XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN HỮU NGHĨA Niên khóa : 2008-2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT NGUYỄN HỮU NGHĨA KS NGUYỄN PHAN THÀNH Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS Huỳnh Văn Biết tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức quý báo giúp đỡ em hồn thành khóa luận KS Nguyễn Phan Thành hết lòng giúp đỡ em suốt thời gian làm đề tài Thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường Các bạn lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 34 giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập làm đề tài Xin gửi lời tri ân đến ba mẹ gia đình tạo điều kiện cho đến ngày hôm nay, dạy dỗ chăm sác nên người Nguyễn Hữu Nghĩa i TÓM TẮT Hiện nay, phát triển trồng chuyển gen trở thành xu chung giới, diện tích trồng đậu nành chuyển gen ngày tăng lên Lợi ích nguy từ trồng chuyển gen chưa phân định rõ ràng nên nhiều biện pháp kiểm soát an toàn trồng chuyển gen cần đặt nhằm giảm tác hại chúng đến sức khỏe người mơi trường Nhằm mục đích xây dựng phương pháp sàng lọc trồng biến đổi gen, trước hết đậu nành biến đổi gen, tiến hành nghiên cứu “Xây dựng quy trình duplex PCR phát đậu nành chuyển gen” Đề tài trước tiên so sánh hiệu ly trích DNA từ hạt đậu nành quy trình ly trích sử dụng CTAB, SDS kit Sau sử dụng kỹ thuật duplex PCR với hai cặp mồi phát đoạn promoter 35S (có hầu hết thực vật chuyển gen) đoạn gen lectin (có tất chủng đậu nành) Thí nghiệm thay đổi thơng số chủ yếu phản ứng PCR để tìm thơng số thích hợp, sau kiểm tra độ xác quy trình thiết lập Thí nghiệm đạt kết sau: Quy trình ly trích DNA hạt đậu nành sử dụng CTAB đạt kết tốt Các thông số tối ưu cho phản ứng duplex PCR: nhiệt độ bắt cặp 60oC, 45 chu kỳ, nồng độ MgCl2 1,5 µM, nồng độ cặp primer lectin 35S 0,1 µM 0,3 µM Phản ứng duplex PCR xây dựng có độ đặc hiệu cao 10 mẫu hạt đậu nành thu thập địa bàn thành phố Hồ Chí Minh kháo sát ngẫu nhiên, kết cho thấy có 01 mẫu hạt đậu nành chuyển gen ii SUMMARY Nowadays, developing GMO becomes general trend in the world, GMO crops increase every year especially soybean Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health In order to establish a method to help screening GMO, firstly in soybean, the research “Establishing duplex PCR process to determine genetically modified soybean” was carried out Firstly, the research compares the effective of DNA extraction when using CTAB, SDS and kit After that, the research use duplex PCR technique with two primers: one for detect promoter 35S (present in almost GM plant) and one for detect lectin gen (present in all type of soybean) The research changes essential elements in a typical PCR to determine optimize parameters, after all, confirms the accuration of the established process The research has some results: Soybean DNA extraction using CTAB has the best result Optimizing parameter for duplex PCR: annealing temperature is 60oC, 45 circles, MgCl2 1.5 µM, primers for lectin 0.1 µM each, prime for 35S 0.3 µM each Duplex PCR established has high specific Ten samples soybean collected from Ho Chi Minh City has analyzed with Duplex PCR designed The results show that one sample is detected as GM soybean Keyword: GMO, duplex PCR, lectin, 35S iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây trồng chuyển gen 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Các hướng tạo giống trồng chuyển gen 2.1.2.1 Chuyển gen kháng sâu 2.1.2.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ 2.1.2.3 Chuyển gen tạo kháng virus gây bệnh 2.1.2.4 Chuyển gen cải thiện chất dinh dưỡng trồng 2.1.3 Một số trồng chuyển gen 2.1.4 Tình hình trồng chuyển gen 2.1.5 Lợi ích từ trồng chuyển gen 2.1.6 Nguy từ trồng chuyển gen 2.1.6.1 Lo ngại vấn đề môi trường 2.1.6.2 Lo ngại sức khỏe người iv 2.1.6.3 Lo ngại kinh tế 2.1.7 Dán nhãn thực phẩm biến đổi gen 2.2 Đậu nành đậu nành chuyển gen 2.2.1 Đậu nành 2.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ 11 2.2.2.1 Trên giới 11 2.2.2.2 Trong nước 11 2.2.3 Đậu nành chuyển gen 12 2.3 Các phương pháp xác định trồng chuyển gen 13 2.3.1 ELISA 13 2.3.2 PCR 14 2.3.1.1 Nguyên lý 14 2.3.2.2 Các giai đoạn phản ứng 14 2.3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15 2.3.2.4 Promoter 35S gen lectin 17 2.3.3 Realtime PCR 18 2.3.4 Tình hình nghiên cứu biện pháp phát trồng chuyển gen 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 20 3.2 Vật liệu thí nghiệm 20 3.2.1 Mẫu thí nghiệm 20 3.2.2 Thiết bị hóa chất thí nghiệm 21 3.2.2.1 Thiết bị 21 3.2.2.2 Hóa chất 21 v 3.3 Phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình ly trích DNA 21 3.3.1.1 Quy trinh ly trích mẫu với CTAB 21 3.3.1.2 Quy trình ly trích mẫu với SDS 22 3.3.1.3 Quy trình ly trích mẫu với Kit DNA Miniprep Kit (Plant) 22 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả hoạt động primer 23 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng MgCl2 nồng độ primer 24 3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng Duplex PCR 26 3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát số chu kỳ phản ứng Duplex PCR 26 3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng Duplex PCR 27 3.3.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát số mẫu đậu nành phản ứng Duplex PCR 27 3.3.8 Thử nghiệm so sánh với Realtime PCR 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình ly trích DNA 29 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả hoạt động primer 32 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng MgCl2 nồng độ primer 33 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng Duplex PCR 34 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát số chu kỳ phản ứng Duplex PCR 36 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng Duplex PCR 37 4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát số mẫu đậu nành phản ứng Duplex PCR 38 4.8 Thí nghiệm 8: Thử nghiệm so sánh với Realtime PCR 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTAB Cetyl trimethy ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid GMO Genetically modified organism Nos Nopaline synthase OD Optical density PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulfate vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Địa điểm thời gian thu thập mẫu đậu nành 20 Bảng 3.2 Đặc điểm cặp primer khuếch đại gen lectin 23 Bảng 3.3 Đặc điểm cặp primer khuếch đại promoter 35S 23 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 24 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng duplex PCR 25 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng duplex PCR 25 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 26 Bảng 3.9 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR 28 Bảng 4.1 Kết sau đo OD mẫu ly trích DNA 31 viii 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả hoạt động primer phản ứng PCR cặp primer L 200 bp 190 bp 100 bp 118 bp Hình 4.2 Sản phẩm PCR với cặp primer đơn gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút L) Ladder 50b, 1) Primer lectin; 2) Primer 35S Kết điện di cho ta thấy cặp primer hoạt động tốt, sản phẩm khuếch đại cặp primer lectin 35S 118 bp 190 bp, lý thuyết đưa Sản phẩm khuếch đại từ cặp primer cho sản phẩm nhất, thể cặp primer có độ đặc hiệu cao, chu trình nhiệt nồng độ thành phần phản ứng PCR thiết lập ban đầu tương đối tốt Do đó, sử dụng hai cặp primer để tiến hành thử nghiệm phản ứng duplex PCR, nhằm tiến đến xây dựng quy trình duplex PCR có khả phát đậu nành chuyển gen hoàn thiện 32 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng MgCl2 nồng độ primer cho phản ứng Duplex PCR L 10 11 12 13 14 15 200 bp 190 bp 118 bp 100 bp Hình 4.3 Sản phẩm PCR với nồng độ primer 35S - lectin thay đổi theo MgCl2 gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút 1-15) nghiệm thức thí nghiệm; L) ladder 50 bp Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ MgCl2 thể hình 4.3 cho thấy phản ứng duplex PCR với nồng độ 1,5 µM MgCl2 (ở nghiệm thức 1, 4, 7, 10 13) cho kết tốt nhất, với nồng độ µM MgCl2 (ở nghiệm thức 2, 5, 8, 11, 14) 2,5 µM MgCl2 (ở nghiệm thức 3, 6, 9, 12 15) cho nhiều sản phẩm phụ smear Ở Mg2+ coenzyme Taq polymerase, nên nồng độ Mg2+ cao Taq polymerase hoạt động mạnh Tuy nhiên, Taq polymerse khơng có khả sửa sai nên hoạt động nhiều mức độ sai lệch trình khuếch đại tăng kết làm xuất nhiều sản phẩm không đặc hiệu Như vậy, với nồng độ MgCl2 cao khả xuất sản phẩm khơng đặc hiệu tăng Ngồi nồng độ MgCl2, nồng độ cặp primer tỷ lệ chúng có ảnh hưởng đáng kể đến tạo thành sản phẩm, tính đặc hiệu phản ứng Multiplex PCR nói chung, Duplex PCR nói riêng Trong thí nghiệm này, đầu tiên, để xác định 33 ảnh hưởng nồng độ cặp primer lectin đến phản ứng Duplex PCR, giữ nồng độ primer 35S cố định (0,2 µM) phản ứng PCR đơn dần bổ sung thêm primer lectin với nồng độ 0,1 , 0,2 , 0,4 µM (các nghiệm thức - 9) Kết từ hình 4.3 cho thấy rằng: nồng độ primer 35S 0,2 µM lectin 0,1 µM, phản ứng PCR có xuất sản phẩm khuếch đại Tuy nhiên, nồng độ cặp primer lectin tăng dần 0,2 0,4 µM khơng có sản phẩm khuếch đại cặp primer 35S Ở đây, nhận định có ức chế cặp primer lectin cặp primer 35S Mặc dù, phản ứng Duplex PCR với tổ hợp nồng độ primer 35S 0,2 µM lectin 0,1 µM cho kết với sản phẩm khuếch đại, nhiên vạch DNA sản phẩm 35S gel agarose 3% mờ bị smear (hình 4.3) Vì vậy, từ kết nhằm khảo sát tổ hợp nồng độ primer thích hợp, chúng tơi giữ nồng độ primer lectin 0,1 µM tăng dần nồng độ primer 35S 0,3 0,4 µM (ở nghiệm thức 10 – 15) Kết hình 4.3 cho thấy rằng: với nồng độ primer lectin promoter 35S 0,1 µM, 0,3 µM, phản ứng Duplex PCR khuếch đại sản phẩm từ cặp primer nói Tuy nhiên, đây, chúng tơi ghi nhận rằng: có xuất số sản phẩm phụ không mong muốn nghiệm thức 11, 12 tương ứng với nồng độ MgCl2 µM 2,5 µM (hiện tượng giải thích phần biện luận khảo sát ảnh hưởng nồng độ MgCl2 đến phản ứng PCR) Nghiệm thức 10 với nồng độ MgCl2 1,5 µM cho kết tối ưu Trong đó, phản ứng Duplex PCR với nồng độ primer lectin 0,1 µM primer 35S 0,4 µM khơng có sản phẩm từ cặp primer lectin ghi nhận (hình 4.3) Điều nồng độ primer 35S cao gây tượng ức chế primer lectin Như vậy, kết hợp yếu tố trên, nồng độ MgCl2 1,5 µM, nồng độ cặp primer 35S 0,3 µM lectin 0,1 µM thích hợp cho phản ứng Duplex PCR 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp phản ứng Duplex PCR Nhiệt độ nóng chảy cặp primer 35S 54,3 oC 58,0 oC, trình tự primer tham khảo từ D.James (2003) Nhiệt độ nóng chảy cặp primer lectin 59,6 oC 61,9 oC, tham khảo từ chuẩn ISO 2156-2005 34 Do đặc điểm hai cặp primer từ hai nguồn khác với nhiệt độ nóng chảy chênh lệch tương đối lớn nên việc xác định nhiệt độ bắt cặp primer phải thực cách thay đổi nhiệt độ nhiều mức khác nhau, nhằm tìm nhiệt độ bắt cặp tốt Trong thí nghiệm này, nhiệt độ thay đổi từ 52oC đến 62OC nghiệm thức kế tiểp chênh lệch 2oC Theo kết điện di sản phẩm Duplex PCR (hình 4.4), từ 52oC đến 56oC, khơng có sản phẩm khuếch đại promoter 35S lectin 62°C L 52°C 54°C 56°C 58°C 60°C L 200 bp 190 bp 100 bp 118 bp 118 bp Hình 4.4 Sản phẩm Duplex PCR với nhiệt độ bắt cặp thay đổi từ 52°C đến 62°C gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút Đối với cặp primer 35S, 58oC có xuất sản phẩm khuếch đại mờ, chí khơng thấy rõ khơng quan sát kỹ Điều nằm ngồi dự đốn lý thuyết phản ứng PCR đơn khoảng nhiệt độ này, cặp primer 35S hoạt động tốt Tuy nhiên, tương tác với cặp primer lectin mà đến 60oC, cặp primer 35S cho hoạt động tốt tạo sản phẩm nhìn thấy rõ ràng hình điện di Đến 62oC cặp primer 35S lại bị bất hoạt không cho sản phẩm PCR 35 Trong đó, cặp primer lectin có nhiệt độ nóng chảy tương đối cao so với cặp primer 35S nên nhiệt độ 58oC, 60°C 62oC, cặp primer hoạt động cho sản phẩm PCR (hình 4.4) Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy 60oC, phản ứng duplex PCR cho kết tốt với sản phẩm cặp primer rõ rệt 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát số chu kỳ phản ứng Duplex PCR L 200 bp 190 bp 118 bp 100 bp Hình 4.5 Sản phẩm duplex PCR với số chu kỳ khếch đại thay đổi gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút 1) 30 chu kỳ; 2) 35 chu kỳ; 3) 40 chu kỳ; 4) 45 chu kỳ Trong phản ứng PCR đơn, thường sau 30 chu kỳ sản phẩm khuếch đại DNA nhìn rõ điện di Trong phản ứng duplex PCR với hai cặp primer này, cạnh tranh thành phần để tổng hợp cặp primer lúc nên nhiều chu kỳ để nhìn rõ vạch DNA khuếch đại gel điện di Kết thí nghiệm (hình 4.5) cho thấy 30 chu kỳ, chưa thấy xuất sản phẩm DNA nào, 35 chu kỳ sản phẩm cặp primer lectin bắt đầu xuất yếu Từ chu kỳ 40 trở đi, xuất sản phẩm khuếch đại, sản phẩm nhìn thấy rõ 45 chu kỳ 36 Ở không thực nghiệm thức với 50 chu kỳ, nhiên, vào sai khác độ phát sáng sản phẩm gel điện di, ta thấy sản phẩm lectin 35S từ chu kỳ 40 trở lên không khác biệt nhiều độ sáng, sản phẩm khuếch đại đoạn gen lectin Điều cho thấy phản ứng tiến dần đến giai đoạn bão hòa, lúc kéo dài thêm chu kỳ khơng mang nhiều ý nghĩa phản ứng hết dNTP để tổng hợp thành sản phẩm mới, enzyme Taq polymerase khuếch đại dần hoạt tính phải kéo dài thời gian hoạt động nhiệt độ cao Mặc khác khuếch đại số chu kỳ thấp (40-45), sản phẩm tạo đủ để phát kết hình điện di sản phẩm Như vậy, số chu kỳ thích hợp để quan sát kết phản ứng duplex PCR nghiên cứu 45 chu kỳ 4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tính đặc hiệu phản ứng Duplex PCR 190 bp 118 bp L 200 bp 100 bp Hình 4.6 Kết điện di xác định độ đặc hiệu gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút 1)Bắp chuyển gen; 2) Đối chứng dương 3) Cà rốt; 4) Lúa; 5) Hành; 6) Cá; 7) Heo; 8) Bò ; 9) Gà; L) Ladder 50 bp Trên hình 4.6 kết điện di cho thấy hai mẫu bắp đậu nành (đối chứng dương) chuyển gen cho sản phẩm khuếch đại với cặp primer promoter 35S với kích thước 190 bp Ngồi ra, mẫu đậu nành chuyển gen có thêm sản phẩm khuếch đại từ cặp primer lectin vị trí 118 bp, khơng thấy có xuất sản phẩm phụ vị trí khác 37 cho thấy phản ứng duplex có tính đặc hiệu cao bắp đậu Mặc khác, đậu nành bắp số loại lương thực phổ biến chuyển gen nhiều nhất, từ đó, độ đặc hiệu phương pháp góp phần mở rộng triển vọng để áp dụng khảo sát trạng chuyển gen thị trường nông sản Các mẫu DNA lại từ cà rốt, lúa, hành, cá, heo, bò, gà có sản phẩm khuếch đại khơng chun tính nhiều kích thước khác Việc xuất sản phẩm khuếch đại primer bắt cặp nhiều vị trí khác giải thích gen lồi lớn, nên xác suất xuất lúc nhiều trình tự có khả bắt cặp bổ sung với trình tự primer xảy Tuy nhiên, khả sản phẩm khuếch đại có độ dài vừa trùng khít với độ dài sản phẩm cặp primer thiết kế tương đối thấp, xảy trường hợp khó để suy luận kết phản ứng có đoạn gen cần tìm hay khơng từ dễ dẫn đến kết luận sai Nếu điều xảy phải rà sốt thay đổi yếu tố phản ứng PCR thay cặp primer khác đặc hiệu Trong thí nghiệm này, phản ứng duplex PCR với mẫu DNA cà rốt, lúa, hành, cá, heo, bò, gà khơng có sản phẩm khuếch đại có chiều dài vị trí 118 bp 190 bp tương ứng với kích thước sản phẩm khuếch đại từ cặp primer lectin 35S, cặp primer đặc hiệu cho việc áp dụng chẩn đoán đậu nành chuyển gen Hai cặp primer khuyến cáo sử dụng cho việc chẩn đoán thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc đậu nành 4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát số mẫu đậu nành phản ứng Duplex PCR Kết khảo sát 10 mẫu đậu nành hạt thu thập ngẫu nhiên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (hình 4.7) cho thấy phản ứng duplex cho kết ổn định, sản phẩm khuếch đại trình tự lectin cho kết tốt, nhìn thấy rõ hình điện di sản phẩm Mẫu đối chứng dương cho kết tốt với băng rõ rệt, đối chứng âm khơng có sản phẩm khuếch đại Trong 10 mẫu khảo sát có mẫu số vừa có sản phẩm khuếch đại lectin, vừa có sản phẩm khuếch đại gen 35S chứng tỏ mẫu có chuyển gen sử dụng promoter 35S 38 - + 10 L 190 bp 118 bp 200 bp 100 bp Hình 4.7 Kết khuếch đại duplex PCR với mẫu đậu nành khảo sát gel agrarose 3%, hiệu điện 50V, 70 phút 1-10) mẫu đậu nành; 11) ladder; -) đối chứng âm; +) đối chứng dương Các mẫu mua ngẫu nhiên địa bàn thông qua chợ có diện đậu nành chuyển gen, điều chứng tỏ khâu kiểm duyệt sản phẩm chuyển gen khơng kiểm sốt hết tồn sản phẩm nhập vào nước Từ người tiêu dùng sử dụng nhầm phải loại thực phẩm chuyển gen không rõ nguồn gốc, dễ dẫn đến nguy sức khỏe họ bị dị ứng với thành phần sản phẩm chuyển gen, nguy môi trường gen ngoại lai truyền Từ đấy, cần thiết có nhiều biện pháp tốt nhằm kiểm soát lưu hành sản phẩm chuyển gen áp dụng phương pháp xác định nhanh sản phẩm chuyển gen phương pháp PCR, Realtime PCR , dán nhãn sản phẩm để người tiêu phân biệt 4.8 Thí nghiệm 8: Thử nghiệm so sánh với Realtime PCR Để xác nhận xác lần mẫu đậu nành số thí nghiệm có thực chuyển gen hay khơng, nhằm tránh tượng xảy dương tính giả, mẫu xác định có diện promoter 35S kiểm định lại với Realtime PCR sử dụng kit Plant GMO Screen (Saccace) Bộ kit Realtime PCR Plant GMO Screen kit có khả phát đồng thời diện DNA thực vật, promoter 35S, terminator nos, ngồi có thêm đối chứng nội pos IC (positive inhibition internal control) 39 nhằm kiểm tra hoạt động probe thành phần khác phản ứng Bộ kit cung cấp thêm đối chứng dương (đậu nành chuyển gen 1%) đối chứng âm riêng kèm với sản phẩm trợ giúp người sử dụng dễ kiểm tra kết Hình 4.8 Thiết lập đầu đọc huỳnh quang phù hợp với probe Hình 4.8 cho thấy tương ứng với probe có độ phát huỳnh quang tương ứng Cụ thể JOE tương ứng với probe thiết kế phát DNA thực vật, ROX tương ứng với probe thiết kế phát promoter 35S, FAM tương ứng với probe thiết kế phát terminator Nos CY5 tương ứng với probe thiết kế phát đối chứng kiểm soát phản ứng (Pos IC) Điều đảm bảo cho kết có độ xác, khơng bị nhầm lẫn ánh sáng huỳnh quang phát Hình 4.9 Kết Realtime PCR xác định diện promoter 35S Đường nền, Mẫu số 1, Đối chứng dương, 40 Đối chứng âm Hình 4.10 Kết Realtime PCR xác định diện DNA thực vật Đường nền, Mẫu số 1, Đối chứng dương, Đối chứng âm Hình 4.11 Kết Realtime PCR xác nhận hóa chất kit hoạt động tốt Đường nền, Mẫu số 1, Đối chứng dương, Đối chứng âm Kết hình 4.9, 4.10 4.11 cho thấy kit realtime hoạt động tốt thông qua đối chứng dương biểu thị có diện DNA thực vật, promoter 35S, terminator nos đối chứng âm không phát DNA Ngoài ra, kết phát đối chứng nội Pos IC cho thấy probe, đầu đọc huỳnh quang thành phần khác hoạt động bình thường Như kết realtime PCR tốt dùng để so sánh với kết duplex PCR xây dựng 41 Hình 4.12 Kết Real time PCR hồn tất với mẫu âm, mẫu dương mẫu đậu số Căn vào kết ta nhận thấy phản ứng Realtime PCR có khả phát có mặt promoter 35S mẫu đậu nành số từ sớm (31,89 chu kỳ), đối chứng dương đậu nành 1% gen chuyển đến chu kỳ 33 phát diện gen Tương tự, số chu kỳ phát terminator nos mẫu khảo sát mẫu đối chứng dương gần (37,97 chu kỳ so với 38,25 chu kỳ) Vì kit realtime sử dụng thí nghiệm kit định tính, nên số chu kỳ phát promoter 35S terminator nos tương đối gần không đưa phần trăm lượng gen chuyển có mẫu đậu số 1, kết luận mẫu số có chuyển gen mà thơi So sánh với kết duplex PCR thí nghiệm 7, mẫu số nhận định ban đầu có chuyển gen (ít có promoter 35S) kiểm định xác nhận lại với Realtime PCR (sử dụng kit thông số phản ứng xác nhận kit máy Realtime PCR hoạt động tốt) có diện promoter 35S terminator nos Như vậy, quy trình duplex PCR xây dựng cho kết dương tính thật So sánh kỹ thuật PCR realtime PCR, xét khía cạnh kỹ thuật, realtime PCR thực định lượng xác lượng copy gen cần tìm mà kỹ thuật PCR truyền thống không làm được, cần biết diện gen cần tìm kỹ thuật PCR truyền thống hồn tồn thực Mặc khác, xét khía cạnh 42 kinh tế, chi phí đầu tư, hoạt động bảo dưỡng cho thiết bị hóa chất để thực phản ứng PCR (và duplex PCR) nhìn chung ln thấp nhiều so với đầu tư để thực phản ứng realtime PCR Như vậy, muốn định lượng mẫu chuyển gen, trước hết nên thực sàng lọc mẫu với kỹ thuật PCR để xác định có diện yếu tố gen chuyển hay không (như nghiên cứu này) sau tiến hành định lượng lại với kỹ thuật realtime PCR 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phương pháp ly trích DNA từ mẫu hạt đậu nành CTAB cho kết tốt so với phương pháp ly trích sử dụng SDS kit ly trích, xét tiêu độ tinh sản lượng DNA thu nhận Xây dựng quy trình duplex PCR cho kết tốt, độ đặc hiệu phản ứng cao với thông số tối ưu: nồng độ MgCl2 1,5 µM; primer lectin 0,1 µM; primer 35S 0,3 µM Chu trình nhiệt cho phản ứng tiền biến tính 95oC phút, nhiệt độ biến tính 95oC 30 giây; bắt cặp 60oC 30 giây; kéo dài 72oC 20 giây Giai đoạn kéo dài cuối 72oC Thử nghiệm quy trình duplex PCR số mẫu khảo sát cho thấy quy trình PCR xây dựng có khả phát đậu nành chuyển gen tốt có độ đặc hiệu cao Có diện đậu nành chuyển gen thị trường thành phố Hồ Chí Minh 5.2 Đề nghị Khảo sát thêm ảnh hưởng nồng độ Taq polymerase, nồng độ dNTP lên phản ứng duplex PCR Phát triển thành kỹ thuật duplex PCR với cặp primer phát gen lectin, promoter 35S, terminator nos Khảo sát độ đặc hiệu, dương tính âm tính giả nhiều mẫu Khảo sát trạng đậu nành chuyển gen thị trường 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ Hồ Huỳnh Thùy Dương 2001 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Trịnh Đình Đạt 2007 Cơng nghệ sinh học tập Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Văn Mùi 2009 An toàn sinh học Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Lê Duy Thành 2009 Cơ sở sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục Nguyễn Hữu Trưởng 2005 Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen phương pháp Real-time PCR Luận văn tốt nghiệp, ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm TPHCM Tài liệu tiếng nước ngồi Bartlett J.M.S, Stirling PCR Protocol, trang 155-157 Humana Press John M Walker, Ralph Rapley 2009 Chemistry - Molecular Biology and Biotechnology, trang 203-204 RSC Publishing Bài báo nước A Review of the Environmental Safety of the Cry1Ab Protein Center for Environmental Risk Assessment, ILSI Research Foundation 10 D Basu and S Appukuttan 1983 Plant lectins specific for N-acetyl-β-D- galactosamine Biosci.,Vol 5, Supplement 1, pp 131-135 11 D James, A.M Schmidt, E Wall, M Green, and S Masri.2004 Reliable Detection and Identification of Genetically Modified Maize, Soybean, and Canola by Duplex PCR Analysis 12 E Elnifro, A Ashshi, R J Cooper, and P E Klapper 2000 Duplex pcr: ptimization and application in diagnostic virology Clinical microbiology reviews, pp 559–570 13 P Markoulatos , N Siafakas, and M Moncany 2002 Duplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach Journal of Clinical Laboratory Analysis , pp.47–51 45 14 P Sharma and S.D Purohit 2012 An improved method of DNA isolation from polysaccharide rich leaves of Boswellia serrata Roxb Indian Journal of Biotechnology Vol 11, pp 25-26 15 Qualitative PCR method for detection of event GTS 40-23 JRC Compendium of Reference Methods for GMO Analysis 16 T Nguyen, C T Son, R Raha, A R Lai and C Michael 2009 Comparison of DNA extraction efficiencies using various methods for the detection of genetically modified organisms (GMOs) International Food Research Journal pp 21-30 17 W Wang and T J.Fang 2005 Development of Duplex and Quantitative PCR Assay to Detect Genetically Modified Roundup Ready Soybean in Foods Journal of Food and Drug Analysis, Vol 13, No 2, pp 132-13 18 Y Kqueen, Y Tyan, S Ping and R Son, 2011 Development of duplex-PCR for Genetically Modified Organism (GMO) detection targeting EPSPS and Cry1Ab genes in soy and maize samples International Food Research Journal Vol 18, pp 515-522 Tài liệu từ internet 19 http://medicine.yale.edu/labs/henegariu/www/ 20 http://www.isaaa.org/kc/default.asp 21 http://www.greenpace.com 22 http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/ 23 http://www.patentlens.net/daisy/promoters/242/g1/250.html 24 http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/2750-san-xuat-va-tieu-thu-dau-tuong-taiviet-nam-2012-va-mot-so-du-bao.html 25 http://www.agbiotech.com.vn/vn/?mnu=preview&key=122 26 http://www.britannica.com/EBchecked/media/7490/Soybeans 46