Triamcinolon acetonid (TA) là glucocorticoid được sử dụng khá phổ biến để điều trị các triệu chứng viêm. Các dạng bào chế dùng ngoài của TA được sử dụng phổ biến như dạng kem, thuốc mỡ; dạng bào chế gel của TA là dạng bào chế hiện đại. Trong các dạng bào chế này thường có hai chất bảo quản methylparaben (MPB) và propylparaben (PPB). Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm phần lớn tập trung định lượng hoạt chất chính, các chất bảo quản được phân tích.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TRIAMCINOLON, METHYLPARABEN VÀ PROPYLPARABEN TRONG CHẾ PHẨM DẠNG GEL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Hữu Tài*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu nghiên cứu: Triamcinolon acetonid (TA) glucocorticoid sử dụng phổ biến để điều trị triệu chứng viêm Các dạng bào chế dùng TA sử dụng phổ biến dạng kem, thuốc mỡ; dạng bào chế gel TA dạng bào chế đại Trong dạng bào chế thường có hai chất bảo quản methylparaben (MPB) propylparaben (PPB) Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm phần lớn tập trung định lượng hoạt chất chính, chất bảo quản phân tích với mức chất lượng xác định giới hạn Vì vậy, chúng tơi thực đề tài với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời 03 đối tượng triamcinolon acetonid, methylparaben propylparaben chế phẩm gel phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện hòa tan mẫu; điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời triamcinolon acetonid, methylparaben propylparaben chế phẩm dạng gel có hàm lượng TA (0,1 %); MPB (0,18 %) PPB (0,02 %) Kết quả: Xác định dung mơi hòa tan mẫu thử dạng gel điều kiện sắc ký thích hợp để tách hồn tồn đối tượng phân tích phương pháp HPLC Quy trình thẩm định theo ICH Dung dịch thử: cân 1,5g gel; chiết methanol; điền đầy bình định mức 50 ml, thu dung dịch thử nghiệm Dung dịch đối chiếu: chất đối chiếu pha methanol với nồng độ 30; 54 ppm tương ứng với TA, MPB PPB Điều kiện sắc ký: Cột C18 Knauer (150 x 4,6 mm; m); pha động: acetonitril nước (50 : 50); nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng: ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; đầu dò PDA (255 nm) Kết thẩm định: quy trình đạt độ đặc hiệu; phương trình đường tuyến tính ŷ = 29146x; ŷ = 123076x ŷ = 104666x tương ứng với TA; MPB PPB – hệ số tương quan R2 ≥ 0,999; độ lặp lại độ xác trung gian có RSD% < %; độ với tỷ lệ phục hồi giới hạn 98 – 102 %; giới hạn phát – giới hạn định lượng TA (0,30 0,99 µg/ml); MPB (5,20 17,76 µg/ml) PPB (0,10 0,33 µg/ml) Kết luận: xây dựng thành cơng quy trình định lượng đồng thời TA, MPB PPB HPLC Quy trình đạt tất yêu cầu thẩm định nên ứng dụng để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm dạng gel có thành phần TA, MPB PPB Từ khóa: HPLC, triamcinolon acetonid, methylparaben, propylparaben ABTRACT SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION TRIAMCINOLONE ACETONIDE, METHYLPARABEN AND PROPYLPARABEN IN GEL PRODUCT BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Huu Tai, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 365 - 370 *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0903 838 274 Chuyên Đề Dược Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com 365 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Background – Objectives: Triamcinolone acetonide (TA) is a glucocorticoid used to treat fairly common symptoms of arthritis The dosage forms for external use of TA are commonly used as creams, ointments; gels dosage forms of TA is a modern dosage form In dosage forms often have methylparaben (MPB) and propylparaben (PPB) The assay focus largely quantitative main active ingredient, the preservative is analyzed to determine the quantitative limits Hence, development method with high precision and low detection limit (HPLC) for simultaneous quantitative determination of TA, MPB and PPB in gels dosage forms is necessary Methods: HPLC method with PDA detector mode were developed for simultaneous quantitative determination of TA, MPB and PPB in gels dosage forms The suitable chromatography conditions were found out for complete separation of TA, MPB and PPB Results: Test solution: 1.5 g sample was extracted by methanol in 50 ml volumetric flash Reference solution: a solution containing 30; 54 and ppm each of triamcinolone; methylparaben and propylparaben RS in mobile phase A mixture of TA, MPB and PPB in sample were completely separated with chromatographic conditions: a stainless steel column (150 x 4.6 mm), packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mobile phase: a mixture of 50 volumes of acetonitrile and 50 volumes of water; isocratic mode; flow rate ml per minute; injection volume 20 µl; column temperature 40 oC; PDA at 255 nm These methods were validated and showed linearity range ŷ = 29146x; ŷ = 123076x and ŷ = 104666x respectively TA, MBP and PPB, with high correlation coefficient (R2 > 0.999), accuracy with recovery ratio in 98 – 102 % and precision with RSD ≤ 2.0 %; LOD and LOQ are (0.30; 0.99); MPB (5.20; 17.76) and PPB (0.10 and 0.33) µg/ml respectively TA, MBP and PPB Conclusions: HPLC method was successfully developed for TA, MPB and PPB in gels dosage form Key words: HPLC, triamcinolone acetonide, methylparaben and propylparaben chất lượng thuốc có thành phần chất bảo ĐẶT VẤN ĐỀ quản nhóm paraben Triamcinolon acetonid (TA) glucocorticoid PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU sử dụng phổ biến để điều trị triệu chứng viêm Các dạng bào chế dùng Đối tượng TA sử dụng phổ biến dạng kem, thuốc Triamcinolon acetonid (TA), methylparaben mỡ; dạng bào chế gel TA dạng bào chế (MPB) propylparaben (PPB) có chế đại Trong dạng bào chế thường có phẩm gel với hàm lượng đơn vị gel (10 song song hai chất bảo quản methylparaben g): TA (0,1 %); MPB (0,18 %) PPB (0,02 %) (MPB) propylparaben (PPB) Một vài công Chất đối chiếu trình nghiên cứu phương pháp định lượng TA (98,12%), MPB (99,95%) PPB (99,93%) triamcinolon quang phổ Uv-Vis(2), HPLC(1), (3) Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Tp HCM phân định lượng đồng thời MPB PPB HPLC , phối định lượng đồng thời hydrocortison, MPB PPB HPLC(5) Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm phần lớn tập trung định lượng hoạt chất chính, chất bảo quản phân tích với mức chất lượng xác định giới hạn Vì vậy, chúng tơi thực đề tài với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời 03 đối tượng triamcinolon acetonid, methylparaben propylparaben chế phẩm gel phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết nghiên cứu góp phần vào cơng tác đánh giá 366 Dung mơi – Hóa chất Methanol, acetonitril Merck sản xuất nước cất dùng cho HPLC Thiết bị Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA; cột C18 Knauer (250 x 4,6 mm; 5m) Phương pháp nghiên cứu Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Khảo sát điều kiện phân tích TA, MPB, PPB HPLC: Xử lý mẫu: khảo sát dung môi chiết (methanol, acetonitril cloroform); số lần chiết lên mẫu gel để chọn dung môi số lần chiết cho hiệu chiết lớn tạp chất hòa tan theo Thành phần pH pha động: methanol acetonitril phối hợp với nước dung dịch acid có pH thay đổi nhằm tìm pha động cho thơng số sắc ký đạt yêu cầu Xây dựng thẩm định quy trình phân tích TA, MPB, PPB HPLC: Tổng hợp điều kiện khảo sát để xây dựng quy trình định lượng đồng thời TA, MPB PPB sắc ký lỏng hiệu cao Xác định khả phù hợp quy trình lên hệ thống thử nghiệm Việc thẩm định tiến hành theo hướng dẫn ICH(4) với yêu cầu tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ xác, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình xử lý mẫu Dung dịch đối chiếu: chất đối chiếu pha pha động, nồng độ 30; 54 ppm tương ứng với TA, MPB PPB Dung dịch thử: cân 1,5 g gel; chiết lần (20; 20; 10 ml) dung môi (acetonitril, methanol cloroform), siêu âm 30 phút 50 oC Để nguội, cho vào bình định mức 50 ml điền đầy dung môi tương ứng Kết khảo sát cho thấy dịch chiết dung môi methanol cho diện tích pic chất khảo sát tương ứng với diện tích pic dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu tương ứng nồng độ Vì chọn methanol làm dung môi chiết hoạt chất mẫu thử Kết khảo sát pha động Khảo sát tỷ lệ pha động hệ dung môi: (I) methanol - nước; (II) acetonitril - nước; Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học (III) acetonitril - acid acetic 1% Tiến hành sắc ký mẫu đối chiếu mẫu thử với pha động hệ dung môi (I) với tỷ lệ thay đổi Kết khảo sát cho thấy: với dung môi methanol – nước (50:50) cho sắc ký đồ có thơng số sắc ký đáp ứng yêu cầu, chọn tỷ lệ để khảo sát tiếp hệ (II) (III) Kết khảo sát trình bày bảng sau: Bảng 1: Kết khảo sát pha động Pha động Hệ I Hệ II Hệ III TR Rs (Rs ≥ S (µV*sec) (phút) 1,5 ) AF (0,8 – 1,5) MPB TA PPB 5,4 13,7 16,7 6666777 655287 880169 16,8 16,8 4,1 1,6 1,2 1,2 MPB 4,1 6644019 3,6 1,7 TA 4,7 847872 3,6 1,6 PPB MPB 5,9 3,9 643580 6526272 5,7 3,4 1,6 1,8 TA 4,6 814166 3,4 1,6 PPB 5,7 647309 5,2 1,6 Từ kết khảo sát bảng cho thấy hệ dung môi (II) acetonitril – nước lựa chọn, nhiên hệ số bất đối AF tương đối lớn Vì vậy, giải pháp giảm chiều dài cột tiến hành để cải thiện hệ số giảm thời gian phân tích Bảng 2: Kết phân tích cột sắc ký 150 250 (mm) Cột 250 (mm) 150 (mm) MPB TA PPB MPB TA PPB TR Rs (≥ 1,5 AF (0,8– S (µV*sec) (phút) ) 1,5 ) 4,0 6644019 3,7 1,7 4,7 847872 3,7 1,6 5,9 643580 5,7 1,6 2,1 6542446 4,0 1,4 2,6 888797 4,0 1,2 3,4 657714 5,6 1,2 Kết bảng cho thấy hệ số bất đối tổng thời gian phân tích cải thiện giảm chiều dài cột 150 mm Vì vậy, chọn cột C18 (150 nm x 4,6 mm, µm) cho thử nghiệm Quy trình định lượng Mẫu trắng: pha động theo tỷ lệ khảo sát Mẫu placebo: hỗn hợp thành phần tương tự chế phẩm gel, đối tượng nghiên cứu Dung dịch đối chiếu: chất đối 367 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 chiếu pha pha động, nồng độ 30; 54 ppm tương ứng với TA, MPB PPB Dung dịch thử: cân 1,5 g gel cho vào cốc có mỏ, siêu âm 30 phút 50 oC với (20; 20; 10 ml) methanol Gộp dịch chiết methanol, cho vào bình định mức 50 ml điền đầy methanol Điều kiện sắc ký: cột Eurospher II 100 C18 (150 x 4,6 mm; m); pha động: acetonitril nước (50 : 50); nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng: ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; đầu dò PDA 255 nm Hàm lượng mg TA, MPB, PPB đơn vị 10 g tính theo cơng thức: hệ thống, kết trình bày bảng 3; pic TA; PPB MPB Bảng 3: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu TA TR (phút) S H AF Rs N TB 2,62 893519 186176 1,26 3,81 7337 RSD % 0,16 0,39 0,38 0,44 0,31 0,58 Bảng 4: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu MPB TR (phút) TB 2,18 RSD% 0,0 H AF 6611869 1480768 1,34 0,27 0,32 0,31 Rs N 3,81 5948 0,31 0,43 Bảng 5: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu đối chiếu PPB TR (phút) Trong đó: S S H Rs N 1,245 5,29 5932 0,44 0,21 0,24 TB 3,41 - Sc: diện tích pic chất đối chiếu RSD % 0,0 - Cc: nồng độ chất đối chiếu (µg/ml) Kết thẩm định quy trình: Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu sắc ký đồ mẫu đối chiếu Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic mẫu đối chiếu (Hình 4) Các pic cần định lượng mẫu thử đối chiếu đạt yêu cầu độ tinh khiết pic tính phần mềm hệ thống - mt: khối lượng cân mẫu thử (g) - St: diện tích pic mẫu thử - C%: hàm lượng % chất đối chiếu - 0,5: hệ số quy đổi Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình: quy trình đạt u cầu tính phù hợp Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 368 648915 95182 AF 0,28 0,36 Hình 2: Sắc ký đồ mẫu placebo Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thử chiết từ gel Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Bảng 6: Kết khảo sát độ đặc hiệu quy trình định lượng TA, PPB MPB Mẫu đối chiếu max (nm) tR (phút) max (nm) TA 2,62 240,3 2,63 240,3 MPB 2,18 255,7 2,18 255,7 PPB 3,41 255,7 3,41 255,7 Khoảng tuyến tính: pha mẫu đối chiếu có nồng độ 40 đến 140 % so với nồng độ định lượng, tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Các kết trình bày bảng 7, có tương quan diện tích pic khoảng nồng độ khảo sát Bảng 7: Tương quan nồng độ diện tích pic TA, PPB MPB TA MPB C (ppm) S Bảng 9: Tỷ lệ phục hồi TA; MPB PPB Khoảng nồng độ Mẫu thử tR (phút) C (ppm) 12 349752 18 524628 25 728650 30 874380 37 1078402 43 1253278 ŷ = 29146x R = 0,9993 S 22 2707672 33 4061508 44 5415344 55 6769180 67 8246092 78 9599928 ŷ = 123076x R = 0,9991 PPB C S (ppm) 209332 313998 418664 627996 732662 837328 ŷ = 104666x R = 0,9994 Độ lặp lại – Độ xác trung gian: Nghiên cứu Y học 80 % 100 % 120 % Tỷ lệ phục hồi TB (%) TA MPB PPB 100,1 100,6 101,3 100,5 100,1 99,6 100,6 98,7 99,0 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ: Bảng 10: Giới hạn phát định lượng TA, MPB PPB TA MPB PPB LOD (µg/ml) 0,3 5,2 0,1 LOQ (µg/ml) 0,99 17,16 0,33 Ứng dụng quy trình định lượng để khảo sát hàm lượng TA, MPB PPB số chế phẩm có thành phần triamcinolon thị trường, kết khảo sát trình bày bảng 11 Bảng 11: Hàm lượng (mg/10g) TA, MPB PPB chế phẩm X, Y Chế phẩm TA (mg/10g) MPB (mg/10g) PPB (mg/10g) X 10,01 18,20 1,89 Y 10,22 18,14 1,98 KẾT LUẬN: 9,94 6455724 17,67 628078 1,91 870669 9,89 6460235 17,59 629979 1,91 872532 10,02 6466752 17,82 628871 1,93 Dựa vào kết thu từ thực nghiệm, áp dụng quy trình để định lượng đồng thời triamcinolon, methylparaben propylparaben chế phẩm thuốc Đây dạng chế phẩm đa thành phần nên yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải pic quan tâm hàng đầu Các điều kiện ảnh hưởng khảo sát thẩm định đầy đủ nên ứng dụng với độ chọn lọc, độ xác độ cao 877969 9,83 6498300 17,42 634766 1,89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 875972 9,88 6493028 17,57 631918 1,90 Tiến hành sắc ký lần mẫu thử Kết trình bày bảng Bảng 8: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng TA, MPB PPB TA C (mg) Số mẫu S 870934 878294 9,77 TB = 9,89 mg RSD% = 0,91 S MPB C (mg) S PPB C (mg) 6510948 17,36 633913 1,88 TB = 17,58 mg TB = 1,90 mg RSD% = 0,92 RSD% = 0,84 Độ đúng: thực mẫu placebo khoảng nồng độ 80; 100 120 % so với nồng độ định lượng Kết trình bày bảng 9, cho thấy quy trình có tỷ lệ phục hồi đạt u cầu Chuyên Đề Dược Adriana DFP (2012), “Development and validation of a HPLC Method for detemination of Triamcinolone acetonide from Polyurethane intracular implants”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 24, pp 132-136 Aquino (2011), “Validation of quantitative analysis method for triamcinolone in ternary complexes by UV-Vis spectrophotometry”, Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences, 32(1), pp 35-40 Basima A, Mohammad A(2013), “Development of A Validated HPLC Method for the Analysis of Two Preservative Agents MPB, PPB in Topical Creams Containing Steroids in 369 Nghiên cứu Y học 370 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 the Patient’s Terms of Use”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 22(2), pp 200 205 I.C.H Harmonised tripartite guildeine, (2005), Validation of analytical procedure: Text and Methodology, pp.1 - 13 Hajkova R, Solich P (2003), “Simultaneous determination of MPB, PPB, hydrocortisone acetate and its degradation products in a topical cream by RP-HPLC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 32, pp 921 – 927 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 Chuyên Đề Dược ... số sắc ký đạt yêu cầu Xây dựng thẩm định quy trình phân tích TA, MPB, PPB HPLC: Tổng hợp điều kiện khảo sát để xây dựng quy trình định lượng đồng thời TA, MPB PPB sắc ký lỏng hiệu cao Xác định. .. chất lượng xác định giới hạn Vì vậy, thực đề tài với mục tiêu xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời 03 đối tượng triamcinolon acetonid, methylparaben propylparaben chế phẩm gel phương. .. 6466752 17,82 628871 1,93 Dựa vào kết thu từ thực nghiệm, áp dụng quy trình để định lượng đồng thời triamcinolon, methylparaben propylparaben chế phẩm thuốc Đây dạng chế phẩm đa thành phần nên yếu