Xây dựng quy trình nhân giống lan hoàng thảo y ngọc (dendrobium transparens wall ex lindl ) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật

Ngoài giá trị thương mại, một số loài lan thuộc chi Dendrobium còn là thành phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc và Ấn Độ [44]… Trong tự nhiên, các loài lan sinh trưởng chậm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGUYỄN NGUYỆT QUỲNH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN

HOÀNG THẢO Ý NGỌC (Dendrobium transparens

Wall ex Lindl.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh

KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, anh Đào Văn Kiên- Học viên Cao học K18 đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành

đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh

lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố

Hà Nội, 14 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Quỳnh

Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

NỘI DUNG 4

Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về chi Dendrobium 4

1.1.1.Vài nét về chi Dendrobium 4

1.1.2 Vài nét về lan Hoàng thảo ý ngọc 5

1.2 Đặc điểm sinh học của cây lan 6

1.2.1 Hạt lan 7

1.2.2 Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan 7

1.2.3 Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan 9

1.3 Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium ở Việt Nam 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 14

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 14

2.3.1 Thiết bị 14

2.3.2 Dụng cụ 14

2.4 Môi trường nuôi cấy 14

2.5 Điều kiện nuôi cấy 15

2.6 Phương pháp nghiên cứu 15

2.6.1 Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm 15

2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro: 16

2.6.3 Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh: 16

2.6.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên: 16

2.7 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 16

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18

3.1 Nhân nhanh protocorm và tạo chồi từ protocorm 18

3.1.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm 18

3.1.2 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm 19

3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 21

3.2.1 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi 21

3.2.2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi 22

3.2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi 25 3.3 Tạo rễ - hình thành cây in vitro hoàn chỉnh 26

3.3.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ 26

3.3.2 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ 27

3.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi của D transparens

sau 8 tuần nuôi cấy 21

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của D transparens

sau 8 tuần nuôi cấy 22

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi

của D transparens sau 8 tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả năng tạo rễ in vitro của D transparens

sau 6 tuần nuôi cấy 26

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D transparens

sau 6 tuần nuôi cấy 27

Hình 3.6 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro D transparens

sau 6 tuần nuôi cấy 26

Hình 3.7 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D transparens

sau 6 tuần nuôi cấy 28

Hình 3.8 D transparens in vitro rèn luyện ngoài tự nhiên 29

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Họ Phong lan là một họ lớn nhất của thực vật có hoa với hơn 800 chi

và 25.000 loài Hoa lan được đánh giá cao bởi vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ và sự

đa dạng về kích thước, hình dạng, màu sắc Hiện nay, hoa lan chiếm 8% trong ngành thương mại hoa thế giới và có tiềm năng thay đổi tình hình kinh tế của một quốc gia [26]

Chi Dendrobium thuộc họ Phong lan là một trong những chi thực vật

phổ biến nhất trên thế giới, chi này có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng khắp ở Châu Á, Bắc Australia và New Zealand Các loài thuộc chi này sinh trưởng nhanh, dễ dàng tái sinh thế hệ mới, hoa đẹp, ra hoa quanh năm [16]

Ngoài giá trị thương mại, một số loài lan thuộc chi Dendrobium còn là thành

phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc và Ấn Độ [44]… Trong tự nhiên, các loài lan sinh trưởng chậm, tái sinh chủ yếu bằng hạt Tuy nhiên, khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt lan là cực kì thấp Do đó, khả năng phục hồi của các quần thể lan ở rừng tự nhiên là rất khó [1], [2]

Bằng các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm cành, chiết cành, ghép cành, người ta đã thu được nhiều giống cây trồng mới cho năng suất và phẩm chất tốt Tuy nhiên, các phương pháp này còn nhiều hạn chế như hệ số nhân thấp, tốn nhiều thời gian Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ra đời đã mang lại lợi ích lớn cho nhiều nước trên thế giới Bên cạnh việc khắc phục nhược điểm của biện pháp nhân giống vô tính truyền thống,

nó còn thể hiện ưu điểm vượt trội như tạo ra lượng lớn cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn; tạo sinh khối tế bào lớn làm nguyên liệu cho công nghiệp và y dược Do đó khắc phục những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống [3]

Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) là loài lan có hoa

đẹp, lâu tàn, có thể trồng trong vườn nhà nên được rất nhiều người ưa chuộng Tuy nhiên, việc trồng loài lan này còn gặp nhiều khó khăn về nguồn cây giống Để chủ động nguồn cây giống phục vụ cho phát triển sản xuất phục vụ nhu cầu nội tiêu cũng như xuất khẩu thì nhiệm vụ nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy mô là hướng đi đúng đắn Nhân giống Hoàng thảo ý ngọc bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ cung cấp một lượng lớn cây giống chất lượng cao, đồng đều, sạch bệnh, khắc phục được hiện tượng thoái hoá và đặc biệt lưu giữ nguồn gen quý cho nhu cầu nuôi trồng

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây

dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall

ex Lindl.) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật” để chọn môi trường nhân

nhanh phù hợp tạo ra số lượng cây con lớn, đồng đều và sạch bệnh trong thời gian ngắn, làm tiền đề cho việc cung cấp cây giống có chất lượng tốt phục vụ cho sản xuất, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý này

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống lan Hoàng thảo ý ngọc (D

transparens Wall ex Lindl.) nhằm tạo cơ sở cung cấp giống cho quá trình

sản xuất

3 Phạm vi nghiên cứu

Tiến hành các nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm

4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu

invitro về lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.)

Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng nghiên cứu

trong nuôi cấy mô tế bào lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens Wall ex Lindl.) Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng

dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu khai thác, bảo

tồn các nguồn gen quý về loài hoa lan

NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về chi Dendrobium

1.1.1 Vài nét về chi Dendrobium

Chi Dendrobium thuộc nhóm lan đa thân, là một chi lớn trong họ lan

với trên 1600 loài được chia thành 40 nhóm, phân bố trải dài từ Triều Tiên, Nhật Bản qua Đông Dương, Malaysia, Indonesia đến Australia, các đảo Polynesi Giống lan này được đặt tên và trở thành danh pháp khoa học chính thức từ năm 1979 [4]

Dendrobium là nhóm cây phụ sinh bám trên cây gỗ, điều kiện sinh thái

rất đa dạng, thích nghi với nhiều loại khí hậu khác nhau [21]

Theo thống kê ở Việt Nam, chi Dendrobium có trên 100 loài phân biệt

nhau bằng thân, lá, hoa…[1]

Dendrobium là loại lan đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường

mang một thân với nhiều lá mọc xen kẽ Trên thân có rất nhiều mắt ngủ, căn

hành giữa hai mắt ngắn hơn ở Cattleya

Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên có thể mọc từ thân thành cụm hoặc từng hoa riêng biệt Màu sắc hoa rất đa dạng từ màu trắng, vàng tới tím Cấu tạo hoa cơ bản giống với đặc điểm của họ lan, với lá đài sau nằm một mình, hai lá đài bên dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ gọi là cằm Cánh môi gắn vào cằm, đôi khi kéo dài với nhau tạo thành cựa, móc hay túi Môi nguyên hay có thuỳ, gai sọc có lông hay không, hai cánh bên giống hai lá đài Trụ thấp, phần đực của đỉnh trụ

có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp không vĩ, không gót Quả nang dạng túi

Chi Dendrobium có nhiều loài hoa rất lâu tàn, cá biệt có loài trên 3

tháng hoặc hoa có thể nở suốt năm Một nhóm gồm các loài thuộc chi

Dendrobium ra hoa vào đầu mùa mưa do quá trình khô hạn trong mùa nắng,

nhóm khác ra hoa vào dịp Tết và hiện nay chưa được biết một cách chắc chắn

do ảnh hưởng của quang chu kỳ hay do tác động của cả 2 yếu tố

Dựa vào dạng thân Dendrobium chia làm hai nhóm chính [7]:

- Dạng thòng hay Nobie, là dạng thân mềm, ra hoa từ chồi sơ khai của giả hành đã trưởng thành, phân bố chủ yếu ở vùng lạnh như Đà Lạt Dạng

thòng đặc trưng ở Hoàng thảo long tu (D primulinum), giả hạc (D

anosmum)

- Dạng đứng hay Phalaenopsis là dạng thân cứng, hoa mọc ở giả hành non lẫn giả hành đã trưởng thành Ở giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành vòi, dạng này thường sống ở vùng có khí hậu nóng

Về hình dạng của giả hành cũng rất đa dạng [7]:

- Nhóm có giả hành to ngắn, tận cùng thường có 2-3 lá đài, bền, không rụng Phát hoa tập trung tại phần này tạo thành chùm có thể đứng hay thòng

như Thuỷ tiên trắng (D fermeri), Vảy vá (D lindleyi)…

- Nhóm giả hành rất dài và mang lá dọc theo chiều dài của giả hành,

thường rụng lá khi ra hoa như Hoàng thảo long tu (D primulinum), Ý nhi (D

gratiosissimum)…

- Nhóm giả hành rất mảnh mai có thể dài hay ngắn, có lá mọc dọc theo chiều dài của chúng và các lá này thường bền, không rụng Hoa thường chỉ

mọc ở nách lá như Hương duyên (D revolutum)…

1.1.2 Vài nét về lan Hoàng thảo ý ngọc

Lan Hoàng thảo ý ngọc có tên khoa học là D transparens Wall ex Lindl thuộc chi Dendrobium nên mang hầu như tất cả các đặc điểm của chi

Hoàng thảo ý ngọc có thân thòng, lá mỏng Hoa to 3-4 cm, 2-3 chiếc mọc ở các đốt của thân cây đã rụng lá Độ bền của hoa từ 12-20 ngày Đài hoa màu trắng tính khiết, lưỡi tím hoa bèo Màu sắc hoa biến thiên từ tím đến

trắng; cánh và lưỡi pha màu rất hài hoà

Loài này thường dễ trồng, ra hoa vào mùa xuân (phổ biến tháng 4), có hương thơm lạ, nhẹ Đây là loài đặc hữu của Sơn La, Điện Biên, Lai Châu

1.2 Đặc điểm sinh học của cây lan

Với 750 chi và 20.000-25.000 loài (Takhtajan, 1987), họ lan đã chiếm

vị trí thứ 2 sau họ Cúc (Asteracea) trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn

nhất trong lớp một lá mầm Chính vì thế, hình thái, cấu tạo cũng như hệ thống phân loại họ này hết sức đa dạng và phức tạp [7]

Nhìn chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm (đôi khi hoá gỗ một phần ở gốc), mọc ở đất, hốc hoặc vách đa, sống phụ hoặc hoại sinh

Nét độc đáo của họ lan là lối sống phụ sinh (bì sinh), treo lơ lửng trên

vỏ của các cây thân gỗ khác Chúng phát triển thành các dạng thân rễ nạc, dài hay ngắn, mập hay mảnh mai, đưa cơ thể lan đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Hệ rễ khí sinh ở đây vừa làm nhiệm vụ hút nước, muối khoáng trên vỏ cây gỗ, vừa bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi bị gió cuốn đi, ngoài ra nó còn chống đỡ cho cây mọc cao vươn ra chỗ có nắng giữa đám tán lá cây [14]

Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm đa thân (sympodial) và nhóm đơn thân (monopodial) ngoại trừ một nhóm trung gian giữa hai nhóm trên gồm rất ít giống [7]

- Nhóm đơn thân gồm những cây chỉ tăng trưởng theo chiều cao làm

cho cây dài ra mãi Gồm các giống: Vanda, Phalaenopsis, Aerides,

Rhynchostylis, Ở nhóm này, lá được xếp thành hai hàng đối nhau, lá trên

một hàng xen kẽ với lá của hàng kia Ở một số giống như Phalaenopsis các

đốt thân rất ngắn và các lá trở nên dày đặc Ở một số giống khác các đốt

tương đối cách xa nhau như Vanda

- Nhóm đa thân gồm những cây tăng trưởng liên tục, có những chu kỳ nghỉ sau những mùa tăng trưởng Nhóm đa thân có giả hành rất biến động,

nhóm này gồm các giống như: Cattleya, Oncidium, Dendrobium, Cymbidium,

Epidendrum… Căn cứ vào cách ra hoa, có thể chia nhóm này thành hai nhóm

phụ: nhóm ra hoa phía trên gồm các giống Dendrobium, Cymbidium,

Oncidium… Nhóm ra hoa ở đỉnh như Cattleya, Laelia, Epidendrum…

- Nhóm trung gian gồm các loài như Centropetatum, Phachyphilum,

Dichaea…

1.2.1 Hạt lan

Hạt lan rất nhỏ (như hạt bụi) và hầu như không chứa bất kỳ dinh dưỡng

dự trữ nào cho phôi trong giai đoạn đầu tiên của quá trình nảy mầm như các loài thực vật khác Cấu tạo hạt rất đơn giản, chỉ bao gồm một phôi chưa phân hoá được bao bọc bởi một lớp áo hạt Trên thực tế, quả phong lan chứa một số lượng rất lớn hạt lan, mỗi quả chứa trên một triệu hạt [30]

Phôi của các loài thực vật thuộc họ lan có kích thước rất nhỏ và chưa phân hoá Quá trình phát triển của phôi hạt lan rất khác biệt với các loài thực vật có hoa khác [38]

Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu→ dạng thuỷ lôi→ dạng có lá mầm Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu→ dạng khiên→ dạng diệp tiêu Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu→ dạng chuyển tiếp→ dạng protocorm

1.2.2 Sự nảy mầm cộng sinh với nấm trong tự nhiên của hạt lan

Vì hạt lan quá nhỏ, hầu như không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hoá nên k thể phát triển theo cách bình thường được Vì vậy việc làm cho hạt lan nảy mầm và phát triển thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn vào giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển ngành lan [1]

Người trồng lan đã tìm mọi cách để gieo hạt nhưng không thành công Năm 1844, Neumann đã làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách rải các hạt lan trên các diện tích đất quanh gốc của các cây lan lớn Dominy là người đầu tiên đã tạo ra được các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan trước năm

1853, nhưng chỉ thành công ở một số giống [14]

Năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật người Pháp đã khám phá ra bí

mật của việc nảy mầm ở hạt lan khi ông khảo sát các hạt lan Neottia nidus nảy

mầm tự nhiên trong rừng vùng Fontainebleu ở Pháp Ông thấy các cây lan con

ấy đều nhiễm nấm Sự thật thì việc liên hệ giữa nấm và cây lan con đã được khảo sát từ năm 1850 và sự liên hệ giữa nấm và rễ lan đã được các nhà khoa học nghiên cứu suốt hơn nửa thế kỉ tiếp theo đó nhưng không ai nghĩ rằng sự hiện diện của nấm là cần thiết cho sự nảy mầm của các hạt lan Điều này cắt nghĩa lý do thành công của Neumann [46]

Năm 1904, Noel Bernard thành công trong việc phân lập các nấm từ rễ lan rồi cho nhiễm nấm vào các hạt lan Bằng cách đó Noel Bernard là người đầu tiên đã làm cho 100% hạt lan nảy mầm Sau đó, Bernard và Burgeff đã cộng tác với nhau để đưa ra phương pháp gieo hạt có nhiễm nấm trong môi trường chứa agar Phương pháp này được xem là phương pháp gieo hạt cộng sinh (semissymbiotiques), tạo ra cuộc cách mạng cho sự gia tăng số lượng lớn cây lan trồng từ hạt [7], [11]

Mỗi loài nấm chỉ giúp nảy mầm một số loài lan:

- Rhizoctonia repens giúp hạt Cattleya, Laelia, Angraecum,

Cypripedium nảy mầm

- Rhizoctonia mucoroides giúp hạt Vanda, Phalaenopsis nảy mầm

- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt Oncidium, Odontoglossum và

Miltonia nảy mầm [38]

Khi nảy mầm, phôi tăng trưởng thành một hình cầu nhỏ, cấu trúc giống thân hành (corn) được gọi là protocorm, gồm một mô phân sinh chồi và rễ không hoạt động tại hai cực đối diện nhau Trong tự nhiên, protocorm có màu xanh lá cây và tích luỹ carbohydrate dự trữ thông qua quang hợp Khi protocorm đã phát triển và tích luỹ vật chất đầy đủ thì nó sẽ hình thành lá

không cần phải cộng sinh với nấm [30]

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, sự nảy mầm cộng sinh với hạt

của Anoectochilus formosanus cho thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm vào

lớp áo hạt Sau khi hấp thu nước, phôi trương phồng và làm rách lớp áo hạt Phôi làm vỡ tung lớp áo hạt, nhú phôi sẽ hình thành trên một đầu protocorm

và mô phân sinh đỉnh trên đầu còn lại Trên mặt cắt dọc của protocorm cho thấy có sự xâm nhiễm của hệ sợi nấm [25]

1.2.3 Sự nảy mầm không cộng sinh in vitro của hạt lan

Năm 1922, Knudson đã thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường agar để gieo hạt Với các bình cấy có môi trường agar và muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt lan là rất ít hay không

có, nhưng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan lại rất lớn [7] Sự khác biệt giữa cây lan và hạt lan là sử dụng CO2 trong không khí Từ CO2 và nước, cây lan tạo thành carbohydrate trong quá trình quang hợp theo phản ứng:

nCO2+nH2O→(CH2O)n +nO2

Từ carbohydrate và muối khoáng hấp thu từ rễ, cây lan đã tạo ra được các chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển Hạt lan không nảy mầm được là

do chưa có khả năng tổng hợp carbohydrate từ CO2 và không có nguồn carbohydrate dự trữ Thí nghiệm kiểm tra cho thấy chỉ cần thêm 2% đường vào môi trường gieo hạt chỉ gồm có agar và muối khoáng, không cần có nấm hạt lan vẫn nảy mầm tốt Như thế vai trò chủ yếu của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp nguồn carbohydrate Từ đó phương pháp của Knudson đã được sử dụng khắp nơi trên thế giới và được gọi là phương pháp gieo hạt không cộng sinh (semis asymbiotique) [7], [38]

1.3 Tình hình nghiên cứuchi Dendrobium trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium trên thế giới

Trong những năm qua, kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển rất mạnh

mẽ, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã và đang trở thành một công cụ hiệu quả

của công nghệ sinh học Kỹ thuật nuôi cấy in vitro được ứng dụng rộng rãi

trong việc nhân giống vô tính cây trồng, trong cải thiện giống, bảo vệ nguồn gen, thu sinh khối, hoạt chất quý [20], [19], [36], [52] Với những thành công trong nhân giống các cây trồng khác nhau nên những khó khăn trong việc nhân giống các loài lan ngoài tự nhiên đã khắc phục được bằng phương

pháp nhân giống in vitro và đã được áp dụng từ sớm [46]

Chi Dendrobium gồm rất nhiều loài có giá trị cao Vì vậy, đây cũng là đối tượng được nhiều nhà khoa học quan tâm nuôi cấy in vitro từ rất sớm Vật

liệu nuôi cấy khởi đầu thường được sử dụng là hạt, đỉnh chồi, đoạn thân hay

lá Phương pháp tái sinh cây có thể thông qua PLBs (protocorm like bodies), callus, phôi soma Tuy nhiên, phương pháp tái sinh cây thông qua PLBs được sử dụng rộng rãi và có khả năng ứng dụng lớn nhất [12], [45], [50]

Kết quả thành công đầu tiên của Kundson (1922) là công trình nhân

giống in vitro lan với việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường agar có rất

nhiều ưu điểm [30]

Morel (1960) sử dụng chồi đỉnh của Cymbidium cấy vào môi trường

Knudson III (C) để tạo ra protocorm [42] Vào năm 1964, ông tiếp tục thí nghiệm cắt nhỏ thể protocorm và cấy lại vào môi trường, từ một thể protocorm có thể sản xuất hơn 4.000 cây con/năm [43] Từ kết quả thí nghiệm của Morel, rất nhiều giống lan đa thân đã được nhân vô tính thành công như

Cattleya (Scully, 1967) [49], Dendrobium (Sagawa, 1984 [51])

Để hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô hoa lan, các nhà nghiên cứu đã đi sâu tìm hiểu ảnh hưởng của một số chất phụ gia lên sự hình thành callus và protocorm như ảnh hưởng của nước dừa (Goh và cộng sự, 1970, 1973, 1975) [31], [32], [33] với nồng độ 10-25%, dung dịch cà chua (Loh và cộng sự, 1978)

[37], ảnh hưởng của nguồn cacbon và các hợp chất vô cơ (He S.L và cộng sự, 2003) [34]

Từ 2000 đến 2002, Chen và cộng sự đã kết luận môi trường ½ MS bổ sung 10-20 g/l saccharose, 170 mg/l NaH2PO4 và 0,5 g/l peptone là thích hợp

nhất cho sự hình thành phôi trực tiếp từ mẫu lan Onncidium Gower Ramsey

là 15.78 mm [39]

Dai Chuan Yun et al (2011) đã nghiên cứu và xác định được môi

trường tối ưu cho nhân nhanh protocorm lan Dendrobium candidum Wall ex

Lindl là 1/2MS + 6-BA 2mg/l + αNAA 0,5mg/l + KIN 1mg/l Nghiên cứu này đã cung cấp cơ sở khoa học cho sản xuất ở quy mô công nghiệp

protocorm và nhân giống chất lượng cao D candidum [27]

Sana Asghar et al (2011) đã nghiên cứu và xác định được môi trường

có bổ sung 2ml/l BAP cho nhân nhanh chồi in vitro Dendrobium nobile [17]

S Tuhuteru et al (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa

trong môi trường nuôi cấy in vitro và xác định bổ sung 100ml/l nước dừa cho môi trường tối ưu cho sự phát triển và nhân nhanh Dendrobium anosmum [53]

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu đối với cây hoa lan nói chung và các loài lan thuộc chi

Dendrobium nói riêng Ngoài ra đã có nhiều nghiên cứu tập trung đi sâu vào

một số lĩnh vực như chọn tạo giống, nhân giống, các biện pháp kỹ thuật và các biện pháp phòng trừ sâu, bệnh hại,…

Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu và sản xuất hoa lan nước ta kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm được thời gian

và kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nhân giống và nuôi trồng cây hoa lan trong điều kiện Việt Nam

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium ở Việt Nam

Nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt

in vitro, Vũ Quốc Luận, Dương Tuấn Nhựt (2007) đã bước đầu nghiên cứu

thành công khả năng tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumi trong nuôi cấy

in vitro [5]

Năm 2011, Vũ Ngọc Lan đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro 2 giống lan Hoàng Thảo rừng dùng làm dược liệu là Dendrobium nobile Lindl.và

Dendrobium chrysanthum Lindl., tác giả đã kết luận kỹ thuật nuôi cấy lỏng

lắc và lỏng lắc thoáng khí đã làm tăng hệ số nhân nhanh thể sinh chồi lan D

nobile Lindl Nhân nhanh cụm chồi D chrysanthum Lindl bằng bioreactor đã

giảm được ½ thời gian nhân giống và cải thiện chất lượng chồi [3]

Cùng năm 2011, Hà Thị Thuý và cộng sự đã tìm ra môi trường tạo cây

hoàn chỉnh các giống lan Hoàng Thảo D farmeri, D anosmum, D chrysanthum

là VW + 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l GA3 + 3g/l agar + 30g/l saccarose [13]

Năm 2013, Ngô Thị Nguyệt và cộng sự đã tìm ra môi trường tối ưu nhân

nhanh Cypripedium formosanum, Cymbidium lowianum, D anosmum là : MS

+ 0,5 mg/l BAP + 1,2 mg/l KI; MS + 2 mg/l BAP + 1,2 KI; MS +1,5 mg/l BAP + 0,9 mg/l KI [8]

Tóm lại, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thu thập, lưu giữ nguồn gen hoa lan bản địa và nhập nội cũng như đánh giá, tuyển chọn những giống phong lan triển vọng cho sản xuất và đi sâu nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật

về giá thể, phân bón, kỹ thuật điều khiển ra hoa, phòng trừ sâu, bệnh hại Các kết quả nghiên cứu được ứng dụng vào sản xuất đã bước đầu đem lại hiệu quả tích cực trong việc phát triển ngành trồng lan ở Việt Nam Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được quy

trình kỹ thuật trồng, chăm sóc đầy đủ, đặc biệt là trên chi lan Dendrobium

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là lan Hoàng thảo ý ngọc (D

transparens Wall ex Lindl) thuộc:

Vật liệu nghiên cứu là Quả lan Hoàng thảo ý ngọc (D transparens

Wall ex Lindl) do Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN, ĐHSP Hà Nội 2) cung cấp

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2016 đến tháng 4/2017 tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.3.1 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật : Cân kĩ thuật (Sartorius, Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử trùng (HV - 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan), Máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV - 110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích (Sartorius, Đức)

- pH môi trường: 5,8

- Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 117 oC trong

15 phút

- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng

cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) [49] bổ sung 30g/l saccharose , 7g/l agar, 10% nước dừa và các chất điều hòa sinh trưởng : Kinetin (KI), 6 - Benzyl amino purine (BAP) và α – Napththalen acetic acid (α-NAA)

2.5 Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo

- Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 2000lux

- Quang kì: 16 giờ/ngày

- Nhiệt độ phòng: 25 oC - 27 oC

- Độ ẩm trung bình: 70% - 74%

2.6 Phương pháp nghiên cứu

Quả lan được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 2 phút, lắc trong nước javel 5% trong 10 phút Sau đó bổ dọc quả, lấy hạt đặt vào đĩa petri sạch, khử trùng bề mặt bằng khí clo (100 ml NaClO+3,3 ml HCl đặc) trong 2 giờ, hạt được gieo lên môi trường MS Sau 8-10 tuần hạt nảy mầm được sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nhân nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy

mô thực vật

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Mẫu sau khi cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 10 h/ngày Gồm các thí nghiệm:

2.6.1 Nhân nhanh protocorm và phát triển chồi từ protocorm

Sử dụng hạt lan nảy mầm sau 10 tuần nuôi cấy trên môi trường MS (Murasige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm chất điều hoà sinh trưởng KIN

(0,0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) để nghiên cứu khả năng nhân nhanh protocorm

Theo dõi chỉ tiêu: đường kính cụm protocorm (cm), số protocorm/cụm sau 10 tuần nuôi cấy

Sử dụng protocorm từ thí nghiệm trên để nuôi cấy trên môi trường MS

có bổ sung thêm nước dừa (ND): 0%; 5%; 10%; 15%; 20% (v/v) để nghiên

cứu khả năng tạo chồi in vitro từ protocorm

Theo dõi tỷ lệ phần trăm tạo chồi từ protocorm sau 10 tuần nuôi cấy

2.6.2 Nhân nhanh chồi in vitro:

Sử dụng chồi in vitro 10 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ

sung riêng rẽ các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm KIN và BAP: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 (mg/l) và môi trường cơ bản MS bổ sung tổ hợp BAP (0,5-2,0 mg/l) kết hợp NAA 0,2 mg/l

Theo dõi số chồi/mẫu, số lá/chồi và chiều cao chồi (cm) sau 8 tuần nuôi cấy

2.6.3 Ra rễ-tạo cây in vitro hoàn chỉnh:

Chồi in vitro 2 tháng tuổi có chiều cao 4-5cm được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung NAA (0,3;0,5;0,7 mg/l) hoặc IAA (0,3;0,5;0,7 mg/l) để

khảo sát khả năng tạo rễ in vitro

Theo dõi tỷ lệ tạo rễ (%), số rễ/chồi và chiều dài rễ (cm) sau 6 tuần nuôi cấy

2.6.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên:

Cây D transparens hoàn chỉnh được đưa vào rèn luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên trên giá thể xơ dừa đã được xử lý

2.7 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm

Số liệu thực nghiệm được phân tích theo các tham số thống kê gồm trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, phân tích thống kê số liệu ANOVA 1 yếu tố và kiểm tra sự sai khác giữa giá trị trung bình bằng phương pháp LSD của Fisher trên