ± 1,52 bc 14,74 ± 0,46 c N0,4 6,00 ± 0,70 ab 9,54 ± 0,36 N0,5 5,20 ± 0,84 a 9,08 ± 0,19 rễ(cm) a b a Các chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 Hình 3.3: Rễ Củ mài in vitro A: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,1l; B: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,2; C: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,3; D: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,4; E: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,5 Kết ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ củ mài trình bày bảng 3.4 cho thấy, môi trường bổ sung 0,2 mg/l NAA mơi trường thích hợp cho q trình hình thành rễ củ mài với trung bình 8,00 rễ/chồi (Hình3.3b); chiều dài rễ đạt giá trị lớn 15,14 cm nồng độ 0,2 mg/l Ở chồi rễ phát triển gần hoàn chỉnh giống với rễ củ mài ngồi tự nhiên, rễ có kích thước lớn, màu trắng Khi tăng nồng độ lên 0,5 mg/l NAA chúng tơi nhận thấy q trình phát triển rễ bị ức chế dẫn đến hình thành rễ hơn, rễ có kích thước ngắn 3.4 Huấn luyện Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Việc hố ngồi vườn ươm khâu quan trọng, đảm bảo có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng tốt đưa vào điều kiện sản xuất Kết rèn luyện Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên thể bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng giá thể đến hoá Củ mài in vitro Giá thể Đất thịt Tỷ lệ sống(%) 100 Hình thái Cây cứng, khỏe, tạo rễ nhẹ Đất cát 95 Cây mảnh, tạo rễ 98 Cây cứng, khỏe, tạo pha Đất: rễ cát(1:1) Các chữ khác cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 Hình 3.4: Rèn luyện ngồi tự nhiên A: Cây Củ mài in vitro trồng già thể đất: cát (1:1) sau tuần huấn luyện B: Cây Củ mài in vitro trồng già thể đất thịt nhẹ sau tuần huấn luyện Kết bảng 3.5 cho thấy khơng có khác biệt ý nghĩa ảnh hưởng loại giá thể lên tỷ lệ sống Củ mài vườn ươm Tất cho tỷ lệ sống cao Tuy nhiên giá thể đạt tỷ lệ sống 100% đất thịt nhẹ Trong đó, giá thể đất thịt nhẹ cho cứng, khỏe, tạo rễ đánh giá giá thể thích hợp để chuyển Củ mài vườn ươm Quy trình nhân giống in vitrocây Củ mài Ethanol 70%+ Javel 7% 10 phút Thân non Củ M ẫu vô M S + B A P N Đất thịt nhẹ 1,5 + NA A 0,5 KẾT LUẬ Kết N VÀ luận KIẾN NGH Ị Dựa vào kết thu từ thí nghiệm trên, tơi rút số kết luận sau: 1.1 Sử dụng javen 7% 10 phút để khử trùng lan tạo vật liệu in vitro cho trình nhân giống Củ mài Phương pháp đạt hiệu khử trùng cao với tỷ lệ mẫu sống vô trùng 83,33% 1.2 Môi trường MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l bổ sung BAP (1,5 mg/l) 0,5mg/l NAA thích hợp cho q trình nhân nhanh chồi in vitro Số chồi hình thành đạt 6,83 chồi sau tuần nuôi cấy 1.3 Môi trường MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l bổ sung NAA (0,2 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, đạt 8,00 rễ/chồi sau tuần nuôi cấy 1.4 Cây trồng giá thể đất thịt nhẹ cho tỷ lệ sống đạt 100% Kiến nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu với hóa chất khác nhiều phận khác 2.2 Nghiên cứu thêm môi trường nhân nhanh chồi TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam.NXB Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội Đỗ Năng Vịnh (2002).Công nghệ sinh học trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Năng Vịnh (2007), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tất Lợi, (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội Đỗ Thị Lan Hương, Trần Văn Ba, (2008) “Nghiên cứu đặc điểm hình thái cấu tao giải phẫu thích nghi với chức số học củ nâu (Dioscoreacea)”.Tạp chí khoa học ĐH Sư phạm Hà Nội 2,2008, số Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vậttrong cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Ngơ Xn Bình, Bùi bảo Hồn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình cơng nghệsinh học, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Bảo Tồn, 2004, Ni cấy mơ tế bào thực vật Nhà xuất Đại học Cần Thơ Trang 28-32 Nguyễn Hồng Quân, (2006) “Cẩm nang ngành lâm nghiệp-chương Lâm sản ngồi gỗ”: Bộ nơng nghiệp phát triển nơng thơn-chương trình hỗ trợ ngành lâm nghiệp đối tác, trang 130 10 Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, (2012) Sinh lý học thực vật” NXB Giáo dục 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005),Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp,Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Trường Sơn, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học, hội nghị CNSH toàn quốc 2003, trang 850-855 13 Nguyễn Thị Hiền, (2014) “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học hóa học số lồi thuộc chi Củ mài (Dioscorea L.) Vĩnh Phúc”: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện hàn lâm khoa học Việt Nam 14 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Lan, Nguyễn Thành Luân (2007), “Ảnh hưởng số yếu tố môi trường giá thể đến sinh trưởng lan Dendrrobium hybrid invitro", Tạp chí Khoa học Công nghệ, Trường đại học Thái Nguyên(3), trang 105-108 15 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, (2013) Phương pháp nghiên cứu Sinh lý học thực vật.NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 16 Nguyễn Xuân Linh (2002),Giáo trình kĩ thuật trồng hoa cảnh,Nxb Nơngnghiệp, Hà Nội 17 Phạm Quang Trung, “Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái củ mài khả hôm giống hom củ giai đoạn vườn ươm rừng đạc dụng Copia huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La”: Trường Đại học Tây Bắc, Luận văn thạc sỹ 18 Võ Văn Chi, 1997 Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, trang 328-332 19 Võ Văn Chi, 2007, Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam.Nxb Giáo dục 20 Vũ Thanh Sắc, Vũ Văn Vụ, Trần Thị Liên, Tạ Như Thụ Anh, Nguyễn Văn Thuận (2009), “Nghiên cứu nhân giống invitro Ban Âu Hypericum perforatum 1.”, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2009, Trang 237-239 21 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2008), Công nghệ sinh học tập 2, Nhà xuất Giáo dục * Tài liệu tiếng Anh 22 Alizadeh S., Mantell SH, Viana AM (1998), “In vitro culture and microtuber induction in the steroidal yamDioscorea composite Hemsl”, Plant Cell Tissue Organ Cult , 5(3), pp.107-112 23 Ayensu ES (1972), “Anatomy of the monocotyledons VI Dioscoreales”.Oxford Press, Oxford,p.182 24 Behera K.K., Sahoo S, Prusti A (2008), “Eficient in vitro micropropagation of greater yam (Dioscorea alata L.cv Hinjilicatu) through nodal vine explants”, Indian Journal of Plant Physiol, (14), pp.250-256 25 Borges M., Ceiro W., Meneses S., Aguilera N., Vazquez J., Infante Z and Fonseca M (2004), “Regeneration and multiplication of Dioscorea alata germplasm maintained in vitro” Plant Cell Tiss.Org.Cult, 7(6), pp.87-90 26 Fotso, Ngo Ngwe Marie Florence Sandrine1, DjocgouePierre Franỗois and Omokolo Ndoumou Denis (2013), Micropropagation of Dioscorea alata L from microtubers induced in vitro”, African Journal of Biotechnology,12(10), pp.1057-1067 27 Jasik J, Mantell SH (2000), “Efects of jasmonic acid and its methyl esteron in vitro microtuberization of three food yam (Dioscorea) species”, Plant Cell Rep, 19, pp.863-867 28 Jean M and Cappadocia M (1992), “Effects of growth regulators on in vitro tuberization in Dioscorea alata L „Brazo fuerte‟ and D.abyssinica Hoch” Plant cell Rep, (11), pp.34-38 29 Kohmura H., Araki H and Imoto M (1995), “Micropropagation of „yam atoimo‟ Chineseyam (Dioscorea opposita Thunb.) from immature leaves”, Plant Cell Tiss.Org.Cult , (40), pp.271-276 30 Mantell SH, Hugo SA (1989), “Efects of photoperiod, mineral medium strength, inorganic ammonium, sucrose and cytokinin on root, shoot and microtuber development in shoot cultures of Dioscorea alata L and D.bulbifera L Yams”, Plant Cell Tiss.Org.Cult , (16), pp.23-37 31 Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol Plant 15: 473 479 32 Supriya Das, Manabendra Dutta Choudhury and Pranab Behari Mazumdar, (2013), “Micropropagation of Dioscorea alata L through nodal segments”, African Journal of Biotechnology, Vol 12(47), pp 6611-6617 33 Thankappan and K Abraham, (2012) “Micropropagaton and Microtuber Induction in Dioscorea wallichii Hook.f.”, Journal of Root Crops, 2012, Vol 38 No 2, pp 109-115 34 Tor M., Twyford CT., Funes I., Boccon-Gibod J., Ainsworth CC and Mantell SH (1998), “Isolaton and culture of protoplasts from immature leaves and cell suspension of Dioscorea yams: Tools for transient gene expression studies”, Plant Cell Tiss.Org.Cult, 53, pp.113-125 35 Twyford CT., Mantell SH (1996), “Producton of somatc embryos and plantlets from root cells of Greater Yam”, Plant Cell Tiss.Org.Cult , 46, pp.17-26 36 Ukaegbu M., Okpuzor J (2010), “A Study Of Changes In Some Biochemical Parameters During Bacterial Fermantation Of Dioscorea EsculentaTubers”, Report and Opinion, 2(6), pp.88-93 * Tài liệu internet 37 Đại học Tây Bắc, 2012 Nhân giống hạt, thuận lợi khó khăn. 38 Hải Lan, 2011, Củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường typ 2. 39 Traphaco, 2011 Ngân hàng Thế giới tài trợ cho “Đề án thuộc Dự án GreenPlan” Traphaco thơng qua Chương trình Ngày sáng tạo Việt Năm 2011. 40 Viện Dược liệu, 2011, Cây thuốc, PHỤ LỤC Nhân nhanh chồi Củ mài in vitro Thao tác box cấy vô trùng ... Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật 1.2.1.1 Tính tồn tế bào thực vật Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa học... persimilis) phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Mục tiêu đề tài - Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống Củ mài kĩ thuật ni cấy mô tế bào thực vật Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn -Ý... PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI ( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật Người