Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời betamethason, clotrimazol và methylparaben bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tiết kiệm thời gian, dung môi và hóa chất.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI BETAMETHASON, CLOTRIMAZOL VÀ METHYLPARABEN TRONG DƯỢC PHẨM Phan Thanh Dũng* TÓM TẮT Mở đầu: Hỗn hợp betamethason (BET) clotrimazol (CLO) thường sử dụng dạng bào chế thuốc mỡ, kem…dùng điều trị nấm da, viêm da dị ứng Để bảo quản dạng chế phẩm thường sử dụng methylparaben (MPB) làm chất bảo quản Ngoài việc định lượng hoạt chất việc kiểm sốt hàm lượng chất bảo quản dạng bào chế quan trọng Hiện nay, chưa có quy trình định lượng đồng thời ba chất Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời betamethason, clotrimazol methylparaben phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tiết kiệm thời gian, dung mơi hóa chất Đối tượng –Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng cột Ecipse C18 (250 mm × 4,6 mm, m) với điều kiện đẳng dòng methanol - đệm pH 7,0 (70 : 30), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, đầu dò UV, bước sóng phát 254 nm, nhiệt độ cột 35 oC Phương pháp thẩm định theo ICH áp dụng lên chế phẩm thị trường Kết quả: Đã tách hoàn toàn chất là: methyparaben (tr = 2,3 phút), betamethason (tr = 12,9 phút) clotrimazol (tr = 16,4 phút) Khoảng tuyến tính khoảng 36,35 – 84,82 μg/ml (MPB), 22,62 – 52,77 μg/ml (BET) 369,69 – 836,78 μg/ml (CLO) với hệ số tương quan r > 0, 999 Độ thu hồi nằm khoảng 98 – 102%, độ lặp lại hàm lượng chất thu có RSD < 2% Kết luận: Đã xây dựng thành cơng quy trình định lượng betamethason, clotrimazol metylparaben với điều kiện đẳng dòng đơn giản, tiết kiệm thời gian, hóa chất, dung mơi Phương pháp thẩm định áp dụng lên chế phẩm ngồi thị trường áp dụng lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc Từ khóa: Betamethason; Clotrimazol; Methylparaben; HPLC ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF BETAMEHTASONE, CLOTRIMAZOLE AND METHYLPARABEN IN PHARMACEUTICAL DOSAGE FORM BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Phan Thanh Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 371 - 377 Introduction: Betamethasone (BET) and clotrimazole (CLO) are often used in dosage form such as ointments, creams… to treat skin fungus, allergic dermatitis To preserve these dosage forms, often using methylparaben (MPB) as a preservative In addition to quantifying the active ingredient concentration, the control of preservatives in dosage forms is also important Today, quantitative assay of these compounds were often conducted separately Objective: To develop a method for simultaneous determination of betamethasone, clotrimazole and methylparaben by HPLC Materials and method: These compounds were separated on C18 column (250 x 4.6 mm i.d., size m) with isocratic eluent, methanol – buffer pH 7.0 (70: 30), flow rate 1.5 ml/min, UV detection at wavelengths of 254 nm, temperature 35oC The method was validated according to ICH guidelines and applied to assay in cream dosage *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Phan Thanh Dũng ĐT: 0983.957.158 Chuyên Đề Dược Email: dungpharm@yahoo.com 371 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 form without any interference from excipients Results: Completely separated three compounds: methylparaben (tr= 2.3 min), betamethasone (tr = 12.9 min) and clotrimazole (tr = 16.4 min) The linearity for all the drugs was obtained in the range of 36.35 – 84.82 μg/ml (MPB), 22.62 – 52.77 μg/ml (BET) and 369.69 – 836.78 μg/ml (CLO) with the correlation coefficients of linearity > 0.999 The recovery was in range 98 – 102%, the repeatability of content of these compounds had RSD < 2% Conclusion: An assay method for betamethasone, clotrimazole and methylparaben was successfully developed with simple isocratic elution The method was validated and applied on pharmaceuticals form so can apply on quality control section Key words: Betamethasone; Clotrimazole; Methylparaben, HPLC QT101 060114, hàm lượng: 99,38%; methyl ĐẶT VẤN ĐỀ paraben số lô: QT128 050114, hàm lượng: 99,65% Hỗn hợp betamethason clotrimazol Nguồn gốc: Viện Kiểm Nghiệm Tp.HCM thường sử dụng dạng bào chế Dung mơi hố chất thuốc mỡ, kem…dùng điều trị nấm Diamoni hydrophosphat, acid phosphoric, da, viêm da dị ứng Để bảo quản dạng chế ethanol tuyệt đối đạt tiêu chuẩn phân phẩm thường sử dụng methylparaben làm tích.Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký chất bảo quản Ngoài việc định lượng hoạt lỏng chất việc kiểm sốt hàm lượng chất bảo quản quan trọng Tuy nhiên, chưa có tài liệu nước định lượng đồng thời ba chất Để góp phần vào việc đánh giá chất lượng dạng bào chế chứa thành phần này, phương pháp HPLC phát triển để định lượng đồng thời betamethason, clotrimazol methyparaben Phương pháp thẩm định theo ICH gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng,độ lặp lại độ thô ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm thuốc kem DID-PROLAC Công ty cổ phần dược phẩm Boston Viêt Nam cung cấp Thành phần cho tuýp kem: Trang thiết bị Máy HPLC Shimadzu CBM 20 Alite (Pump LC-20AD, Autosampler SIL-20A, Oven CTO10AS VP, Detector SPD-M20A) – Nhật với phần mềm xử lý số liệu LC solutions Cân phân tích AX-200, độ xác 0.1 mg – Nhật Cột Eclipse hạt nhồi C18 (250 mm × 4,6 mm, m) – Mỹ Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu xác dùng phân tích Phương pháp nghiên cứu Điều kiện sắc ký Cột Eclipse hạt nhồi C18 (250 mm × 4,6 mm, m) – Mỹ Pha động: Methanol – đệm pH 7,0 tỉ lệ (70 : 30) Gentamicin sulfat: 15 mg Bước sóng phát hiện: 254 nm Bethamethason dipropionat: 9,6 mg Tốc độ dòng (Fr): 1,5 ml/ phút Clotrimazol: 150 mg Nhiệt độ cột: 35oC Tá dược: vừa đủ15 g Thể tích tiêm mẫu: 20 l Dung mơi hố chất trang thiết bị Chất chuẩn Betamethason dipropionat, số lô: QT087 060713, hàm lượng: 97,65%; clotrimazol số lô: 372 Dung môi pha mẫu (DMPM): Ethanol tuyệt đối Dung dịch chuẩn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Hòa tan lượng xác chất chuẩn DMPM để nồng độ methyl paraben, betamethason clotrimazol tương ứng khoảng 60 μg/ml, 38 μg/ml 600 μg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 μm Dung dịch thử Hòa tan lượng xác mẫu thử DMPM, đặt cách thủy 60 oC để kem tan chảy, để nguội thêm DMPM đủ thể tích định mức Làm lạnh, thu lấy dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 m, siêu âm đuổi khí Dung dịch thử có nồng độ methyl paraben, betamethason clotrimazol tương ứng khoảng 60 μg/ml, 38 μg/ml 600 μg/ml Đánh giá kết Dựa vào diện tích pic methyl methyl paraben, betamethason clotrimazol sắc ký đồ mẫu thử so với mẫu chuẩn, hàm lượng chất chuẩn; tính hàm lượng g chế phẩm Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp Qua tham khảo tài liệu(2-4) khảo sát: thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng (bảng 1) xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben, betamethason clotrimazol Sắc ký đồ thu mẫu trắng, mẫu tá dược, mẫu chuẩn, mẫu thử thể hình 1, 2, Trên sắc ký đồ hình cho thấy pic tách rõ với thời gian lưu tương ứng methyparaben (tr = 2,3 phút), betamethason (tr = 12,9 phút) clotrimazol (tr = 16,4 phút), hình dáng gọn đối xứng Như vậy, việc lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp Bảng 1: Các điều kiện khảo sát Điều kiện khảo sát Acetonitril – đệm pH 7.0 (60 : 40), Fr=1,0 ml/phút,nhiệt độ phòng Acetonitril – đệm pH 7.0 (55 : 45), Fr=1,0 ml/phút, nhiệt độ phòng o Methanol – đệm pH 7.0 (60 : 40), Fr= 1,0 ml/phút, 35 C o Methanol – đệm pH 7.0 (60 : 40), Fr= 1,2 ml/phút, 35 C o Methanol – đệm pH 7.0 (70 : 30), Fr= 1,5 ml/phút, 35 C Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 2: Sắc ký đồ mẫu tá dược Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thử thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại độ thơ Thẩm định phương pháp phân tích Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn ICH(1) gồm: Tính đặc hiệu, tính tương Chuyên Đề Dược Tính đặc hiệu 373 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Tiến hành tiêm mẫu trắng, mẫu tá dược, mẫu chuẩn mẫu thử vào hệ thống sắc ký -Mẫu trắng: Ethanol tuyệt đối -Mẫu placebo: Xử lý tương tự dung dịch thử -Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ methyl paraben, betamethason dipropionat clotrimazol tương ứng khoảng 60 μg/ml, 38 μg/ml 600 μg/ml DMPM Lọc qua màng lọc 0,45 μm -Mẫu thử: Cân khoảng 3,0 g kem vào cốc 50 ml, thêm khoảng 30 ml dung môi pha mẫu, đặt bể điều nhiệt 60oC để kem tan chảy, cho vào bình định mức 50 ml, tráng cốc DMPM cho vào bình định mức 50 ml Làm lạnh, thu lấy dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 m, siêu âm đuổi khí Dung dịch thử có nồng độ methyl paraben, betamethason dipropionat clotrimazol tương ứng khoảng 60 μg/ml, 38 μg/ml 600 μg/ml Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo thời gian lưu pic khơng xuất pic khác (hình 1, 2) Các pic sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với mẫu chuẩn (hình 3, 4) Độ tính khiết pic > 0,99 Như vậy, phương pháp có tính đặc hiệu với chất cần phân tích Tính thích hợp hệ thống Tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn hỗn hợp methyl paraben, betamethason dipropionat clotrimazol tương ứng nồng độ khoảng 60 μg/ml, 38 μg/ml 600 μg/ml Bảng 2: Kết tương thích hệ thống tr S T TB 2,297 5021046 1,412 Methylparaben RSD 0,17 0,10 0,41 TB 12,886 724848 1,035 Betamethason RSD 0,14 0,07 0,13 TB 16,403 1015308 1,136 Clotrimazol RSD 0,13 0,11 0,15 N 1416 1,78 5399 0,23 7576 0,34 Rs 22,3 0,23 4,8 0,00 đối (RSD) < 2% Như hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng đồng thời methyl paraben, betamethason clotrimazol Tính tuyến tính Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm mức nồng độ từ 60 -140% Lần lượt tiêm vào hệ thống sắc ký Kết thống kê bảng Bảng 3: Kết khoảng tuyến tính Methylparaben Betamethason Clotrimazol Hệ số tương 1,0000 0,9999 1,0000 quan Hệ số B 82809 19291 1681 Giá trị t 490,2 173,1 504,6 hệ số B Hệ số Bo 842,3 231,8 244,8 Giá trị t 0,07 0,05 0,12 hệ số Bo Giá trị F 240309,7 29947,1 254604 Giá trị F0,05 10,13 10,13 10,13 Giá trị t0,05 3,18 3,18 3,18 Phương trình hồi = 82809x = 19291x = 1681x quy Khoảng 369,69 – tuyến tính 36,35 – 84,42 22,62 – 52,77 836,78 (g/ml ) Độ Độ tiến hành cách thêm lượng xác chất chuẩn vào mẫu tá dược mức độ 80%, 100% 120% so với nồng độ định lượng betamethason dipropionat clotrimazol Riêng methylparaben giới hạn khoảng 80 – 120% hàm lượng nên độ methylparaben tiến hành mức nồng độ 70, 100 130% Mỗi mức chuẩn bị mẫu Kết đánh giá dựa tỉ lệ phục hồi chất Các thông số sắc ký thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết , hệ số đối xứng (< 1,5) độ phân giải (> 2) có độ lệch chuẩn tương 374 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 100,57%, giá trị RSD 2% Các kết thu cho thấy phương pháp HPLC định lượng đồng thời betamethason dipropionat, clotrimazol chất bảo quản methyl paraben có độ tốt Bảng 4: Kết trung bình RSD tỉ lệ thu hồi chất 70% Mehtylparaben 80% TB 100,59 RSD TB Betamethason RSD TB Clotrimazol RSD - 100% 120% 130% 100,30 0,43 0,17 100,19 100,28 0,28 0,22 100,57 99,34 0,60 0,22 - Nghiên cứu Y học 100,02 0,05 100,15 0,34 99,70 0,38 - Độ xác Độ lặp lại Độ lặp lại phương pháp đánh giá qua định lượng mẫu thử riêng biệt theo điều kiện sắc ký chọn Kết đánh giá qua giá trị RSD hàm lượng thu chất Nhận xét: Tỉ lệ phục hồi methyl paraben từ 100,02 – 100,59%, betamethason dipropionat từ 100,15 – 100,28%, clotrimazol từ 99,34 – Bảng 5: Kết độ lặp lại KL (g) Methyl paraben Betamethason dipropionat Clotrimazol S HL(mg/ 1g kem) S HL(mg/ 1g kem) S HL(mg/ 1g kem) 2,9960 5010653 1,01 703715 0,611 1038227 10,35 3,0231 5024165 1,00 703773 0,605 1046073 10,33 2,9954 5027982 1,01 703355 0,611 1039598 10,36 3,0041 5034754 1,01 703758 0,609 1037423 10,31 3,0152 5028425 1,01 705216 0,608 1048010 10,38 3,0050 5035248 1,01 702985 0,608 1039139 10,32 TB 1,01 0,609 10,34 RSD (%) 0,37 0,33 0,24 Kết thu được: Giá trị RSD hàm lượng thu tính g kem methyl paraben, betamethason dipropionat, clotrimazol 0,37, 0,33 0,24 Như phương pháp có độ lặp lại tốt Độ xác trung gian Độ xác trung gian phương pháp đánh giá qua định lượng mẫu thử riêng biệt theo điều kiện sắc ký chọn khác ngày phân tích, người phân tích hay trang thiết bị phân tích Kết đánh giá qua giá trị RSD hàm lượng thu chất Bảng 6: Kết độ xác trung gian Lần TB (%) SD RSD (%) F-test Methyl paraben Ngày Ngày 1,01 1,01 1,00 1,01 1,01 1,02 1,01 1,01 1,01 1,02 1,01 1,02 1,01 1,01 0,00 0,00 0,37 0,27 1,834 Betamethason dipropionat Ngày Ngày 0,611 0,610 0,605 0,608 0,611 0,612 0,609 0,607 0,608 0,610 0,608 0,608 0,609 0,609 0,00 0,00 0,33 0,27 1,416 Kết thu được: Giá trị RSD hàm lượng thu tính g kem methyl paraben, Chuyên Đề Dược Clotrimazol Ngày Ngày 10,35 10,31 10,33 10,28 10,36 10,37 10,31 10,28 10,38 10,28 10,32 10,27 10,34 10,30 0,02 0,04 0,24 0,34 1,987 betamethason dipropionat, clotrimazol 0,27, 0,27 0,34 Độ sai khác lần thí nghiệm methyparaben, betamethason, 375 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học clotrimazol tương ứng 1,834, 1,416, 1,987 nhỏ F0.05 = 5,050 Như khơng có sai khác lần thí nghiệm, phương pháp đạt độ xác trung gian Độ thơ Thay đổi tốc độ dòng Khảo sát tốc độ dòng: 1,4 ml/phút 1,6 ml/phút Ở tốc độ dòng: Tiến hành tiêm lần dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử Bảng 7: Kết độ thơ tốc độ dòng TB 1,4 ml/phút RSD Methylparaben TB 1,6 ml/phút RSD TB 1,4 ml/phút RSD Betamethason TB 1,6 ml/phút RSD TB 1,4 Clotrimazol ml/phút RSD S tr 6046355 2,702 0,02 0,32 5302442 2,081 0,10 0,36 13,943 865424 0,04 0,03 760123 12,069 0,05 0,09 1224939 17,682 0,15 0,05 T 1,488 0,06 1,406 0,06 1,038 0,05 1,037 0,18 1,143 0,09 N 1469 0,64 1451 0,79 5397 0,45 5129 0,91 7662 0,36 S tr T N TB 1071042 15,365 1,136 7325 1,6 ml/phút RSD 0,27 0,04 0,08 0,42 Kết thu cho thấy tất thơng số (thời gian lưu, diện tích píc) có RSD ≤ 2%, hệ số bất đối 0,8 ≤ T ≤ 1,8, số đĩa lý thuyết 1000, thay đổi điều kiện tốc độ dòng khơng làm thay đổi đáng kể đến việc định lượng đồng thời betamethason dipropionat, clotrimazol chất bảo quản methyl paraben Thay đổi tỉ lệ pha động Tiến hành tăng/giảm tỉ lệ dung môi hữu pha động 10% Khảo sát độ thô phương pháp tỉ lệ pha động khác: Methanol – đệm pH 7,0 (80: 20) Methanol – đệm pH 7,0 (60: 40) Ở pha động: Tiến hành tiêm lần dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử Bảng 8: Kết độ thô tỷ lệ pha động Methylparaben Betamethason Clotrimazol Methanol – đệm (80 : 20) Methanol – đệm (60 : 40) Methanol – đệm (80 : 20) Methanol – đệm (60 : 40) Methanol – đệm (80 : 20) Methanol – đệm (60 : 40) TB RSD TB RSD TB RSD TB RSD TB RSD TB RSD Kết thu cho thấy tất thông số (thời gian lưu, diện tích píc) có RSD ≤ 2%, hệ số bất đối 0,8 ≤ T ≤ 1,8, số đĩa lý thuyết 1000, độ phân giải > 2, thay đổi điều kiện tỉ lệ pha động không làm thay đổi đáng kể đến việc định lượng đồng thời betamethason dipropionat, clotrimazol chất bảo quản methyl paraben 376 S 5025809 0,41 4969003 0,03 706722 0,02 726137 0,04 971510 0,45 1076142 0,16 tr 2,019 0,18 2,896 0,14 4,970 0,20 48,670 0,02 6,166 0,16 60.365 0,01 T 1,345 0,22 1,115 0,07 1,085 0,11 1,044 0,05 1,164 0,28 1.225 0,09 N 1521 0,52 1461 0,50 3026 0,26 9661 0,12 4596 0,25 11286 0,06 KẾT LUẬN Sau thẩm định phương pháp phân tích, thu kết sau: Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò UV, bước sóng phát UV 254 nm, chương trình đẳng dòng đơn giản, có tính đặc hiệu tốt, có tương quan chặt chẽ nồng độ chất diện tích pic với hệ số tương quan r > 0,999; có độ xác cao thể qua độ lặp lại độ xác trung gian, độ có tỉ lệ phục từ 98% - 102% đạt độ Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 thơ Chính quy trình đề xuất áp dụng vào việc định lượng chế phẩm DIDPROLAC chế phẩm có chứa betamethasone, clotrimazole chất bảo quản methylparaben lưu hành thị trường TÀILIỆUTHAMKHẢO Guideline IHT (1994), "Q2A Text on Validation of Analytical Procedures", Fed Regist 60 Johnston SE, et al (2010), "Development and validation of a stability-indicating RP-HPLC method for simultaneous assay of betamethasone dipropionate, chlorocresol, and for the estimation of betamethasone dipropionate related compounds in a pharmaceutical cream and ointment", Journal of chromatographic science 48 (9),pp.733-741 Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học Manassra A, et al (2010), "Simultaneous HPLC Analysis of Betamethasone and Clotrimazole in Crea m Formulations", Pharm Anal Acta (2),pp.2153-2435 Micronized F (2012), "United States Pharmacopoeia" Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 377 ... liệu nước định lượng đồng thời ba chất Để góp phần vào việc đánh giá chất lượng dạng bào chế chứa thành phần này, phương pháp HPLC phát triển để định lượng đồng thời betamethason, clotrimazol. .. Xây dựng phương pháp Qua tham khảo tài liệu(2-4) khảo sát: thành phần pha động, tỷ lệ dung mơi, tốc độ dòng (bảng 1) xây dựng quy trình định lượng đồng thời methyl paraben, betamethason clotrimazol. .. Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 thơ Chính quy trình đề xuất áp dụng vào việc định lượng chế phẩm DIDPROLAC chế phẩm có chứa betamethasone, clotrimazole chất bảo quản methylparaben