3. Nội dung nghiên cứu
2.2.5. Tách dòng gen mã hóa PPO
Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ được gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen PPO mong muốn (PPO - pTZ57R/T). Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp PPO - pTZ57R/T được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Chọn lọc các khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc màu trắng) trên môi trường LB đặc (pepton, NaCl, cao nấm men, agar) có bổ sung 50 mg/l ampicillin, 30 mg/l X-gal và 0,1 mM IPTG. Sự có mặt của DNA tái tổ hợp được kiểm tra bằng phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn.
2.2.5.1. Phƣơng pháp ghép nối đoạn gen PPO vào vector tách dòng pTZ57R/T
Sản phẩm PCR (gen PPO) được ghép nối vào vector pTZ57R/T tạo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.1: Hình ảnh vector pTZ57R/T
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ghép nối gen PPO
vào vector pTZ57R/T STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion khử trùng 1,7 2 Buffer 2 3 Vector pTZ57R/T 1 4 Sản phẩm PCR (~ 70 ng/ µl) 5
5 Enzyme T4 ligase (5U / µl) 0,3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy PCR 1 giờ 30 phút ở nhiệt độ 22oC. Đặt hỗn hợp phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.5.2. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến chủng E. coli
DH5α
Sản phẩm ghép nối gen vào vector được biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
Quá trình biến nạp được thực hiện như sau:
- Lấy tế bào khả biến E.coli DH5α giữ ở -20oC ra để trên đá lạnh 30 phút. - Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống chứa tế bào khả biến → trộn nhẹ, để trên đá 15-20 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC, trong 1 phút → để trên đá 5 phút
- Bổ sung 500 µl môi trường LB lỏng (pepton, NaCl, cao nấm men), nuôi lắc 37oC, trong 1 giờ
- Cấy trải 50 µl trên đĩa pettri chứa LB đặc (pepton, NaCl, cao nấm men, agar) có bổ sung thêm kháng sinh ampicillin (50 µl/ml), nuôi ở 37oC qua đêm → theo dõi khuẩn lạc mọc → lựa chọn khuẩn lạc trắng để xác định khả năng chứa plasmid tái tổ hợp.
2.2.5.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn
*Chuẩn bị hóa chất tách plasmid
- Sol I (đệm ly giải, bảo quản ở tủ lạnh): 50mM glucose 25mM Tris-HCl pH=8,0 10mM EDTA pH=8,0 - Sol II (phá vỡ màng tế bào): 0,2N NaOH 1% SDS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sol III (kết tủa protein, bảo quản ở tủ lạnh): 60ml CH3COOK 5M
11,5ml acetic acid (CH3COOH) 28,5ml H2O cất khử trùng
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang pTZ57 R/T - PPO trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilin 50 mg/l ở 37 oC lắc 200 vòng/ phút qua đêm. Các tế bào E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân
bằng thì được ly tâm thu cặn. * Các bước tiến hành:
- Chuyển dịch nuôi vào ống eppendort, 6 phút, 4oC.
- Loại bỏ dịch, hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150 l dung dịch I để lạnh hòa tan tế bào hoàn toàn.
- Bổ sung 150 l dung dịch II, đảo đầu ống eppendorf nhẹ nhàng, giữ trong đá 5 phút.
- Thêm 150
, 15 phút, 4 oC, thu dịch.
- Bổ sung 50 l CH3COONa 3M, pH = 5,2 và 1 ml EtOH 100 %, để lạnh âm
20 o , 15 phút, 4 oC, để thu DNA.
- 10 phút,
làm khô và hoà trong 30 l H2O.
- Bổ sung RNase và ủ ở 37 oC trong 1giờ để loại bỏ RNA.
- Kiểm tra độ tinh sạch bằng cách lấy 5 µl điện di trên gel agarose 0,8%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tái tổ hợp SacI và XhoI : Bảng 2.6: Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tích phản ứng (µl) Nước khử ion 2,5 Buffer SacI 10X 1 Plasmid tái tổ hợp ~ 70 ng/ µl 6 SacI 5U/ µl 0,25 XhoI 5U/ µl 0,25 Tổng thể tích 10 2.2.6. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide
Trình tự nucleotide của gen PPO được xác định trên máy đọc trình tự
nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied Biosystem tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sử dụng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - AppliedBiosystems (Mỹ).
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả đọc trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Blast và BioEdit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DNA TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU
Tất cả các nghiên cứu trên gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết một trong hai loại nucleic acid, đó là DNA và RNA. Sản phẩm tách chiết phải đảm bảo một số yêu cầu: tinh sạch, ít bị đứt gãy hay bị phân hủy bởi các tác nhân hóa học hay cơ học, lượng nucleic acid thu được phải đủ lớn đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để tách DNA tổng số từ lá tươi của cây chè, chúng tôi tiến hành thu mẫu lá tươi của giống LDP1, Trung du, Keo Am Tích và tiến hành tách chiết theo phương pháp Samuel (1994), An
(1997).
agarose 0,8 %, 3.1.
1 1 2 3
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của 3 mẫu chè nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.1 cho thấy, DNA tổng số thu được 1 băng sáng rõ duy nhất ở các mẫu nghiên cứu, không bị đứt gẫy, không lẫn tạp chất và có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. NHÂN GEN PPO Ở CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU
Gen mã hóa PPO được cho là chỉ có trình tự mã hóa có kích thước là 1,8 kb. Trình tự gen mã hóa PPO được phân lập từ mRNA và genome ở chè đã được công bố trên Genbank với mã số DQ513313, EF623826, EF635860, EU787433, EF650017, EF650016, JX465712, CQ192142 và FJ210643 [28]. Trên cơ sở đã tách chiết được DNA tổng số có chất lượng tốt từ các mẫu lá chè nghiên cứu làm DNA khuôn tối ưu cho phản ứng PCR. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện nhiệt độ khác nhau và nhận thấy PCR ở nhiệt độ gắn mồi tốt nhất là 59 oC với 32 chu kì. Và sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản gen mã hóa PPO bằng
phản ứng (bảng 2.2) được thiết kế
dựa trên trình tự nucleotide của gen.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím, kết quả thu được thể hiện trên hình 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại gen PPO
(M: Marker DNA 1 kb (Fermentas) 1, 2 và 3: sản phẩm PCR khuếch đại gen
PPO tương ứng từ giống Trung du, Keo Am Tích và LDP1)
Kết quả thu được ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR ở cả 3 mẫu nghiên cứu Trung du và Keo Am Tích và LDP1 đều nhận được băng DNA có kích thước khoảng 1,8 kb, kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với chiều dài của gen PPO từ các công trình đã công bố [28]. Đồng thời, kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lượng sử dụng cho tách dòng gen PPO.
3.3. TÁCH DÒNG GEN PPO TỪ CÁC GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU
Để ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pTZ57R/T có hiệu quả thì sản phẩm PCR phải được làm sạch để loại bỏ các thành phần tạp chất có trong sản phẩm PCR. Do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình gắn gen vào vector tách dòng. Chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 3 mẫu chè nghiên cứu bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thước tương ứng với sản phẩm PCR thu được.
Từ sản phẩm PCR thu được, chúng tôi tiến hành ghép nối vào vector pTZ57R/T.Hỗn hợp phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút. Sau khi biến nạp, cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agar) có bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin (50 µl/ml), IPTG (0,1 mM) và X – gal (40 mg/ml). kết quả là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng.
37 oC. Sau khi nuôi, DNA plasmid được tách chiết theo quy trình các bước ở mục 2.5.2.3và kiểm tra kết quả trên gel agarose 0,8%.
Từ các plasmid thu được, để khẳng định plasmid có mang đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi tiến hành phân tích plasmid bằng enzyme giới hạn. Hai enzyme được lựa chọn là SacI và XhoI để phân tích dựa trên cơ sở
vector pZT57R/T có 1 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, trong khi phân tích bản đồ giới hạn của gen mã hóa PPO bằng chương trình Bioedit, chúng tôi thấy rằng gen này không có vị trí nhận biết của enzyme SacI. Khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân gen mã hóa PPO, ngoài phần đặc hiệu của mồi chúng tôi đã bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn XhoI (6 nucleotide) vào
trình tự mồi ngược. Kết quả phân tích plasmid tái tổ hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong DNA plasmid (Marker 1kb, 1, 2 và 3: dòng plasmid mang sản phẩm PCR tương ứng với giống chè Trung Du, Keo Am Tích, LDP1)
Kêt quả trên trình 3.3. cho thấy, cả 3 dòng plasmid mang sản phẩm PCR khuếch đại gen PPO từ 3 giống nghiên cứu Trung Du và Keo Am Tích, LDP1 đều thu được 2 băng DNA giống nhay: một đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pTZ 57R/T (~ 2,8 kb) và một đoạn nhỏ hơn có kích thước khoảng 1,8 kb tương ứng với sản phẩm PCR. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định dòng plasmid này đã có thể đoạn gen mã hóa PPO.
3.4. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN PPO CỦA 3 GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU
Từ các dòng plasmid tái tổ hợp thu được, chúng tôi tiến hành tinh sạch nhằm mục đích xác định trình tự gen PPO. Trình tự của gen mã hóa PPO từ các giống chè Trung Du, Keo Am Tích và LDP1 được gắn với vector pZT57R/T đã được xác định. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi thấy rằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sản phẩm PCR phân lập được là trình tự ORF hoàn chỉnh mã hóa PPO. Gen này có kích thước 1,8 kb, mã hóa 599 amino acid và mã kết thúc là TAA. Kết quả này giống với kích thước gen PPO của các mẫu chè đã được nghiên cứu
và công bố [19] [28]. Kết quả so sánh trình tự gen PPO giữa các giống chè
nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.4.
10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU ATGGCTTCCATTCTCCCTCCAACCACCACCAAGACTACCACCACCTCCTCCACCCTCTCTTCTTATCCCATTTTCCAGAA KEOAMTICH .........................................T.................................A.... LDP1 ..........................................................A................A.... 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU CACCTCTAAAATTCCCACAATTAGAAAGCATAACCATCCCTTCAAAGTGTCATGCAGCAAAGCCAAAGATAGTGACCCAA
KEOAMTICH .................T...................T.......T..................................
LDP1 .....................................T.......T.................................. 170 180 190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU ACCTTACTCCCCCCTCCCAAAATACACAAACCTCCCAAGGGAAGTTTGATAGGAGAAACATGCTCATTGGCTTAGGAGGC
KEOAMTICH .................................T......................................... LDP1 .................................T......................................... 250 260 270 280 290 300 310 320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU CTCTACGGAGCAGCCGGCCTCACCGACACTGACCCACCAGCCTTGGCCGCTCCGATCACCACCCCGGATTTATCCAAATG KEOAMTICH ......................................................G.....G................... LDP1 ......................................................G.....G................... 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU CGGGGCGGCGGACTTACCCGCGGATGCAAAACCGACCAACTGTTGTCCTCCAAAAACCAACAAAATCATCGAATTCAAGC
KEOAMTICH ...........................................................................
LDP1 ........................................................................... 410 420 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU TCCCTCATCCCTCCAACACTTTACGAGTCCGACCCGCGGCCCATTTAGCCGACGAAAAATACATAGCCAAGTTTTCTAAA
KEOAMTICH ......C...........T......................................................... LDP1 ......C...........T......................................................... 490 500 510 520 530 540 550 560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU GCCCTCCAACTCATGAAATCGCTCCCCGATGACGACCCACGAAGCTTCAAGCAACAATCCAATATTCACTGCGCTTATTG KEOAMTICH .......................................................................T........ LDP1 ................................................................................ 570 580 590 600 610 620 630 640 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU CGAAGGCGCTTATCACCAAGTCGGTTTTCCAAGCACAGAGCTCCAAGTTCACAACTCATGGCTCTTCTTTCCCTCCCATA KEOAMTICH ....................................A..................................T..... LDP1 ....................................A..................................T..... 650 660 670 680 690 700 710
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU GATTCTATCTCTACTTCTTCGAAAAGATTTTGGGAATGCTGCTCGATGATCCAGCGTTTGCAATTCCTTTTTGGAATTGG KEOAMTICH ...................................................................... LDP1 .......................................G.............................. 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU GATACTCCGGCGGGCATGAAAATACCCGCCATGTATGCGGACATAAATTCGCCACTCTATAACCGTCTCCGTGACGCCAA
KEOAMTICH ...T............................................................................ LDP1 ...T............................................................................ 810 820 830 840 850 860 870 880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU ACACCAGCCACCGACATTAATTGACCTTGACTACAATTTGACTGATCCAAAAAATGTCGATGAGGAGAAGCAGAAGTTGA KEOAMTICH ................................................G............................. LDP1 ................................................G............................. 890 900 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU GAAATCTAACTATAATGTACCGACAAGTGGTGTCGGGTGGGAAAACGCCTCGGCTTTTCCTTGGAAGCTCGTACCGTGCG
KEOAMTICH ..G..........................G........................................... LDP1 ........................................................................ 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU GGAGATGACCCGGACCCAGGTGCCGGGTCCCTGGAGAACATCCCGCATGGTCCGGTTCACATATGGTGCGGGGACCGCAC KEOAMTICH .............................................................................. LDP1 .............................................................................. 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU CCAGCCGAATCTAGAAGACATGGGGAACTTCTACTCTGCGGGACGAGATCCGATCTTTTACGGTCATCACGCGAACGTCG KEOAMTICH .......................................................C...................... LDP1 .......................................................C...................... 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU ATCGGATCTGGACGGTGTGGAAGACATTAGAAGGAAAACGAAACGATTTCAAGGATCCGGATTGGTTGAATTCAGAGTTC
KEOAMTICH ........................................................................
LDP1 ..........................G.....................................T....... 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU ACCTTTTACGACGAAAATGCTCAGCTTGTGACTGTAAAAGTAAAAGAGAGTTTGGATCATCGAAAACTCGGCTACGTCTA
KEOAMTICH ...........................................................................
LDP1 ..........................C..................................................
1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TRUNGDU CCAAGACGTGGAAATTCCATGGCTAAACACTCGACCCAGTCCTCGTATTTCGAATTCTTTTCGAAAAATAAAGAACAAGG
KEOAMTICH ...........................A............................T..................... LDP1 ........................................................T...............G..... 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU CCGGGAGAGCAATGGCGACAGAGACACTGGATTCTGCTGCCATTGTATTCCCAAGAAAGCTTGATGAGGTGGTGAAGGTG KEOAMTICH ......T..................................................................... LDP1 ......T..............G.....................................A................
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU GTGGTGAAGCGGCCGACGAAGTCGAGGAGTGAGAGAGAGAAGGAAGAAGAGGAGGAGGTGGTGGTAGTGGAGGGGATAGA KEOAMTICH .....................G..............................................T.. LDP1 ....................................................................... 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU GGTGGAGAGAGATGTGTCTGTGAAGTTTGATGTGTTTATTAACGACGAAGACGAGGCGGCGAGTGGGCCGGAGAAGACAG KEOAMTICH .A..............................................T...A................. LDP1 .................................................................... 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU AGTTCGCCGGAAGCTTTGTGAATGTGCCGCGTAAACATAAGCATGACAAGAAGATAAGGACTGGGTTGACATTGGGGATA KEOAMTICH ............................C.................................GG...... LDP1 ..............................................................G....... 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU ACTGAGCTATTGGAGGACTTGGAAGCTGAAGATGATGAGAGCGTGCTGGTGACTTTGGTCCCTAGATATGGGTCTGATGC KEOAMTICH ..............................A.......................................... LDP1 ......................................................................... 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....| TRUNGDU TGTCACTATTGGTAGTGTCAAGATTGAGTTTGATTCTTAA KEOAMTICH ...........G........................ LDP1 ...........G........................
Hình 3.4. So sánh trình tự nucleotide của 3 giống chè Trung Du, Keo Am Tích và LDP1
Trên hình 3.4. cho thấy, gen PPO ở giống chè Trung Du có 25 và 32 vị