Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 và PSA trong nước tiểu. Quy trình có thể được sử dụng để định lượng mRNA PCA3 và PSA. Cần tiến hành thử nghiệm trên nhiều mẫu bệnh để xác định giá trị ngưỡng của chỉ số PCA3 nhằm ứng dụng trong tầm soát UTTLT.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI mRNA PCA3 VÀ PSA TRONG NƯỚC TIỂU Huỳnh Nhã Vân*, Lê Phúc Liên**, Trần Lê Linh Phương**, Hồ Huỳnh Thùy Dương*** TÓM TẮT Tổng quan: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) gene mã hóa mRNA đặc hiệu cho tiền liệt tuyến biểu cao ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) Tỉ lệ nồng độ mRNA PCA3 PSA (ProstateSpecific Antigen) nước tiểu, số PCA3, chứng minh có độ đặc hiệu với UTTLT cao so với xét nghiệm PSA huyết Mục tiêu: Xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 PSA nước tiểu Phương pháp: Quy trình multiplex xây dựng dựa monoplex PCA3 PSA tối ưu hóa thông số nhiệt độ lai nồng độ mồi Sau đó, quy trình multiplex thử nghiệm mẫu nước tiểu bệnh nhân số PCA3 tính dựa theo cơng thức cơng bố Kết quả: Quy trình multiplex real-time RT-PCR có hiệu nhân đạt 90-105% với hệ số xác định (R2) đường chuẩn đạt > 0,980 PCA3 PSA phát định lượng 100% mẫu bệnh nhân Kết luận: Quy trình sử dụng để định lượng mRNA PCA3 PSA Cần tiến hành thử nghiệm nhiều mẫu bệnh để xác định giá trị ngưỡng số PCA3 nhằm ứng dụng tầm soát UTTLT Từ khóa: PCA3, PSA, mRNA, số PCA3, ung thư tiền liệt tuyến ABSTRACT ESTABLISHMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR FOR SIMULTANEOUS QUANTITATION OF URINE PCA3 AND PSA mRNA Huynh Nha Van, Le Phuc Lien, Tran Le Linh Phuong, Ho Huynh Thuy Duong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 83 - 87 Introduction: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) encodes a prostate-specific mRNA that has been shown to be up-regulated in prostate cancer (PCa) PCA3 score, the ratio of PCA3 mRNA copies to PSA (ProstateSpecific Antigen) mRNA copies in urine, has been shown to have higher PCa specificity compared to serum PSA test Objectives: The present study aimed to establish a multiplex real-time RT-PCR for quantification of PCA3 and PSA mRNA Methods: Multiplex real-time RT-PCR was constructed based on PCA3 and PSA singleplex with optimized annealing temperature and primer concentrations The multiplex assay was then tested on patients’ urine samples and PCA3 score was calculated Results: Multiplex amplification efficiencies were between 90-105% with coefficient of determination (R2) of more than 0.980 PCA3 and PSA mRNA were detected and quantified in 100% urine samples Conclusions: Further study on larger population is necessary to determine PCA3 score cut-off value for Công ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM Tác giả liên lạc: ThS Huỳnh Nhã Vân ĐT: 0932140123 Email: huynhnhavan@gmail.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2016 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 PCa screening Key words: PCA3, PSA, mRNA, PCA3 score, prostate cancer gene xem có biểu tương đối ổn ĐẶT VẤN ĐỀ định tế bào TLT(2) Các thử nghiệm đề Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) dạng xuất để đo hàm lượng mRNA PCA3 ung thư phổ biến thứ hai nguyên nhân PSA sử dụng phương pháp nhân tử vong ung thư đứng hàng thứ sáu nam mRNA luân nhiệt hay đẳng nhiệt real-time giới giới Tuy nhiên, tỷ lệ mắc UTTLT RT-PCR, TMA (Transcription Mediated thay đổi theo khu vực địa lý, với tỉ lệ cao Amplification), NASBA (Nucleic Acid nước phát triển gồm Châu Úc, Bắc Mỹ, Sequence-Based Amplification) tiến hành Châu Âu; tỉ lệ thấp thuộc nước nước tiểu Kit PROGENSA® PCA3 (GenBắc Phi, Đơng Nam Á Mặc dù vậy, tỉ lệ Probe) dựa nguyên lý phương pháp TMA mắc phải có khuynh hướng gia tăng FDA cấp phép dùng xét nghiệm phần lớn quốc gia(1) Tại Việt Nam, tỉ lệ UTTLT Mỹ mắc phải tăng từ 2,47 lên 4,7/100.000 người từ Nhằm ứng dụng sàng lọc UTTLT năm 2000 đến 2010(3) Việt Nam, chúng tơi tiến hành xây dựng quy Việc tầm sốt UTTLT chủ yếu dựa vào kết trình định lượng mRNA PCA3 PSA thăm khám trực tràng (DRE - Digital phương pháp real-time RT-PCR với mẫu dò Rectal Examination) xét nghiệm đo nồng Taqman độ PSA (Prostate-Specific Antigen) VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP máu Tuy nhiên, nhược điểm lớn xét nghiệm PSA đặc hiệu cho TLT, Mồi mẫu dò khơng đặc hiệu cho UTTLT Một số thị Trình tự mồi mẫu dò sử dụng cho phản sinh học đề xuất gần cho chẩn đoán ứng PCA3: mồi xuôi 5’sớm UTTLT AMACR (AlphaGGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’, mồi Methylacyl-CoA Racemase), EPCA (Early ngược 5’-GGGCGAGGCTCATCGAT-3’ mẫu Prostate Cancer Antigen), EPCA2 (Early dò 5’-(FAM)-AGAAATGCCCGGCCGCCATCProstate Cancer Antigen-2), GSTP1 (3IABkFQ)-3’ [5] Trình tự mồi mẫu dò sử (glutathione S-transferase pi 1), APC dụng cho phản ứng PSA: mồi xuôi 5’(adenomatous polyposis coli), PCA3 (Prostate GCCCACTGCATCAGGAACAA-3’, mồi ngược cancer antigen 3), thể nối gene TMPRSS2:ERG 5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’, mẫu (Transmembrane protease, serine v-ets dò 5’-(Cy5)avian erythroblastosis virus E26 oncogene AGGCTGTGCCGACCCAGCAAGATChomolog) (4) cho có giá trị chẩn đốn (3IAbRQSp)-3’ [8] Mồi mẫu dò tổng cao PSA Trong đó, thử nghiệm đo số hợp cung cấp công ty IDT (Integrated PCA3 nước tiểu đưa vào chẩn DNA Technologies, Mỹ) đoán lâm sàng với giá trị chẩn đoán dương từ Khảo sát điều kiện PCR 59,4 – 97,4% giá trị chẩn đoán âm từ 87,8 – Phản ứng monoplex ban đầu gồm: 250 nM 98%(6) mồi loại, 200 nM mẫu dò, µl DNA chuẩn, Do gene PCA3 khơng có protein tương ứng, µl Apta Taq DNA Master (Roche) nước tăng biểu PCA3 xác định cất cho đủ 25 µl phản ứng Chương trình nhiệt thơng qua hàm lượng mRNA PCA3 Hàm PCR gồm 40 chu kỳ với nhiệt độ 950C 30 lượng mRNA PCA3 đồng quy hóa giây nhiệt độ bắt cặp phút sử dụng (normalized) với hàm lượng mRNA PSA, 84 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 máy Stratagene Technologies, Mỹ) Mx3000P (Agilent Mẫu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm oligonucleotide có trình tự sản phẩm nhân phản ứng tổng hợp nhân tạo cung cấp IDT (Integrated DNA Technologies, Mỹ) Quy trình xử lý mẫu – tách chiết RNA – phiên mã ngược RT Mẫu cung cấp từ Phòng khám Tiết niệu - Bệnh viện Đại học Y dược Tp.HCM Nước tiểu sau thu bảo quản 40C xử lý ngày 30 ml nước tiểu ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút 40C Cặn sau ly tâm rửa lần với 10 ml PBS 1X pH ly tâm 5000 vòng/phút phút 40C Cặn sau tách chiết RNA sử dụng Kit tách chiết RNA tủa (AccuRive pRNA Prep Kit, EXRNA01.1A, công ty TNHH CNSH Khoa Thương) Mẫu RNA sau phiên mã ngược (RT – reverse transcription) thành cDNA sử dụng AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit (Agilent Technologies, Mỹ) Quy trình tách chiết RNA phản ứng RT theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Điều kiện PCR phản ứng monoplex Chúng tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp nồng độ mồi tối ưu phản ứng (monoplex) để từ chọn điều kiện tốt để sử dụng phản ứng mulitplex Chỉ tiêu để đánh giá giá trị Ct thể trị số trung bình ± độ chênh lệch (standard deviation) Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Mẫu sử dụng cho thí nghiệm mẫu chuẩn pha loãng nồng độ 1000 sao/phản ứng Kết giá trị Ct phản ứng PSA nhiệt độ bắt cặp 55, 58, 60, 62 650C 27,69 ± 0,49; 26,98 ± 0,64; 31,00 ± 2,09; 29,69 ± 2,93; 31,76 ± 2,53 Ở phản ứng PCA3, giá trị Ct nhiệt độ bắt cặp 55, 57, 59, 61, 630C 32,05 ± Nghiên cứu Y học 0,85; 33,56 ± 0,47; 32,82 ± 0,90; 32,63 ± 0,70; 31,98 ± 0,51 Kết cho thấy nhiệt độ 58-590C, phản ứng cho giá trị Ct thấp nên chọn nhiệt độ tương đối 580C cho thí nghiệm Phản ứng monoplex PSA có giá trị Ct thấp nồng độ 150 nM Trong đó, phản ứng monoplex PCA3, giá trị Ct cải thiện từ nồng độ 350-750 nM (Bảng 1) Để giảm thiểu tương tác phản ứng multiplex chọn nồng độ mồi thấp có giá trị Ct cải thiện 350 nM Bảng Giá trị Ct trung bình nồng độ mồi khảo sát Nồng độ mồi (nM) PSA (Ct) PCA3 (Ct) 150 250 350 450 550 650 750 Chứng âm 27,41 ± 0,12 28,51 ± 0,16 28,59 ± 0,61 28,60 ± 0,35 28,03 ± 0,35 28,25 ± 0,34 28,10 ± 0,38 (-) 32,58 ± 0,57 32,88 ± 0,54 31,79 ± 0,42 31,94 ± 0,64 31,80 ± 0,46 31,57 ± 0,44 31,61 ± 0,61 (-) Xây dựng phản ứng multiplex Sau chọn nhiệt độ bắt cặp nồng độ mồi cho mulitplex, tiến hành so sánh giá trị Ct phản ứng multiplex với monoplex Chúng sử dụng hỗn hợp mẫu chuẩn có nồng độ 103 105 sao/phản ứng gồm mẫu chuẩn PSA PCA3 theo tỉ lệ 1:1 làm mẫu khảo sát thí nghiệm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết (bảng 2) cho thấy giá trị Ct phản ứng monoplex real-time PCR multiplex real-time PCR khơng có khác biệt đáng kể Do đó, chúng tơi khơng tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa phản ứng multiplex realtime PCR PSA, PCA3 mà sử dụng điều kiện phản ứng monoplex Bảng Giá trị Ct phản ứng monoplex phản ứng multiplex Monoplex Multiplex 25,50 ± 0,39 26,26 ± 0,37 19,00 ± 0,29 19,39 ± 0,27 10 PSA 10 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2016 85 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Monoplex Multiplex 33,36 ± 0,53 33,47 ± 0,36 26,10 ± 0,48 26,20 ± 0,80 10 PCA3 10 Tiếp theo, khảo sát hiệu phản ứng multiplex với đường chuẩn thiết lập từ hỗn hợp mẫu chuẩn có nồng độ từ 102 đến 105 sao/phản ứng Tiêu chí đánh giá quy trình đạt hiệu phản ứng PCA3 PSA multiplex nằm khoảng 90-105% hệ số xác định đường chuẩn R2 > 0,980 Kết hình cho thấy hiệu phản ứng PSA PCA3 multiplex 102,0% 96,3% với hệ số xác định đường chuẩn 0,999 0,998 Các giá trị phù hợp với yêu cầu đường chuẩn real-time RT-PCR Hình Đường chuẩn phản ứng PCA3 (FAM) PSA (Cy5) multiplex mRNA “gene giữ nhà” PSA sử dụng Thử nghiệm quy trình mẫu bệnh để đồng quy hóa (normalize) quy trình nhân lượng tế bào TLT thu nhận sau DRE(2) Quy trình multiplex thử nghiệm Số lượng mRNA PCA3 PSA mẫu nước tiểu bệnh nhân phì đại tiền liệt phản ứng xác định phương tuyến mẫu ung thư tiền liệt tuyến thu nhận pháp hồi quy tuyến tính dựa đường chuẩn sau thăm khám trực tràng (DRE – chạy song song với mẫu bệnh nhân Mỗi Digital rectal exam) mẫu lặp lại lần Các giá trị thể Hai marker PCA3 PSA biểu bên trị số trung bình ± độ chênh lệch Chỉ số tế bào TLT xuất nồng độ PCA3 tính theo cơng thức nồng độ thấp nước tiểu Khi có tác động lên TLT PCA3×1000/nồng độ PSA(7) (ví dụ thao tác thăm khám DRE), tế bào Giá trị Ct số lượng mRNA PCA3 TLT bong vận chuyển vào niệu PSA phản ứng thể bảng đạo, nhờ phần nước tiểu sau DRE mRNA PCA3 PSA phát 6/6 chứa marker TLT nồng độ cao Tuy mẫu nước tiểu Chỉ số PCA3 trung bình nhóm nhiên, lượng mRNA PCA3 nước tiểu khơng ung thư (phì đại tiền liệt tuyến) nhóm biến thiên nên việc định lượng PCA3 riêng UTTLT 68,2 158,0 lẻ khơng có ý nghĩa mặt chẩn đốn Do đó, 86 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Bảng Số lượng mRNA PCA3 PSA phản ứng số PCA3 STT Ct 32,73 ± 0,05 34,28 ± 0,37 32,05 ± 0,06 29,42 ± 0,23 33,78 ± 0,28 29,55 ± 0,16 BPH: Phì đại tiền liệt tuyến PCA3 Số mRNA/ phản ứng 124 ± 44 ± 11 197 ± 1159 ± 176 62 ± 11 1062 ± 111 Ct 26,70 ± 0,17 27,79 ± 0,22 26,97 ± 0,07 24,77 ± 0,06 26,94 ± 0,06 26,08 ± 0,05 KẾT LUẬN Quy trình sử dụng để định lượng mRNA PCA3 PSA từ tính tốn số PCA3 ứng dụng sàng lọc UTTLT Quy trình cần thử nghiệm thêm số lượng mẫu lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Chỉ số PCA3 Kết giải phẫu bệnh 55,4 42,3 107,0 133,5 32,6 307,8 BPH BPH BPH PCa PCa PCa PCa: Ung thư tiền liệt tuyến Như vậy, quy trình real-time RT-PCR đề tài phát định lượng thành công mRNA PCA3 PSA Chỉ số PCA3 cho thấy có khác tương đối bệnh nhân UTTLT không ung thư Tuy nhiên, cần thử nghiệm thêm quần thể mẫu lớn để tìm giá trị ngưỡng thích hợp cho quy trình real-time RT-PCR PSA Số mRNA/ phản ứng 2237 ± 258 1043 ± 161 1840 ± 89 8680 ± 346 1888 ± 88 3452 ± 120 Center MM., Jemal A., Lortet-Tieulent J., Ward E., Ferlay J., Brawley O., Bray F (2012) International Variation in Prostate Cancer Incidence and Mortality Rates European Urology, 61: 1079-1092 Hessels D., Klein Gunnewiek JMT., van Oort I., Karthaus HFM., van Leenders GJL., van Balken B., Kiemeney LA., Witjes JA., Schalken JA (2003) DD3PCA3-based Molecular UrineAnalysis for the Diagnosis of Prostate Cancer European Urology, 44: 8-16 Hoang VD, Lee AH., Nguyen HN., Nguyen Q., Vu LC., Binns CW (2014) Epidemiology and prevention of prostate cancer in Vietnam Asian Pac J Cancer Prev, 15(22): 97479751 Madu CO., Lu Y (2010) Novel diagnostic biomarkers for prostate cancer J Cancer, 1: 150–177 Mearini E., Antognelli C., Del Buono C., Cochetti G., Giannantoni A., Nardelli E., Talesa VN (2009) The combination of urine DD3PCA3 mRNA and PSA mRNA as molecular markers of prostate cancer Biomarkers,14(4): 235243 Ruiz-Aragon J., Marquez-Pelaez S (2010) Assessment of the PCA3 test for prostate cancer diagnosis: a systematic review and meta-analysis Actas urologicas espanolas, 34: 346-355 Shappell SB., Fulmer J., Arguello D., Wright BS., Oppenheimer JR., and Putzi MJ (2009) PCA3 Urine mRNA Testing for Prostate Carcinoma: Patterns of Use by Community Urologists and Assay Performance in Reference Laboratory Setting Urology, 73: 363-368 Shen M., Chen W., Yu K., Chen Z., Zhou W., Lin X., Weng Z., Li C., Wu X., Tao Z (2011) The diagnostic value of PCA3 gene-based analysis of urine sediments after digital rectal examination for prostate cancer in a Chinese population Experimental and Molecular Pathology, 90: 97-100 Ngày nhận báo: 10/03/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/03/2016 Ngày báo đăng: 25/03/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2016 87 ... phản ứng PCA3 (FAM) PSA (Cy5) multiplex mRNA “gene giữ nhà” PSA sử dụng Thử nghiệm quy trình mẫu bệnh để đồng quy hóa (normalize) quy trình nhân lượng tế bào TLT thu nhận sau DRE(2) Quy trình multiplex... trị Ct số lượng mRNA PCA3 TLT bong vận chuyển vào niệu PSA phản ứng thể bảng đạo, nhờ phần nước tiểu sau DRE mRNA PCA3 PSA phát 6/6 chứa marker TLT nồng độ cao Tuy mẫu nước tiểu Chỉ số PCA3 trung... 2010(3) Việt Nam, tiến hành xây dựng quy Việc tầm sốt UTTLT chủ yếu dựa vào kết trình định lượng mRNA PCA3 PSA thăm khám trực tràng (DRE - Digital phương pháp real-time RT-PCR với mẫu dò Rectal