Đề tài đặt vấn đề và đưa ra mục tiêu nghiên cứu sau: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp chúng kháng carbapenem. Xây dựng qui trình evagreen real‐time PCR phát hiện các gen blaoxa ở acinetobacter baumannii
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUI TRÌNH EVAGREEN REAL‐TIME PCR PHÁT HIỆN CÁC GEN blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII Nguyễn Tuấn Anh*, Huỳnh Minh Tuấn**, Nguyễn Văn Vĩnh Châu***, Hồ Huỳnh Thùy Dương*,**** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp chúng kháng carbapenem. Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình real‐time PCR phát hiện các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Phương pháp: Qui trình được xây dựng từ khâu thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi, xác định thành phần và chương trình real‐time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản các gene blaOXA‐23/‐51/‐58. Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy (1,42x100‐1,42x101 bản sao/μl) và độ đặc hiệu cao. Kết luận: Chúng tơi đã xây dựng thành cơng qui trình EvaGreen real‐time PCR phát hiện các nhóm gene OXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Qui trình có thể được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii mang các gene này và tiềm năng trở thành cơng cụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các gene blaOXA ở A. baumannii trong mơi trường bệnh viện. bla Từ khóa: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen ABSTRACT DEVELOPMENT OF AN EVAGREEN REAL‐TIME PCR PROTOCOL FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII Nguyen Tuan Anh, Huynh Minh Tuan, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 197 ‐ 201 Backgrounds: Acinetobacter baumannii currently is the most leading and dangerous factor causing nosocomial infections for their multidrug resistant traits. Aspecially, A. baumannii harbours blaOXA genes with ability of producing carbapenemase, helping them resist to carbapenem, the so‐called present strongest antibiotic, commonly used in multidrug resistant bacterial infections. Objectives: To set up and optimize an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23, ‐51, ‐58 genes in A. baumannii Methods: The process was constructed through basic steps: specific primer design and experimental check, optimization of real‐time PCR components and temperature program using the intercalating dye, EvaGreen, and finally evaluating the specificity and sensitivity of the system. Results: The results showed that the protocol could be used to detect correctly blaOXA‐23/‐51/‐58 genes specific to A. baumannii with high specificity and sensitivity. Conclusions: We built up successfully an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23/‐ 51/‐58 genes in A. baumannii. The protocol can also be used to identify rapidly strains of A. baumannii possessing these genes and potentially becomes a tool to study blaOXA‐owning A. baumannii infection * Cơng ty TNHH CNSH Khoa Thương *** Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp.HCM. Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Tuấn Anh ** Khoa Kiểm sốt Nhiễm khuẩn, BV ĐH Y Dược Tp.HCM **** Bộ mơn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh , ĐT: 091 7 429 336 , Email: ntanhbio@gmail.com Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 197 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 epidemiology in different hospitals or geographical areas. Keywords: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen một số enzyme trong nhóm này có hoạt tính ĐẶT VẤN ĐỀ thủy phân carbapenem(10). Các enzyme OXA có Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trực khả năng thủy phân carbapenem được chia khuẩn Gram (‐) không lên men glucose, đang thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được trở thành tác nhân nhiễm trùng bệnh viện phát hiện ở A. baumaniii là OXA‐23(9), OXA‐ nguy hiểm nhất, đặc biệt ở những bệnh viện 24(2), OXA‐51(11), OXA‐58(13). đơng bệnh nhân(2,1). Vì sự xuất hiện và gia tăng Dịch tễ phân tử cho thấy các nhóm gen những chủng A. baumannii đa kháng thuốc, blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A. carbapenem được lựa chọn để điều trị khi baumannii mang nhóm gene blaOXA‐23 phổ biến nhiễm những chủng này. Carbapenem, điển ở United Kingdom, Brazil, Argentina, China, hình là imipenem và meropenem, có phổ hoạt Korea, Singapore, Vietnam, USA, Libya, tính rất rộng, kháng lại vi sinh vật Gram (+) và Pakistan, Australia và Columbia(7,15). Các chủng Gram (‐), bao gồm cả vi khuẩn yếm khí. Đặc A. baumannii với nhóm gene blaOXA‐58 được biệt, carbapenem là lựa chọn để điều trị những phát hiện đầu tiên ở Pháp và hiện nay đã xuất trường hợp nhiễm khuẩn nặng, có biểu hiện hiện ở Argentina, Colombia, Bolivia, Chile, kháng β‐lactamase phổ rộng (ESBL) và AmpC Venezuela, Spain, Turkey, Romania, United β‐lactamase(4,9). Kingdom, Italy, Poland, Switzerland, Germany, Carbapenem thuộc nhóm kháng sinh β‐ Ireland, Portugal, Hungary, Bulgaria, Greece, lactam, bao gồm penicillin, cephalosporin và USA, Oceania và Asia(7,12). Nhóm gene blaOXA‐24 carbapenem, là nhóm kháng sinh quan trọng, ban đầu là nhóm ít phổ biến hơn các nhóm còn được sử dụng để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi lại, nhưng hiện đã xuất hiện ở Brazil, Taiwan, nhiều loại vi khuẩn, trong đó có A. baumannii, vì France, Croatia, Chile, Spain, Belgium, Czech tính hiệu quả và an tồn; ngồi ra hoạt tính của Republic, USA và Iran(17). Một số chủng A. nhóm kháng sinh này dễ dàng được tăng lên baumannii kháng với carbepenem với vai trò chủ nhờ những cải biến trong cấu trúc phân tử(10,9). yếu là của nhóm gene blaOXA‐51. Nhóm gene Nhóm kháng sinh này hoạt động kìm hãm sinh này được cho là tồn tại tự nhiên gần như ở tất cả trưởng và phân chia tế bào vi khuẩn bằng cách các chủng A. baumannii(2,16). bất hoạt peptidoglycan transpeptidase(1), enzyme Carbapenemase phổ biến nhất ở A. có vai trò quan trọng trong hình thành mạng baumannii là β‐lactamase mã hóa bởi blaOXA(17). lưới peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn. Sự Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình phát bất hoạt enzyme này dẫn đến làm chết tế bào vi hiện các gene blaOXA‐23, ‐51, ‐58 phục vụ cho khuẩn. Tuy nhiên, enzyme β‐lactamase là mục đích nghiên cứu dịch tễ học phân tử và cơ enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, với hoạt tính chế biểu hiện của những gene này. Từ đó, có cơ phân hủy kháng sinh β‐lactam, có vai trò bảo vệ sở để xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ vi khuẩn khỏi kháng sinh và cũng là nguyên cao gây nhiễm trùng bệnh viện. nhân chính dẫn đến tính kháng đối với nhóm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU kháng sinh này. Enzyme β‐lactamase được phân chia thành bốn nhóm phân tử riêng biệt, gồm lớp A, B, C và D, dựa trên tính tương đồng về trình tự amino acid. Oxacillinase (OXA) là β‐lactamase lớp D, có đặc tính thủy phân oxacillin nhanh hơn hơn penicillin hoặc benzylpenicillin(3). Điều đặc biệt, 198 Vật liệu Vi khuẩn A. baumannii chuẩn (ATCC 19606) mang gene OXA‐51 và các mẫu vi khuẩn A. baumannii được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị ở bệnh viện Đại học Y Dược Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 12/2013. Thiết kế mồi Các cặp mồi đặc hiệu cho từng nhóm gene OXA‐23, ‐51, ‐58 và một cặp mồi đặc hiệu cho gene 16S rRNA của A. baumannii (Bảng 1) làm Bảng 1. Trình tự các mồi được thiết kế bla Mồi OXA23-F OXA23-R OXA51-F OXA51-R OXA58-F OXA58-R IC-F IC-R Trình tự mồi (5’ 3’) CACTAGGAGAAGCCATGAAGC CAGCATTACCGAAACCAATACG GAAGTGAAGCGTGTTGGTTATG GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT ATATTTAAGTGGGATGGAAAGCC CGTGCCAATTCTTGATATACAGG CCAGTGACAAACTGGAGGAAG GCTGTGTAGCAACCCTTTGTA Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được thu nhận và tăng sinh trong môi trường LB ở điều kiện 370C trong 24 giờ. Sau khi kết thúc tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết “DNA column‐based extraction kit” (Khoa Thương). Tất cả mọi thao tác đều được thực hiện theo đúng hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng EvaGreen real‐time PCR Hỗn hợp phản ứng EvaGreen real‐time PCR có thành phần gồm 1X AptaTaq Fast DNA polymerase (Roche), 200 nM cho từng cặp mồi xuôi và ngược (IDT) OXA23‐F/R, OXA51‐F/R, OXA23-F/R đối chứng nội phản ứng được thiết kế và đánh giá bằng một số phần mềm sinh học phân tử chuyên dụng như PrimerQuest, Oligo Analyzer, Annhyb, và Blast (NCBI). Mồi được đặt tổng hợp tại cơng ty IDT (Integrated DNA Technologies, USA). Kích thước (bp) 21 22 22 20 23 23 21 21 Phương pháp tách chiết DNA của A. baumannii OXA51-F/R Nghiên cứu Y học Tmmồi (oC) 54.9 54.8 54.4 54.3 53.4 54.6 55.5 55.2 Sản phẩm (bp) 114 Tmsản phẩm (oC) 72.7 148 71.7 110 70.5 199 70.0 OXA58‐F/R hoặc IC‐F/R, 1X EvaGreen (Biotium), 5μl DNA trong tổng thể tích là 25μl. Chu trình nhiệt cho phản ứng EvaGreen real‐time PCR: 40 chu kỳ gồm 15 giây ‐ 95oC và 15 giây ‐ 60oC. Chương trình phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tương ứng với q trình tăng nhiệt độ từ 65oC lên 95oC, mỗi bước tăng 0,5oC và lưu trong 20 giây. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hiệu quả nhân bản của mồi Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen real‐time PCR trên mẫu DNA tách chiết từ vi khuẩn A. baumannii sau tăng sinh. Các mẫu vi khuẩn này đã được xác định sở hữu các gene blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình tự gene. OXA58-F/R IC-F/R Hình 1. Hiệu quả nhân bản của mồi Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ một đỉnh chảy đặc trưng tương ứng với mỗi cặp mồi, không hiện diện các đỉnh chảy (sản phẩm) ký sinh. Như Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học vậy, bộ mồi thiết kế hoạt động nhân bản hiệu quả trong phản ứng PCR. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các sản phẩm nhân bản trình tự gen 199 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Nghiên cứu Y học OXA23 (114 bp), OXA51 (148 bp), OXA58 (110 bp) và IC (199 bp) tương ứng được xác định là 80,0oC; 78,5oC; 78,5oC và 84,0oC. Như vậy, căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy đặc trưng có thể nhận diện được các sản phẩm nhân bản của các cặp mồi tương ứng. Tính đặc hiệu của mồi Tính đặc hiệu của các cặp mồi được kiểm tra với DNA đặc trưng của A. baumannii và của OXA23-F/R OXA51-F/R các vi khuẩn khác như E. coli (ATCC 25922, 35218, 35401), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella typhimurium (ATCC 29946), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802), Shigella sonnei (ATCC 29030), Shigella flexneri (ATCC 15391), Shigella boydii (ATCC 8700). OXA58-F/R IC-F/R Hình 2. Tính đặc hiệu của mồi Kết quả cho thấy các cặp mồi OXA23‐F/R, OXA51‐F/R và OXA58‐F/R đặc hiệu với những đỉnh chảy đặc trưng, khơng nhân bản DNA của các vi khuẩn khơng phải là A. baumanniii (Hình 2). Riêng với cặp mồi OXA58‐F/R, đỉnh chảy ở nhiệt độ 71oC được xác định là của nhị phân mồi (primer‐dimer). Cặp mồi IC‐F/R được thiết kế đặc hiệu với 16S rRNA của A. baumannii, khơng đặc hiệu với 16S rRNA của các vi khuẩn khác. Vì thế, phản ứng kém với DNA của vi khuẩn khác, thể hiện qua tín hiệu định lượng thấp (khơng thể hiện ở đây) và những đỉnh chảy với nhiệt độ khơng đặc trưng. Tối ưu hóa nhiệt độ lai (Ta) Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi 200 50,0 28,8 30,3 33,8 31,8 51,0 28,7 29,7 33,4 31,6 53,0 28,2 29,6 32,1 31,1 55,9 27,4 29,3 31,9 29,2 59,5 26,6 28,5 30,4 28,8 Tối ưu hóa nồng độ mồi Thí nghiệm được tiến hành với 3 nghiệm thức 1, 2 và 3 với nồng độ mồi lần lượt là 100, 200 và 300 nM. Bốn loại mồi được tối ưu riêng rẽ. Nhiệt độ lai sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ như trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy. Bảng 3: Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi Chúng tơi khảo sát các nhiệt độ lai từ 50,0oC đến 65,0oC, bao gồm các nhiệt độ sau: 50,0oC; 51,0oC; 53,0oC; 55,9 oC; 59,5oC; 62,5oC; 64,1oC; 65,0oC. Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. Tiêu chí tối ưu là giá trị Ct của phản ứng real‐time PCR càng nhỏ càng tốt. Ta (oC) OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R Kết quả cho thấy khoảng nhiệt độ lai phù hợp cho cả bốn cặp mồi là từ 59,5oC đến 65,0oC. Với khoảng nhiệt độ này, phản ứng nhân bản trên cả bốn cặp mồi cho hiệu quả ổn định, giá trị Ct thấp và các đỉnh chảy phân tách rõ ràng. Nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 62,5oC. 62,5 26,9 28,1 30,1 28,6 64,1 26,8 27,3 30,2 28,5 65,0 27,1 28,5 30,3 28,1 Nghiệm thức OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 31,4±0,7 34,7±0,2 36,6±0,6 32,6±0,4 29,2±0,1 30,3±0,1 33,2±0,5 29,6±0,3 28,9±0,1 30,1±0,1 32,2±0,6 28,8±0,1 Kết quả (Bảng 3) cho thấy với mỗi mẫu thử, giá trị Ct ở nồng độ mồi 200 và 300 nM tương đương nhau và ln tốt hơn giá trị Ct của nồng độ mồi 100nM. Vì vậy, nồng độ mồi 200 nM được chọn tối ưu cho mỗi loại mồi khảo sát, do lượng cần dùng trong phản ứng ít hơn. Độ nhạy của phản ứng Để kiểm tra độ nhạy của phản ứng EvaGreen real‐time PCR, thí nghiệm được tiến Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 hành với DNA tách chiết từ mẫu tế bào vi khuẩn A. baumannii sau tăng sinh (1.42x106 bản sao/μl), được pha lỗng theo bậc 10. Điều kiện phản ứng sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy. Bảng 4: Giá trị Ct khảo sát độ nhạy của phản ứng EvaGreen real‐time PCR Mẫu Nồng độ* OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 1.42x105 15,2±0,4 16,2±0,5 19,2±0,4 16,0±0,5 1.42x10 18,2±0,1 19,5±0,3 22,4±0,2 19,2±1,0 1.42x103 21,7±0,1 23,2±0,1 26,7±0,8 23,6±0,6 1.42x102 24,7±0,3 26,5±0,0 29,5±0,5 26,8±0,9 1.42x101 28,9±0,2 31,0±0,1 33,8±0,8 31,5±0,3 1.42x100 33,4±0,7 35,2±0,3 N/A 36,0±0,6 (*) đơn vị nồng độ: bản sao/μl Bush K, Jacoby GA, and Medeiros AA (1995). A functional classification scheme for beta‐lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 39(6), p. 1211‐33. Donald HM, et al. (2000). Sequence analysis of ARI‐1, a novel OXA beta‐lactamase, responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii 6B92. Antimicrob Agents Chemother 44(1), p. 196‐9. Green DW (2002). The bacterial cell wall as a source of antibacterial targets. Expert Opin Ther Targets 6(1), p. 1‐19. Heritier C, et al. (2005). Characterization of the naturally occurring oxacillinase of Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(10), p. 4174‐9. Higgins PG, et al. (2010). Global spread of carbapenem‐ resistant Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 65(2), p. 233‐8. Livermore DM and Woodford N (2006). The beta‐lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. Trends Microbiol 14(9), p. 413‐20. Nicolau DP (2008). Carbapenems: a potent class of antibiotics. Expert Opin Pharmacother 9(1), p. 23‐37. Nordmann P and Poirel L (2002). Emerging carbapenemases in Gram‐negative aerobes. Clin Microbiol Infect 8(6), p. 321‐ 31. Peleg AY, Seifert H, and Paterson DL (2008). Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev 21(3), p. 538‐82. Poirel L and Nordmann P (2006). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clin Microbiol Infect 12(9), p. 826‐36. Poirel L, et al. (2005). OXA‐58, a novel class D {beta}‐lactamase involved in resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(1), p. 202‐8. Theaker C, Azadian B, and Soni N (2003). The impact of Acinetobacter baumannii in the intensive care unit. Anaesthesia 58 (3), p. 271‐4. Turton JF, et al. (2005). Detection and typing of integrons in epidemic strains of Acinetobacter baumannii found in the United Kingdom. J Clin Microbiol 43(7), p. 3074‐82. Turton JF, et al. (2006). Identification of Acinetobacter baumannii by detection of the blaOXA‐51‐like carbapenemase gene intrinsic to this species. J Clin Microbiol 44(8), p. 2974‐6. Zarrilli R, et al. (2009). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of an emerging problem in health care facilities. J Infect Dev Ctries 3(5), p. 335‐41. Kết quả (Bảng 4) cho thấy phản ứng EvaGreen real‐time PCR đối với mồi OXA23‐ F/R, OXA51‐F/R và IC‐F/R cho tín hiệu dương tính ổn định với mẫu DNA có nồng độ 1.42x100 bản sao/μl; Trong khi đó, tín hiệu dương tính của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng độ 1.42x101 bản sao/μl. KẾT LUẬN 10 11 12 13 Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm gene blaOXA‐23, blaOXA‐51 và blaOXA‐58 của vi khuẩn A. baumannii. Quy trình có thể được ứng dụng để khảo sát dịch tễ học phân tử các gene này ở các chủng A. baumannii khác nhau trong lâm sàng và hỗ trợ trong chẩn đoán nhiễm A. baumannii ở người bệnh như là một chọn lựa bổ sung bên cạnh quy trình ni cấy truyền thống. 14 15 16 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bonfiglio G, Russo G, and Nicoletti G (2002). Recent developments in carbapenems. Expert Opin Investig Drugs 11(4), p. 529‐44. Bou G, Oliver A, and Martinez‐Beltran J (2000). OXA‐24, a novel class D beta‐lactamase with carbapenemase activity in an Acinetobacter baumannii clinical strain. Antimicrob Agents Chemother 44(6), p. 1556‐61. Nghiên cứu Y học Ngày nhận bài báo: Ngày phản biện nhận xét bài báo: Ngày bài báo được đăng: 05/9/2014 29/9/2014 20/10/2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 201 ... của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng độ 1.42x101 bản sao/μl. KẾT LUẬN 10 11 12 13 Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm gene blaOXA 23, blaOXA 51 và blaOXA 58 ... từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen real‐time PCR trên mẫu DNA tách chiết từ vi khuẩn A. baumannii sau tăng sinh. Các mẫu vi khuẩn này đã được xác định sở hữu các gene blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình ... thấy các nhóm gen những chủng A. baumannii đa kháng thuốc, blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A. carbapenem được lựa chọn để điều trị khi baumannii mang nhóm gene blaOXA 23 phổ biến