Xây dựng qui trình evagreen real‐time PCR phát hiện các gen blaoxa ở acinetobacter baumannii

Đề tài đặt vấn đề và đưa ra mục tiêu nghiên cứu sau: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp chúng kháng carbapenem. Xây dựng qui trình evagreen real‐time PCR phát hiện các gen blaoxa ở acinetobacter baumannii

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUI TRÌNH EVAGREEN REAL‐TIME PCR   PHÁT HIỆN CÁC GEN blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII  Nguyễn Tuấn Anh*, Huỳnh Minh Tuấn**, Nguyễn Văn Vĩnh Châu***, Hồ Huỳnh Thùy Dương*,****  TĨM TẮT  Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính  đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene  blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp  chúng kháng carbapenem.   Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình real‐time PCR phát hiện các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 ở A.  baumannii.  Phương  pháp: Qui trình được xây dựng từ khâu thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi, xác định  thành phần và chương trình real‐time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản các gene blaOXA‐23/‐51/‐58.  Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 đặc trưng  của A. baumannii với độ nhạy (1,42x100‐1,42x101 bản sao/μl) và độ đặc hiệu cao.   Kết luận: Chúng tơi đã xây dựng thành cơng qui trình EvaGreen real‐time PCR phát hiện các nhóm gene  OXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Qui trình có thể được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii  mang các gene này và tiềm năng trở thành cơng cụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các gene  blaOXA ở A. baumannii trong mơi trường bệnh viện.  bla Từ khóa: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen  ABSTRACT  DEVELOPMENT OF AN EVAGREEN REAL‐TIME PCR PROTOCOL   FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII  Nguyen Tuan Anh, Huynh Minh Tuan, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 197 ‐ 201  Backgrounds:  Acinetobacter  baumannii  currently  is  the  most  leading  and  dangerous  factor  causing  nosocomial infections for their multidrug resistant traits. Aspecially, A. baumannii harbours  blaOXA genes with  ability of producing carbapenemase, helping them resist to carbapenem, the so‐called present strongest antibiotic,  commonly used in multidrug resistant bacterial infections.  Objectives: To set up and optimize an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23, ‐51,  ‐58 genes in A. baumannii   Methods: The process was constructed through basic steps: specific primer design and experimental check,  optimization of real‐time PCR components and temperature program using the intercalating dye, EvaGreen, and  finally evaluating the specificity and sensitivity of the system.  Results:  The  results  showed  that  the  protocol  could  be  used  to  detect  correctly  blaOXA‐23/‐51/‐58  genes  specific to A. baumannii with high specificity and sensitivity.  Conclusions: We built up successfully an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23/‐ 51/‐58  genes  in  A.  baumannii.  The  protocol  can  also  be  used  to  identify  rapidly  strains  of  A.  baumannii  possessing  these  genes  and  potentially  becomes  a  tool  to  study  blaOXA‐owning  A.  baumannii  infection  * Cơng ty TNHH CNSH Khoa Thương       *** Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp.HCM.  Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Tuấn Anh  ** Khoa Kiểm sốt Nhiễm khuẩn, BV ĐH Y Dược Tp.HCM  **** Bộ mơn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh  , ĐT: 091 7 429 336  , Email: ntanhbio@gmail.com  Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 197 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 epidemiology in different hospitals or geographical areas.  Keywords: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen  một  số  enzyme  trong  nhóm  này  có  hoạt  tính  ĐẶT VẤN ĐỀ  thủy  phân  carbapenem(10).  Các  enzyme  OXA  có  Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trực  khả  năng  thủy  phân  carbapenem  được  chia  khuẩn  Gram  (‐)  không  lên  men  glucose,  đang  thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được  trở  thành  tác  nhân  nhiễm  trùng  bệnh  viện  phát  hiện  ở  A.  baumaniii  là  OXA‐23(9),  OXA‐ nguy  hiểm  nhất,  đặc  biệt  ở  những  bệnh  viện  24(2), OXA‐51(11), OXA‐58(13).   đơng bệnh nhân(2,1). Vì sự xuất hiện và gia tăng  Dịch  tễ  phân  tử  cho  thấy  các  nhóm  gen  những  chủng  A.  baumannii  đa  kháng  thuốc,  blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A.  carbapenem  được  lựa  chọn  để  điều  trị  khi  baumannii mang nhóm gene  blaOXA‐23 phổ biến  nhiễm  những  chủng  này.  Carbapenem,  điển  ở  United  Kingdom,  Brazil,  Argentina,  China,  hình là imipenem và meropenem, có phổ hoạt  Korea,  Singapore,  Vietnam,  USA,  Libya,  tính rất rộng, kháng lại vi sinh vật Gram (+) và  Pakistan,  Australia  và  Columbia(7,15).  Các  chủng  Gram  (‐),  bao  gồm  cả  vi  khuẩn  yếm  khí.  Đặc  A.  baumannii  với  nhóm  gene  blaOXA‐58  được  biệt, carbapenem là lựa chọn để điều trị những  phát  hiện  đầu  tiên  ở  Pháp  và  hiện  nay  đã  xuất  trường  hợp  nhiễm  khuẩn  nặng,  có  biểu  hiện  hiện  ở  Argentina,  Colombia,  Bolivia,  Chile,  kháng β‐lactamase phổ rộng (ESBL) và AmpC  Venezuela,  Spain,  Turkey,  Romania,  United  β‐lactamase(4,9).   Kingdom,  Italy,  Poland,  Switzerland,  Germany,  Carbapenem  thuộc  nhóm  kháng  sinh  β‐ Ireland,  Portugal,  Hungary,  Bulgaria,  Greece,  lactam,  bao  gồm  penicillin,  cephalosporin  và  USA, Oceania và Asia(7,12). Nhóm gene blaOXA‐24  carbapenem,  là  nhóm  kháng  sinh  quan  trọng,  ban đầu là nhóm ít phổ biến hơn các nhóm còn  được sử dụng để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi  lại,  nhưng  hiện  đã  xuất  hiện  ở  Brazil,  Taiwan,  nhiều loại vi khuẩn, trong đó có A. baumannii, vì  France,  Croatia,  Chile,  Spain,  Belgium,  Czech  tính hiệu quả và an tồn; ngồi ra hoạt tính của  Republic,  USA  và  Iran(17).  Một  số  chủng  A.  nhóm  kháng  sinh  này  dễ  dàng  được  tăng  lên  baumannii kháng với carbepenem với vai trò chủ  nhờ  những  cải  biến  trong  cấu  trúc  phân  tử(10,9).  yếu  là  của  nhóm  gene  blaOXA‐51.  Nhóm  gene  Nhóm kháng sinh này hoạt động kìm hãm sinh  này được cho là tồn tại tự nhiên gần như ở tất cả  trưởng và phân chia tế bào vi khuẩn bằng cách  các chủng A. baumannii(2,16).   bất hoạt peptidoglycan transpeptidase(1), enzyme  Carbapenemase  phổ  biến  nhất  ở  A.  có  vai  trò  quan  trọng  trong  hình  thành  mạng  baumannii  là  β‐lactamase  mã  hóa  bởi  blaOXA(17).  lưới peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn. Sự  Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình phát  bất hoạt enzyme này dẫn đến làm chết tế bào vi  hiện  các  gene  blaOXA‐23,  ‐51,  ‐58  phục  vụ  cho  khuẩn.  Tuy  nhiên,  enzyme  β‐lactamase  là  mục đích nghiên cứu dịch tễ học phân tử và cơ  enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, với hoạt tính  chế biểu hiện của những gene này. Từ đó, có cơ  phân hủy kháng sinh β‐lactam, có vai trò bảo vệ  sở để xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ  vi  khuẩn  khỏi  kháng  sinh  và  cũng  là  nguyên  cao gây nhiễm trùng bệnh viện.  nhân  chính  dẫn  đến  tính  kháng  đối  với  nhóm  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  kháng sinh này.   Enzyme  β‐lactamase  được  phân  chia  thành  bốn nhóm phân tử riêng biệt, gồm lớp A, B, C và  D,  dựa  trên  tính  tương  đồng  về  trình  tự  amino  acid. Oxacillinase (OXA) là β‐lactamase lớp D, có  đặc  tính  thủy  phân  oxacillin  nhanh  hơn  hơn  penicillin  hoặc  benzylpenicillin(3).  Điều  đặc  biệt,  198 Vật liệu  Vi  khuẩn  A. baumannii chuẩn (ATCC 19606)  mang  gene  OXA‐51  và  các  mẫu  vi  khuẩn  A.  baumannii  được  phân  lập  từ  bệnh  phẩm  của  bệnh nhân điều trị ở bệnh viện Đại học Y Dược  Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  TP.  Hồ  Chí  Minh  trong  thời  gian  từ  tháng  01/2012 đến tháng 12/2013.  Thiết kế mồi  Các  cặp  mồi  đặc  hiệu  cho  từng  nhóm  gene  OXA‐23, ‐51, ‐58 và một cặp mồi đặc hiệu cho  gene  16S  rRNA  của  A.  baumannii  (Bảng  1)  làm  Bảng 1. Trình tự các mồi được thiết kế  bla Mồi OXA23-F OXA23-R OXA51-F OXA51-R OXA58-F OXA58-R IC-F IC-R Trình tự mồi (5’ 3’) CACTAGGAGAAGCCATGAAGC CAGCATTACCGAAACCAATACG GAAGTGAAGCGTGTTGGTTATG GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT ATATTTAAGTGGGATGGAAAGCC CGTGCCAATTCTTGATATACAGG CCAGTGACAAACTGGAGGAAG GCTGTGTAGCAACCCTTTGTA Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được  thu  nhận  và  tăng  sinh  trong  môi  trường  LB  ở  điều  kiện  370C  trong  24  giờ.  Sau  khi  kết  thúc  tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được  tách  chiết  theo  nguyên  tắc  hấp  phụ  đặc  hiệu  lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết  “DNA  column‐based  extraction  kit”  (Khoa  Thương).  Tất  cả  mọi  thao  tác  đều  được  thực  hiện  theo  đúng  hướng  dẫn  trong  bộ  kit  của  nhà sản xuất.  Thành phần phản ứng EvaGreen real‐time  PCR  Hỗn hợp phản ứng EvaGreen real‐time PCR  có  thành  phần  gồm  1X  AptaTaq  Fast  DNA  polymerase  (Roche),  200  nM  cho  từng  cặp  mồi  xuôi  và  ngược  (IDT)  OXA23‐F/R,  OXA51‐F/R,  OXA23-F/R đối chứng nội phản ứng được thiết kế và đánh  giá  bằng  một  số  phần  mềm  sinh  học  phân  tử  chuyên dụng như PrimerQuest, Oligo Analyzer,  Annhyb,  và  Blast  (NCBI).  Mồi  được  đặt  tổng  hợp  tại  cơng  ty  IDT  (Integrated  DNA  Technologies, USA).  Kích thước (bp) 21 22 22 20 23 23 21 21 Phương  pháp  tách  chiết  DNA  của  A.  baumannii  OXA51-F/R Nghiên cứu Y học Tmmồi (oC) 54.9 54.8 54.4 54.3 53.4 54.6 55.5 55.2 Sản phẩm (bp) 114 Tmsản phẩm (oC) 72.7 148 71.7 110 70.5 199 70.0 OXA58‐F/R hoặc IC‐F/R, 1X EvaGreen (Biotium),  5μl  DNA  trong  tổng  thể  tích  là  25μl.  Chu  trình  nhiệt cho phản ứng EvaGreen real‐time PCR: 40  chu  kỳ  gồm  15  giây  ‐  95oC  và  15  giây  ‐  60oC.  Chương trình phân tích nhiệt độ nóng chảy của  sản phẩm tương ứng với q trình tăng nhiệt độ  từ  65oC  lên  95oC,  mỗi  bước  tăng  0,5oC  và  lưu  trong 20 giây.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Hiệu quả nhân bản của mồi  Chúng  tôi  kiểm  tra  hiệu  quả  nhân  bản  của  từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen  real‐time  PCR  trên  mẫu  DNA  tách  chiết  từ  vi  khuẩn  A.  baumannii  sau  tăng  sinh.  Các  mẫu  vi  khuẩn  này  đã  được  xác  định  sở  hữu  các  gene  blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình  tự gene.  OXA58-F/R IC-F/R  Hình 1. Hiệu quả nhân bản của mồi  Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ một đỉnh chảy  đặc  trưng  tương  ứng  với  mỗi  cặp  mồi,  không  hiện diện các đỉnh chảy (sản phẩm) ký sinh. Như  Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học vậy,  bộ  mồi  thiết  kế  hoạt  động  nhân  bản  hiệu  quả  trong  phản  ứng  PCR.  Nhiệt  độ  nóng  chảy  (Tm)  của  các  sản  phẩm  nhân  bản  trình  tự  gen  199 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Nghiên cứu Y học  OXA23  (114  bp),  OXA51  (148  bp),  OXA58  (110  bp)  và IC  (199  bp) tương  ứng  được xác  định  là  80,0oC; 78,5oC; 78,5oC và 84,0oC. Như vậy, căn cứ  vào  nhiệt  độ  nóng  chảy  đặc  trưng  có  thể  nhận  diện  được  các  sản  phẩm  nhân  bản  của  các  cặp  mồi tương ứng.   Tính đặc hiệu của mồi  Tính  đặc  hiệu  của  các  cặp  mồi  được  kiểm  tra với DNA đặc trưng của A. baumannii và của  OXA23-F/R OXA51-F/R các  vi  khuẩn  khác  như  E.  coli  (ATCC  25922,  35218,  35401),  Pseudomonas  aeruginosa  (ATCC  27853),  Klebsiella  pneumoniae  (ATCC  700603),  Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella  typhimurium  (ATCC  29946),  Staphylococcus  aureus  (ATCC  12600),  Vibrio  parahaemolyticus  (ATCC  17802),  Shigella  sonnei  (ATCC  29030),  Shigella  flexneri  (ATCC  15391),  Shigella  boydii  (ATCC 8700).  OXA58-F/R IC-F/R Hình 2. Tính đặc hiệu của mồi  Kết  quả  cho  thấy  các  cặp  mồi  OXA23‐F/R,  OXA51‐F/R  và  OXA58‐F/R  đặc  hiệu  với  những  đỉnh chảy đặc trưng, khơng nhân bản DNA của  các vi khuẩn khơng phải là A. baumanniii (Hình  2).  Riêng  với  cặp  mồi  OXA58‐F/R,  đỉnh  chảy  ở  nhiệt độ 71oC được xác định là của nhị phân mồi  (primer‐dimer).  Cặp  mồi  IC‐F/R  được  thiết  kế  đặc hiệu với 16S rRNA của A. baumannii, khơng  đặc hiệu với 16S rRNA của các vi khuẩn khác. Vì  thế, phản ứng kém với DNA của vi khuẩn khác,  thể hiện qua tín hiệu định lượng thấp (khơng thể  hiện  ở  đây)  và  những  đỉnh  chảy  với  nhiệt  độ  khơng đặc trưng.  Tối ưu hóa nhiệt độ lai (Ta)  Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi  200 50,0 28,8 30,3 33,8 31,8 51,0 28,7 29,7 33,4 31,6 53,0 28,2 29,6 32,1 31,1 55,9 27,4 29,3 31,9 29,2 59,5 26,6 28,5 30,4 28,8 Tối ưu hóa nồng độ mồi   Thí  nghiệm  được  tiến  hành  với  3  nghiệm  thức  1,  2  và  3  với  nồng  độ  mồi  lần  lượt  là  100,  200  và  300  nM.  Bốn  loại  mồi  được  tối  ưu  riêng  rẽ.  Nhiệt  độ  lai  sử  dụng  như  đã  tối  ưu  ở  trên.  Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ như  trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy.  Bảng 3: Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi  Chúng  tơi  khảo  sát  các  nhiệt  độ  lai  từ  50,0oC  đến  65,0oC,  bao  gồm  các  nhiệt  độ  sau:  50,0oC;  51,0oC;  53,0oC;  55,9  oC;  59,5oC;  62,5oC;  64,1oC;  65,0oC.  Mẫu  DNA  A.  baumannii  sử  dụng có nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. Tiêu chí  tối ưu là giá trị Ct của phản ứng real‐time PCR  càng nhỏ càng tốt.  Ta (oC) OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R Kết  quả  cho  thấy  khoảng  nhiệt  độ  lai  phù  hợp cho cả bốn cặp mồi là từ 59,5oC đến 65,0oC.  Với  khoảng  nhiệt  độ  này,  phản  ứng  nhân  bản  trên cả bốn cặp mồi cho hiệu quả ổn định, giá trị  Ct  thấp  và  các  đỉnh  chảy  phân  tách  rõ  ràng.  Nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 62,5oC.  62,5 26,9 28,1 30,1 28,6 64,1 26,8 27,3 30,2 28,5 65,0 27,1 28,5 30,3 28,1 Nghiệm thức OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 31,4±0,7 34,7±0,2 36,6±0,6 32,6±0,4 29,2±0,1 30,3±0,1 33,2±0,5 29,6±0,3 28,9±0,1 30,1±0,1 32,2±0,6 28,8±0,1 Kết quả (Bảng 3) cho thấy với mỗi mẫu thử,  giá  trị  Ct  ở  nồng  độ  mồi  200  và  300  nM  tương  đương nhau và ln tốt hơn giá trị Ct của nồng  độ  mồi  100nM.  Vì  vậy,  nồng  độ  mồi  200  nM  được chọn tối ưu cho mỗi loại mồi khảo sát, do  lượng cần dùng trong phản ứng ít hơn.  Độ nhạy của phản ứng  Để  kiểm  tra  độ  nhạy  của  phản  ứng  EvaGreen  real‐time  PCR,  thí  nghiệm  được  tiến  Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  hành với DNA tách chiết từ mẫu tế bào vi khuẩn  A. baumannii sau tăng sinh (1.42x106 bản sao/μl),  được pha lỗng theo bậc 10. Điều kiện phản ứng  sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mỗi mẫu được lập  lại 3 lần chạy.  Bảng 4: Giá trị Ct khảo sát độ nhạy của phản ứng  EvaGreen real‐time PCR  Mẫu Nồng độ* OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 1.42x105 15,2±0,4 16,2±0,5 19,2±0,4 16,0±0,5 1.42x10 18,2±0,1 19,5±0,3 22,4±0,2 19,2±1,0 1.42x103 21,7±0,1 23,2±0,1 26,7±0,8 23,6±0,6 1.42x102 24,7±0,3 26,5±0,0 29,5±0,5 26,8±0,9 1.42x101 28,9±0,2 31,0±0,1 33,8±0,8 31,5±0,3 1.42x100 33,4±0,7 35,2±0,3 N/A 36,0±0,6 (*) đơn vị nồng độ: bản sao/μl  Bush  K,  Jacoby  GA,  and  Medeiros  AA  (1995).  A  functional  classification  scheme  for  beta‐lactamases  and  its  correlation  with  molecular  structure.  Antimicrob  Agents  Chemother  39(6), p. 1211‐33.  Donald HM, et al. (2000). Sequence analysis of ARI‐1, a novel  OXA  beta‐lactamase,  responsible  for  imipenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii  6B92.  Antimicrob  Agents  Chemother 44(1), p. 196‐9.  Green  DW  (2002).  The  bacterial  cell  wall  as  a  source  of  antibacterial targets. Expert Opin Ther Targets 6(1), p. 1‐19.  Heritier  C,  et  al.  (2005).  Characterization  of  the  naturally  occurring  oxacillinase  of  Acinetobacter  baumannii.  Antimicrob Agents Chemother 49(10), p. 4174‐9.  Higgins  PG,  et  al.  (2010).  Global  spread  of  carbapenem‐ resistant  Acinetobacter  baumannii.  J  Antimicrob  Chemother  65(2), p. 233‐8.  Livermore  DM  and  Woodford  N  (2006).  The  beta‐lactamase  threat  in  Enterobacteriaceae,  Pseudomonas  and  Acinetobacter. Trends Microbiol 14(9), p. 413‐20.  Nicolau DP (2008). Carbapenems: a potent class of antibiotics.  Expert Opin Pharmacother 9(1), p. 23‐37.  Nordmann P and Poirel L (2002). Emerging carbapenemases  in  Gram‐negative  aerobes.  Clin  Microbiol  Infect  8(6),  p.  321‐ 31.  Peleg  AY,  Seifert  H,  and  Paterson  DL  (2008).  Acinetobacter  baumannii:  emergence  of  a  successful  pathogen.  Clin  Microbiol Rev 21(3), p. 538‐82.  Poirel  L  and  Nordmann  P  (2006).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology.  Clin Microbiol Infect 12(9), p. 826‐36.  Poirel L, et al. (2005). OXA‐58, a novel class D {beta}‐lactamase  involved  in  resistance  to  carbapenems  in  Acinetobacter  baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(1), p. 202‐8.  Theaker  C,  Azadian  B,  and  Soni  N  (2003).  The  impact  of  Acinetobacter  baumannii  in  the  intensive  care  unit.  Anaesthesia 58 (3), p. 271‐4.  Turton  JF,  et  al.  (2005).  Detection  and  typing  of  integrons  in  epidemic  strains  of  Acinetobacter  baumannii  found  in  the  United Kingdom. J Clin Microbiol 43(7), p. 3074‐82.  Turton  JF,  et  al.  (2006).  Identification  of  Acinetobacter  baumannii by detection of the blaOXA‐51‐like carbapenemase  gene intrinsic to this species. J Clin Microbiol 44(8), p. 2974‐6.  Zarrilli  R,  et  al.  (2009).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of  an  emerging  problem  in  health  care  facilities.  J  Infect  Dev  Ctries 3(5), p. 335‐41.  Kết  quả  (Bảng  4)  cho  thấy  phản  ứng  EvaGreen  real‐time  PCR  đối  với  mồi  OXA23‐ F/R,  OXA51‐F/R  và  IC‐F/R  cho  tín  hiệu  dương  tính ổn định với mẫu DNA có nồng độ 1.42x100  bản  sao/μl;  Trong  khi  đó,  tín  hiệu  dương  tính  của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng  độ 1.42x101 bản sao/μl.  KẾT LUẬN  10 11 12 13 Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình  EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm  gene  blaOXA‐23,  blaOXA‐51  và  blaOXA‐58  của  vi  khuẩn A. baumannii. Quy trình có thể được ứng  dụng  để  khảo  sát  dịch  tễ  học  phân  tử  các  gene  này  ở  các  chủng  A. baumannii  khác  nhau  trong  lâm  sàng  và  hỗ  trợ  trong  chẩn  đoán  nhiễm  A.  baumannii ở người bệnh như là một chọn lựa bổ  sung bên cạnh quy trình ni cấy truyền thống.   14 15 16 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Bonfiglio  G,  Russo  G,  and  Nicoletti  G  (2002).  Recent  developments  in  carbapenems.  Expert  Opin  Investig  Drugs  11(4), p. 529‐44.  Bou  G,  Oliver  A,  and  Martinez‐Beltran  J  (2000).  OXA‐24,  a  novel  class  D  beta‐lactamase with carbapenemase  activity in  an  Acinetobacter  baumannii  clinical  strain.  Antimicrob  Agents Chemother 44(6), p. 1556‐61.    Nghiên cứu Y học   Ngày nhận bài báo:      Ngày phản biện nhận xét bài báo:  Ngày bài báo được đăng:    05/9/2014    29/9/2014  20/10/2014    Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 201 ... của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng  độ 1.42x101 bản sao/μl.  KẾT LUẬN  10 11 12 13 Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm  gene  blaOXA 23,  blaOXA 51  và  blaOXA 58 ... từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen real‐time PCR trên  mẫu  DNA  tách  chiết  từ  vi  khuẩn  A.  baumannii sau  tăng  sinh.  Các mẫu  vi  khuẩn  này  đã  được  xác  định  sở  hữu  các gene  blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình ... thấy  các nhóm  gen những  chủng  A.  baumannii đa  kháng  thuốc,  blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A.  carbapenem  được  lựa  chọn  để  điều  trị  khi  baumannii mang nhóm gene  blaOXA 23 phổ biến