Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu xả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod

Nhằm kiểm soát chất lượng của tinh dầu sả chanh, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò d

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

======  ======

NGUYỄN THỊ HUÊ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

======  ======

NGUYỄN THỊ HUÊ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2014

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa

Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại Khoa

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Huê

Trang 4

CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril

BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

DAD Máy đo quang (Diode Array Detector)

EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid

chromatography)

ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược

phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MS Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ)

NIR Quang phổ cận hồng ngoại

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

USP Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về cây sả chanh 2

1.2 Giới thiệu chung về citral 4

1.2.1 Nguồn gốc 4

1.2.2 Cấu trúc và tính chất 5

1.2.3 Công dụng 5

1.2.4 Các phương pháp định lượng citral 6

1.3 Thẩm định quy trình phân tích 9

1.3.1 Tính đặc hiệu 9

1.3.2 Miền giá trị 10

1.3.3 Tính tuyến tính 10

1.3.4 Giới hạn phát hiện 11

1.3.5 Giới hạn định lượng 11

1.3.6 Độ đúng 12

1.3.7 Độ chính xác 13

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 14

2.1.1 Dung môi, hoá chất 14

2.1.2 Trang thiết bị 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 14

2.2.2 Thẩm định tính đặc hiệu 15

2.2.3 Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị 15

Trang 6

2.2.4 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 15

2.2.5 Thẩm định độ đúng 15

2.2.6 Thẩm định độ chính xác 15

2.2.7 Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh 16

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Xác định điều kiện phân tích 17

3.1.1 Khảo sát các hệ dung môi 17

3.1.2 Xác định bước sóng hấp thụ 19

3.1.3 Điều kiện sắc ký 20

3.2 Tính đặc hiệu 21

3.3 Tính tuyến tính và miền giá trị 23

3.3.1 Đối với đồng phân neral 23

3.3.2 Đối với đồng phân geranial 24

3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 26

3.5 Độ đúng 26

3.6 Độ lặp lại 27

3.7 Độ chính xác trung gian 29

3.8 Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh 31

3.8.1 Sản phẩm A 31

Trang 7

3.8.3 Sản phẩm C 33

3.8 Bàn luận 35

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 8

Hình 3.5 Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol 21Hình 3.6 Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol

Hình 3.7 Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện

Hình 3.10 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân

Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml 32Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml 33Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml 34

Trang 9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tên gọi cây sả chanh tại một số nước 2Bảng 1.2 Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu 4 Bảng 3.1 Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước

sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) 18Bảng 3.2 Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước

sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 :

Bảng 3.3 Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml

Bảng 3.4 Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung dịch

geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm 22Bảng 3.5 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch

Bảng 3.6 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch

và diện tích pic của đồng phân geranial 25Bảng 3.7 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral 26Bảng 3.8 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial 27Bảng 3.9 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân

Trang 10

Trang 11

MỞ ĐẦU

Sả chanh (Cymbopogon citratus) còn được gọi là cỏ sả, lá sả, hương

mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Cây cao khoảng 1,5 m sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều Sả không những được sử dụng làm gia vị trong chế biến các món ăn mà còn được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới [16] Tại Việt Nam, cây sả chanh dễ trồng, thích hợp với

nhiều loại đất ở các vùng trung du, miền núi và mang lại hiệu quả kinh tế cao

Tinh dầu sả chanh được các nhà khoa học quan tâm bởi khả năng ức chế hoạt động sống của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh và hoạt tính dược

lý của nó Priyanka Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu

sả chanh đến sự phát triển và khả năng sản sinh độc tố của Aspergillus flavus

Kết quả cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm

mốc A flavus [38] và ức chế sự hình thành của các biofilm gây nên bởi

Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm là nguyên nhân chính gây

nhiễm khuẩn trong công nghiệp sản xuất thực phẩm bởi chúng rất khó bị loại trừ trong quá trình vệ sinh hệ thống trang thiết bị) [21,27] Một số công trình

nghiên cứu về thành phần tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy

thành phần chính của tinh dầu sả chanh là citral, bao gồm hai đồng phân

geranial (citral-A) và neral (citral-B) [6]

Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh khá phổ biến trên thị trường nhưng chất lượng chưa được kiểm soát chặt chẽ Nhằm kiểm soát chất lượng của tinh dầu

sả chanh, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on Harmonisation

of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use)

và ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng citral trong một số sản phẩm thương mại

Trang 12

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây sả chanh

Cây sả chanh tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Poaceae,

là một loại thảo dược ở vùng nhiệt đới và có nguồn gốc từ Ấn Độ và Sri Lanka [32] Loài cây này được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với nhiều tên gọi khác nhau (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tên gọi cây sả chanh tại một số nước [45]

Middle Eastern ( Arabic) شِيشَة اللَيشُِون ( Hashisha al-limun)

風茅(Fung maauh) 草薑(Chou geung) 風茅(Fung maauh) 檸檬草(Nihng mung chou)

German Zitronengras, Citronella, Lemongras

Trang 13

de Limón, Citronella, Hierba de Limón

レモンソウ(Remonguraso

Vietnamese Sả chanh, Sả (Sa chanh, Sa)

Cây được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thích hợp với khí hậu ẩm ướt trong điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời Trong điều kiện được hỗ trợ, cây sẽ chịu đựng được các loại khí hậu khác Tuy nhiên, ở khu vực ôn đới, cây không sống được vào mùa đông vì rễ bị đóng băng [49] Loại cây nhiệt đới này phát triển nhanh thành cụm dày đặc, có thể đạt chiều cao

180 cm và chiều rộng khoảng 120 cm Lá rộng khoảng 3 cm, dài khoảng 90

cm, đầu lá nhọn rủ xuống và có màu xanh hơi sáng [50] Cây sả chanh có lẽ được biết đến nhiều nhất vì sự xuất hiện trong ẩm thực Thái Lan và Việt Nam

Sả chanh cũng được sử dụng trong các loại trà thảo dược và đồ uống không cồn khác, trong các món nướng và trong bánh kẹo Sả chanh từ lâu đã được

sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ như một loại thuốc để hạ sốt, làm giảm

ợ hơi trong đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng và chống côn trùng rất hiệu quả [39] Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh được sử dụng rộng rãi như một hương thơm trong nước hoa và mỹ phẩm vì có đặc tính khử mùi tốt Trong liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh được sử dụng như một chất chống trầm cảm, làm dịu cơn đau nhức và giảm căng thẳng [39]

Trang 14

Tinh dầu sả chanh có thành phần chính là citral Chất lượng của tinh dầu sả chanh được xác định bởi hàm lượng citral, mùi thơm của tinh dầu sả chanh do thành phần aldehyd quyết định [34] Trong tinh dầu sả chanh, đồng phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu thế so với đồng phân cis neral (25 đến 38%) [37]

1.2 Giới thiệu chung về citral

1.2.1 Nguồn gốc

Citral là thành phần chính của một số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30]

Bảng 1.2 Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu

Loại tinh dầu Hàm lượng citral (%)

Citral là một aldehyd có công thức C10H16O được phân lập lần đầu tiên

bởi Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora Năm 1890, Dodge phân

lập được citral từ tinh dầu sả chanh [12] Sau đó, Tiemann và các cộng sự [23] phân lập được đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) và neral (citral B)

Trang 15

của citral Citral A dễ dàng tách khỏi citral B bằng phương pháp bisulphate

natri được đề xuất bởi Tiemann [44]

Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm do tinh dầu có tính chất kỵ nước, có thể tấn công và phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào Do đó, citral được sử dụng như một

Trang 16

chất bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, xà phòng và mỹ phẩm [30]

Mặc dù citral trong tinh dầu sả chanh có khả năng xua đuổi côn trùng, tuy nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn và được sử dụng như "mồi nhử" để thu hút ong mật Vì một trong những chất pheromone từ ong chúa tiết

ra giống như mùi của tinh dầu sả chanh Do đó trong kỹ thuật nuôi ong mật người ta dùng tinh dầu sả chanh như chất gọi đàn khi đàn ong mới được chuyển vùng [24,33].

Citral còn được dùng để tổng hợp vitamin A, ionone và methylionone.Citral đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen hay gây ung thư [40].

1.2.4 Các phương pháp định lượng citral

Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh)

Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất và trộn mỗi mẫu với ethanol tuyệt đối Sau đó, thêm vào hỗn hợp trên dung dịch hydroxylamine hydrochloride và dung dịch xanh promophenol Thêm axit clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng của hydroxylamine với citral Axit clohydric đã phản ứng được chuẩn độ từ từ với dung dịch kali hydroxit etanolic chuẩn cho đến khi màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu xanh ô liu Hàm lượng citral được tìm thấy trong mẫu tinh dầu sả chanh là 69,89-76,95%

Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại

Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được Wilson và các cộng sự xây dựng để xác định hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh vào năm 2002 [17] Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử ở các bước sóng trong phạm vi 750 – 2500 nm: Khi có một chùm ánh sáng tới chiếu qua các mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại (bước sóng 750 –

2500 nm) được các liên kết C-H, N-H, O-H có trong các chất hữu cơ hấp phụ Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ các mẫu sẽ thu được các thông tin về thành phần hóa học của mẫu đó Phổ thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm

Trang 17

máy tính Áp dụng mô hình thống kê nhiều biến sẽ mô tả được mối quan hệ giữa phổ hấp phụ và thành phần hóa học; mối quan hệ này là cơ sở để xác định thành phần hóa học tại các máy phân tích (máy NIR) [46]

Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh và quét phổ trong khoảng 1100-2500 nm trên máy Foss NIR- System 6500 Rapid Content Sample Mỗi mẫu thu lấy 3 phổ (mỗi phổ là trung bình của 32 lần quét) Quang phổ sau đó được tính trung bình bằng phần mềm NSAS phiên bản 3.52 Kết quả thu được hàm lượng citral trung bình trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ chính xác trung gian

là 1,00% và RSD của độ đúng là 0,23% [46]

Tham chiếu với phương pháp định lượng citral trong tinh dầu sả chanh quy định trong Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ chính xác tương đương Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm hơn so với phương pháp của Dược điển Anh là thực hiện đơn giản hơn, không cần xử lý mẫu và thời gian định lượng nhanh hơn [46]

Phương pháp sắc ký khí

Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong mẫu tinh dầu sả chanh Phân tích được thực hiện trên máy Agilent technologies 5975 Inert Mass Selective Detector GC–MS Sử dụng cột sắc ký HP-5MS với chiều dài

30 mm, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 µm Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ dòng 1ml/phút Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC Nhiệt độ bộ phận phát hiện 260oC Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: duy trình nhiệt độ 75oC trong 2 phút, tăng 4oC/phút cho đến

250oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút Kết quả thu được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 72,57%

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích

Trang 18

sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các chất không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,11,22,29]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận

Phương pháp được Rauber và các cộng sự [50] xây dựng để xác định

hàm lượng citral có trong tinh dầu sả chanh Phân tích sử dụng pha động là

n-hexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, ghép với đầu dò

UV được cài đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral Phương pháp sử dụng cột pha thuận CN Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của citral là 13,8 phút Trong khoảng nồng độ tiến hành có sự tương quan chặt chẽ với độ lệch chuẩn se slopes là 1,78 và hệ số xác định R2 = 0,9991 Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,37%

Ứng dụng phương pháp trên, xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,20%

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định

lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong một số mẫu tinh dầu

Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250 × 4,6 mm, 5 µ), pha động là acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng 1 ml/phút; ghép với đầu dò DAD được đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral Nhiệt độ cột 22oC, đầu dò có nhiệt độ 40oC và độ rộng khe 1,2 nm Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của neral và geranial tương ứng là 7,246 phút

và 7,680 phút Trong khoảng nồng độ citral từ 3 – 100 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (µg/ml) theo phương trình đối với đồng phân neral là y = 230540x –

100165 (hệ số xác định R2 = 0,9996), phương trình đối với đồng phân geranial

là y = 260014x + 23521 (hệ số xác định R2 = 0,9964) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với đồng phân neral lần lượt là 0,062 µg/ml và 0,205 µg/ml, đối với đồng phân geranial lần lượt là 0,059 µg/ml và 0,198 µg/ml Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ

Trang 19

đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤

1,74%, RSD của độ chính xác trung gian ≤ 1,93%

Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có trong tinh dầu của cây

sả chanh, tinh dầu lá chanh ta và tinh dầu vỏ quả chanh tây Kết quả xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 74,98%, trong mẫu tinh dầu lá chanh ta là 2.09% và trong mẫu tinh dầu từ vỏ quả chanh tây là 0,3%

1.3 Thẩm định quy trình phân tích

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use ) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [43], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị LOD và LOQ là các thông số không bắt buộc

phải có trong quy trình thẩm định

1.3.1 Tính đặc hiệu

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:

- Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có

ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43]

Phương pháp xác định

Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai thành phần trở lên

Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm

phân huỷ

Trang 20

1.3.2 Miền giá trị

Khái niệm

Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [1,2,14,43]

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với

hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,14,43]

- Khảo sát ở ít nhất 5 [43] hoặc 6 [14] mức nồng độ khác nhau

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp

- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu

- Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình

Trang 21

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

Trang 22

- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác chấp nhận

- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn

[1,2,10,42]

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau)

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:

Trang 23

Tỉ lệ phục hồi = 𝑋

µ× 100%

Trong đó: là giá trị mẫu đo được

µ là giá trị mẫu theo lý thuyết

Yêu cầu

Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2] Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao

1.3.7 Độ chính xác

Khái niệm

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,14,43]

Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá

trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%

Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể Phân

tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống máy thay đổi

Yêu cầu

Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2% Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2]

Trang 24

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị

2.1.1 Dung môi, hoá chất

Chất chuẩn citral tinh khiết 96% có tỷ lệ neral : geranial là 50:50, chất chuẩn geraniol tinh khiết 98%, methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) đạt tiêu chuẩn HPLC, kali hydroxit (KOH) được mua từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức Nước được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m Các mẫu tinh dầu: Caroline (mẫu A), Julyhouse (mẫu B), Ngọc Tuyết (mẫu C) mua từ trang thương mại điện tử Tiki.vn

2.1.2 Trang thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Model Ultimate 3000 – Dionex, Thermo Scientific Hoa Kỳ ghép thiết bị phát hiện đa sóng DAD -

3000 Dionex Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250mm, 5µm)

Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang

bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu, mỗi mẫu được phân tích 3 lần, lấy giá trị trung bình Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Exel

2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký

Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn, sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10

µl, thời gian sắc ký 25 phút Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại Khảo sát các pha động khác nhau, xác định

Trang 25

pha động cho các pic neral và geranial có độ phân tách tốt, đạt độ cân xứng tốt, tỷ lệ diện tích pic trên nồng độ và chiều cao pic trên nồng độ lớn nhất

2.2.3 Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị

Chuẩn bị dung dịch citral có nồng độ 10.000 µg/ml trong ACN Pha loãng dung dịch này trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) để thu được dãy

5 dung dịch có nồng độ citral lần lượt là 100, 80, 60, 40, 10 µg/ml Khi đó nồng độ của neral hay geranial lần lượt là 50, 40, 30, 20, 5 µg/ml Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, phân tích mối tương quan giữa diện tích pic y (mAu.min) và nồng độ dung dịch (µg/ml)

2.2.4 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

LOD và LOQ được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn LOD là nồng độ thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2-3 lần đường nền

ở tất cả 3 lần sắc ký LOQ là nồng độ cho pic có chiều cao gấp 10 lần đường nền ở tất cả 3 lần sắc ký

2.2.5 Thẩm định độ đúng

Đánh giá tỷ lệ phục hồi của dãy nồng độ trong khoảng tuyến tính đã phân tích Tỷ lệ phục hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ xác định được từ thực nghiệm so với nồng độ dung dịch chuẩn

2.2.6 Thẩm định độ chính xác

Độ lặp lại: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60 và 10 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong cùng một ngày Xác định giá trị RSD giữa các lần đo

Trang 26

Độ chính xác trung gian: tiến hành phân tích 3 mẫu có nồng độ 100, 60

và 10 µg/ml, mỗi mẫu 3 lần trong 3 ngày khác nhau Xác định giá trị RSD giữa các lần đo

2.2.7 Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh

Chuẩn bị các mẫu tinh dầu để định lượng Cân chính xác khoảng 0,123

mg tinh dầu cho vào bình định mức 10 ml, thêm ACN đến vạch, siêu âm 1 phút và lọc qua màng PTFE 0,2 μm Pha loãng dung dịch trên theo tỉ lệ thích hợp trong dung môi ACN : H2O (60:40, v/v) rồi tiêm vào hệ thống sắc ký Xác định diện tích pic dưới đường cong (AUC) dựa vào đường chuẩn định lượng và hệ số pha loãng để xác định hàm lượng neral, geranial và citral toàn phần trong mẫu tinh dầu

Kết quả định lượng chỉ có giá trị đối với mẫu được phân tích

Trang 27

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định điều kiện phân tích

3.1.1 Khảo sát các hệ dung môi

Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước sóng 233 nm (tham khảo nghiên cứu của Gaonkar và cộng sự) [49], sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút Khảo sát hai hệ dung môi:

hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) và hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v) Kết quả thu được như sau:

Hình 3.1 Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước

sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v)

Định dạng
Số trang	54
Dung lượng	1,59 MB