Xây dựng qui trình multiplex PCR phát hiện đồng thời HPV (human papilloma virus) và lậu cầu khuẩn (neisseria gonorrhoeae)

Đề tài nghiên cứu trình bày về việc xây dựng qui trình multiplex PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV và neisseria gonorrhoeae có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị, đồng thời cũng sẽ góp phần giảm thiểu tối đa chi phí trong sàng lọc các bệnh nhiễm ở đường sinh dục.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số * 2011 XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) VÀ LẬU CẦU KHUẨN (NEISSERIA GONORRHOEAE) Trần Đăng Thắng*,**, Nguyễn Văn Trương*, Hồ Thị Thanh Thủy***, Nguyễn Thúy Hương** TĨM TẮT Việc xây dựng qui trình multiplex PCR phát đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV Neisseria gonorrhoeae có ý nghĩa quan trọng chẩn đốn điều trị, đồng thời góp phần giảm thiểu tối đa chi phí sàng lọc bệnh nhiễm đường sinh dục Phương pháp: Hệ mồi chúng tơi xây dựng dựa liệu trình tự gien HPV Neisseria gonorrhoeae công bố NCBI khảo sát điều kiện tối ưu cho việc xây dựng qui trình multiplex PCR phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae Kết quả: Hai cặp mồi chúng tơi thiết kế cho quy trình hồn tồn đặc hiệu với trình tự mục tiêu, có hiệu nhân cao độ nhạy hai cặp mồi có nồng độ ngưỡng mà phương pháp xác định đồng thời hai tác nhân gây bệnh x 103 copies/ml Và thử nghiệm thực 30 mẫu bệnh thu nhận Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh Viện Da Liễu có mẫu dương mẫu dương với HPV (13%), mẫu dương tính với Neisseria gonorrhoeae (6%) mẫu đồng nhiễm HPV với Neisseria gonorrhoeae (3%) Kết luận: Từ kết trên, kết luận xây dựng thành cơng quy trình Multiplex –PCR phát đồng thời thời hai tác nhân gây bệnh HPV Neisseria gonorrhoeae Từ khóa: multiplex PCR, Human Papilloma Virus, Neisseria gonorrhoeae ABSTRACT ESTABLISHMENT OF MULTIPLEX PCR ASSAY FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF HUMANPAPILLOMA VIRUS AND NEISSERIA GONORRHOEAE Tran Đang Thang, Nguyen Van Truong, Ho Thi Thanh Thuy, Nguyen Thuy Huong * Y hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 – No – 2011: 172 - 176 Objective: The process construction of multiplex PCR for simultaneous detection of two pathogens Neisseria gonorrhoeae and HPV has important implications for diagnosis and treatment, and will also contribute to minimize the cost of screening genital tract infections Method: Primers were designed basing on the sequence database of HPV and Neisseria gonorrhoeae (NCBI) and we examined optimal conditions for the assay in order to simultaneously detect HPV and Neisseria gonorrhoeae Results: Two primer pairs showed completely specific to the target with a high sensitivity that approached the threshold which could be determined at x 103 copies / ml We have tested these primers on 30 samples collected at Hung Vuong Hospital, and Dermato-Venereological Hospital There were seven positive samples: four samples (13%) positive with HPV, two samples (6%) positive with Neisseria gonorrhoeae and one sample (3%) positive with HPV and Neisseria gonorrhoeae Conclusions: Given such results, we have successfully built a Multiplex-PCR assay for simultaneous  Bệnh viện Hùng Vương *, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Đại Học Bách Khoa **, Cơng ty cổ phần Việt Á*** Tác giả liên lạc: CN Trần Đăng Thắng ĐT: 0908212026 Email: thangxnhv@yahoo.com 174 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số * 2011 Nghiên cứu Y học detection of Neisseria gonorrhoeae and HPV Key words: multiplex PCR, Human Papilloma Virus, Neisseria gonorrhoeae thể ứng dụng hỗ trợ chẩn đoán ĐẶT VẤN ĐỀ điều trị, tiện lợi cho việc phát hai tác Hiện tại, theo ước tính, Việt Nam có khoảng nhân gây bệnh đường sinh dục người, 800.000 đến 1.000.000 người mắc bệnh nhiễm góp phần giảm thiểu chi phí sàng lọc trùng lây qua đường sinh dục năm Trong bệnh nhiễm đường sinh dục đó, HPV Neisseria gonorrhoeae ngày VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP đặc biệt quan tâm Các bệnh gây hậu nghiêm trọng như: Vô sinh, lây Mẫu truyền sang (khi người phụ nữ có thai), Đối chứng dương DNA vi khuẩn N dẫn đến tử vong gonorrhoeae cung cấp từ Trung Tâm Kiểm Trước đây, việc chẩn đoán bệnh HPV Chuẩn Xét Nghiệm Thành Phố (75a Cao Thắng, Neisseria gonorrhoeae chủ yếu Phường 3, Quận 3, TP.HCM) có nồng độ DNA phương pháp truyền thống, phương mẫu 3.107 copies/ml đối chứng dương HPV pháp miễn dịch HPV (Human Papilloma có nồng độ 3.107 copies/ml cung cấp từ Virus) phương pháp nuôi cấy Bệnh Viện Hùng Vương Neisseria gonorrhoeae, phương pháp Ba mươi mẫu phết âm đạo dịch mủ không đủ nhạy, thời gian kéo dài tỏ phận sinh dục thu thập từ Viện Da Liễu, hiệu Bệnh Viện Hùng Vương Hiện tại, giới Việt Nam, kit PCR phát lúc C trachomatis Neisseria gonorrhoeae thương mại hóa Trái lại, kit phát phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae có tiềm năng, Viêt Nam chưa có kit phát đồng thời hai tác nhân Vì nghiên cứu khảo sát điều kiện tối ưu để xây dựng quy trình multiplex PCR phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae Quy trình sau xây dựng thành cơng có Mồi Hai hệ mồi (được tóm tắt bảng 1) sử dụng nghiên cứu chúng tơi thiết kế, dựa vào trình tự porA gene N Gonorrhoeae trình tự gene L1 tất type HPV công bố ngân hàng gene tổng hợp công ty IDT (MỸ) Bảng Kết thiết kế hệ primer-probe Tên Chức Trình tự portA-N.gono portA-N.gono L1-HPV L1-HPV Mồi xuôi Mồi ngược Mồi xuôi Mồi ngược GCCTGCTACTTTCACGCTG GGATCGGTATCACTCGCTCTG CGTCCMARRGGAWACTGATC GCMCAGGGWCATAAYAATGG Phương pháp multiplex PCR DNA từ mẫu dịch phết tế bào âm đạo bệnh nhân ly trích phương pháp sử dụng phenol/chloroform, theo phương pháp Chomczynski & Sacchi (1987): 100 l dịch tế bào thêm vào 900 l Trizol DNA sau tủa Isopropanol với chất trợ tủa Chiều dài (bp) 19 21 20 20 Kích thước sản phẩm PCR (bp) 207 207 455 455 GlycoBlue DNA thu sau tủa cho vào 50µl dung dịch TE 1X dùng pipet trộn phần cặn tan hoàn toàn, bảo quản -20oC sử dụng Phản ứng multiplex PCR thiết lập 20 l gồm: Mix phản ứng, dịch DNA tách chiết, hai cặp mồi portA-N.gonof- portA- 175 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số * 2011 KẾT QUẢ – BÀN LUẬN chứng dương chúng tơi chọn có khả sử dụng tốt phù hợp cho việc khảo sát độ đặc hiệu hai cặp mồi thiết kế Và điều quan trọng nhìn hình điện di chúng tơi nhận thấy giếng 2-4-6-8-10-12-14 cho kết âm tính với hai cặp mồi N gonorrhoeae –HPV Như chúng tơi kết luận hai cặp mồi thiết kế có khả nhân hiệu đặc hiệu với trình tự mục tiêu N gonorrhoeae, HPV mà khơng bắt cặp với trình tự vi sinh vật khác người Hai cặp mồi sử dụng cho quy trình hồn tồn đặc hiệu với trình tự mục tiêu, có hiệu nhân cao Kết khảo sát độ đặc hiệu hai cặp mồi Kết khảo sát độ nhạy quy trình Mồi có độ đặc hiệu cao mồi bắt cặp với trình tự N.gonorrhoeae HPV mà khơng bắt cặp với vi sinh vật khác Và sản phẩm khuếch đại đặc trưng đoạn DNA có kích thước nghiên cứu, sau q trình điện di so với thang DNA chuẩn Để khảo sát độ nhạy quy trình chúng tơi sử dụng nồng độ DNA mẫu x 107 copies/ml Tiến hành pha loãng mẫu theo bậc 10 cho chạy phản ứng PCR cho nồng độ N gonor L1-HPVf- L1-HPVr, H2O (Bio – pure) Các mẫu sử dụng phản ứng gồm: mẫu chứng có nồng độ từ 10 -10 , mẫu thử Chương trình luân nhiệt sau: chu o o o kì 95 C - phút; 40 chu kì 94 C - 30 giây, 50 C - 30 giây, 72oC - 30 giây; chu kỳ 72 oC - phút Giải trình tự Sản phẩm PCR HPV Neisseria gonorrhoeae sau gửi đến cơng ty Macrogen, Hàn quốc để tinh giải trình tự Hình 1: Kết độ đặc hiệu hai cặp mồi Giếng 1: HBV (+); Giếng 2: HBV (-); Giếng 3: HPV& N gonorrhoeae (+); Giếng 4: HPV & N gonorrhoeae (-); Giếng 5: C trachomatis (+); Giếng 6: C trachomatis (-); T: Thang DNA 100bp; Giếng 7: HSV (+); Giếng 8: HSV (-); Giếng 9: DNA Người(+); Giếng 10: DNA Người(-); Giếng 11: MTB (+); Giếng 12: MTB (-) Giếng 13: CMV (+); Giếng 14: CMV (-) Theo hình 1, nhận thấy giếng hai vạch mục tiêu sáng rõ điều có nghĩa hai cặp mồi chúng tơi có khả nhân tốt trình tự mục tiêu, giếng 1-5-7-9-11-13 thấy xuất vạch sáng với vị trí bắt cặp mồi HBV, C trachomatis, HSV, DNA người MTB điều có nghĩa 176 Hình 2: Kết độ nhạy mẫu Giếng 1(107): Nồng độ x 107 copies/ml Giếng 2(106): Nồng độ x 106 copies/ml; Giếng 3(105): Nồng độ x 105 copies/ml; Giếng 4(104): Nồng độ x 104 copies/ml; Giếng 5(103): Nồng độ x 103 copies/ml; Giếng 6(102): Nồng độ x 102 copies/ml; Giếng 7(101): Nồng độ x 101 copies/ml; Giếng T: Thang 100bp Kết hình cho ta thấy, từ giếng đến giếng vạch mục tiêu xuất hiện, giếng (2 x 103 copies/ml) cường độ sáng yếu nhiều đến giếng khơng nhìn thấy vạch mục tiêu xuất hiện, điều chứng tỏ nồng độ ngưỡng mà phương pháp xác định đồng thời hai tác nhân gây bệnh x 103 copies/ml hay nói cách khác với phương Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số * 2011 pháp Multiplex – PCR chúng tơi phát tồn hai tác nhân gây bệnh số lượng chúng mẫu tối thiểu 2x103 copies/ml Kết khảo sát mẫu bệnh thực tế Sau khảo sát điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex –PCR, khảo sát mẫu bệnh thực tế nhiệt độ lai tối ưu 50oC Kết điện di sản phẩm PCR 12 mẫu bệnh phẫm (lơ 1) Hình 3: Kết điện di sản phẩm PCR lô Giếng 1: Chứng Dương; Giếng 2: Chứng Âm Giếng →14: mẫu số đến mẫu số 12; Giếng T: Thang 100 bp Nhìn hình chúng tơi nhận thấy giếng số có xuất vạch sáng ứng với vị trí 207bp 455bp, giếng vạch sáng xuất ứng với vị trí 207 bp giếng số có vạch sáng ứng với vị trí 445 bp Như vậy, kết luận lơ mẫu chúng tơi khảo sát mẫu số đồng nhiễm với HPV N gonorrhoeae, mẫu số dương tính với N gonorrhoeae mẫu số dương tính với HPV Kết điện di sản phẩm PCR 12 mẫu bệnh phẫm (Lô 2) Nghiên cứu Y học Kết điện di hình cho thấy 12 mẫu bệnh phẩm chúng tơi khảo sát có mẫu nằm giếng 13 giếng 19 dương tính với HPV mẫu giếng 15 dương tính với N gonorrhoeae Kết điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh phẫm (Lô3) Theo kết điện di hình cho thấy mẫu bệnh phẩm chúng tơi khảo sát có mẫu nằm giếng 28 dương tính với HPV Hình 5: Kết điện di sản phẩm PCR Lô 3: Giếng (+): Chứng Dương; Giếng (-): Chứng Âm; Giếng T: Thang 280 bp -447 bp -585 bp; Giếng 25→ 30: mẫu 25 đến 30 KẾT LUẬN Như bước đầu xây dựng thành cơng quy trình Multiplex – PCR để phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae với độ đặc hiệu độ nhạy cao Và thử nghiệm thực 30 mẫu bệnh thu nhận Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh Viện Da Liễu có mẫu dương mẫu dương với HPV (13%), mẫu dương tính với Neisseria gonorrhoeae (6%) mẫu đồng nhiễm HPV với Neisseria gonorrhoeae (3%) Bước đầu, kết kiểm chứng lại giải trình tự sản phẩm PCR kết hai phương pháp cho thấy hoàn toàn trùng khớp với TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 4: Kết điện di sản phẩm PCR Lô Giếng (+): Chứng Dương; Giếng (-): Chứng Âm; Giếng T: Thang 280 bp -447 bp -585 bp; Giếng 13→ 24: mẫu 13 đến 24 Cao Thị Bảo Vân (2006) Xây dựng chuẩn hóa kit phát C trachomatis N gonorrhoeae bệnh phẩm Viện Pasteur TP HCM Chernesky M, Freund GG, Hook E III (2007) Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeaeInfections in North American Women by Testing SurePath Liquid-Based Pap 177 Nghiên cứu Y học Specimens in APTIMA Assays Volume 45, pages 2434-2438 Koumans EH (2002) Comparison of Methods for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Using Commercially Available Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium Volume 41, Pages 1507-1511 Mahony JB, Song X, Chong S., Faught M., Salonga T., Kapala J (2001) Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số * 2011 16S rRNA Volume 39, Pages 1429-1425 Nguyễn Hoàng Chương (2005) Xây dựng quy trình PCR phát papillomavirus (hpv) dịch phết âm đạo Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 9, số Whiley PJ, et al (2004) A new confirmatory Neisseria gonorrhoeae real-time PCR assay DM targeting the porA pseudogene TẦN SUẤT NGUY CƠ MẮC TIỀN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ KHẢ NĂNG RÚT NGẮN THỜI GIAN THỰC HIỆN NGHIỆM PHÁP DUNG NẠP GLUCOSE Trần Ngọc Thanh* Nguyễn Thị Lệ** TÓM TẮT Mở đầu: Việt Nam nằm nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) tăng nhanh giới Theo báo cáo Trung tâm dinh dưỡng TPHCM cho biết, có từ 40 - 50% có biến chứng thời điểm chẩn đốn Trong đó, số người 30 tuổi mắc bệnh ngày gia tăng, chí có trẻ 10 tuổi mắc bệnh tỉ lệ mắc tiền ĐTĐ cao Do đó, việc tầm sốt tiền ĐTĐ mang lại ích lợi quan trọng bối cảnh chưa có nhiều nghiên cứu vấn đề Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống ba cách giúp chẩn đoán ĐTĐ cách để phát tiền ĐTĐ Tuy nhiên, thời gian cần cho việc thực nghiệm pháp lâu rào cản việc ứng dụng nghiệm pháp thực tế nên cần thiết phải đánh giá khả cải tiến Mục tiêu: Xác định tần suất rối loạn dung nạp glucose khả rút ngắn thời gian thực nghiệm pháp dung nạp glucose Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu cắt ngang 98 học viên đến thực tập Bộ môn sinh lý học – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Kết quả: Tần suất rối loạn dung nạp glucose (tiền đái tháo đường) 26,5% Tần suất rối loạn dung nạp glucose có liên quan với tiền gia đình mắc tiền đái tháo đường đái tháo đường (RR= 2,69), với việc chơi thể thao (RR= 3,23); Ghi nhận tần suất có gia tăng theo tuổi Có khả rút ngắn thời gian thực nghiệm pháp dung nạp glucose dành cho đối tượng có kết bình thường thời điểm 90 phút tỉ lệ trường hợp rút ngắn 49% Từ khóa: nghiệm pháp dung nạp glucose, đường huyết lúc đói, tiền đái tháo đường, rối loạn dung nạp glucose ABSTRACT PREVALENCE OF PRE-DIABETES BY ORAL GLUCOSE TOLERANCE TEST AND THE PROBABILITY OF SHORTERNING TEST TIME Tran Ngoc Thanh, Nguyen Thi Le * Y hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 – No – 2011: 176 - 182 Background: Vietnam is one of the most increasing prevalence of diabetes mellitus countries According to HCMC Center for Nutrition, approximately 40-50% diabetes patients have had complications at diagnosis The number of under 30 year old patients is increasing with pre-diabetes Therefore, screening and defining the * Bộ môn Sinh Lí Học, Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, ** Bộ moân Sinh Lí Học, Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Thị Lệ ĐT: 0903311507 Email: bs.nguyenthile@gmail.com 178 ... phát phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae có tiềm năng, Viêt Nam chưa có kit phát đồng thời hai tác nhân Vì nghiên cứu khảo sát điều kiện tối ưu để xây dựng quy trình multiplex PCR phát đồng. .. phát đồng thời HPV Neisseria gonorrhoeae Quy trình sau xây dựng thành cơng có Mồi Hai hệ mồi (được tóm tắt bảng 1) sử dụng nghiên cứu thiết kế, dựa vào trình tự porA gene N Gonorrhoeae trình tự... Chương (2005) Xây dựng quy trình PCR phát papillomavirus (hpv) dịch phết âm đạo Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 9, số Whiley PJ, et al (2004) A new confirmatory Neisseria gonorrhoeae real-time PCR assay