Định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp ( panax bipinnatifidus seem ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG ThS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, nhận nhiều giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ động viên q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng Anh ln dành thời gian hướng dẫn động viên tơi q trình hồn thiện khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược đặc biệt Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc ln tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt bạn Thùy, Phương, Chuyên đồng hành với suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thành viên nhóm nghiên cứu tơi chị Thủy chị Huệ ln giúp đỡ nhiệt tình bảo tơi suốt q trình thực đề tài Lời cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lự c cố gắng để có kết ngày hơm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2018 Sinh viên Dương Thị Phượng DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AC Acetonitril N Buthanol Bu OH Detector mảng điốt (Diode array DA detector) D Dung dịch Dd Ethanol Et OH Sắc ký lỏng hiệu cao (High HP performace liquid LC chromatography) LO Giới hạn phát D (Limit of Detection) LO Q Giới hạn định lượng (Limit of Me Quantitation) OH Methanol RS D Độ lệch chuẩn tương đối SK Đ Sắc ký đồ SK Sắc ký lớp mỏng LM Stipuleanosid R2 Sti Sâm vũ diệp SV D Trung bình TB Thứ tự TT Ultra violete UV Visible VI S DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Chương trình dung mơi Bảng Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết Bảng Tính thích hợp hệ thống Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến Bảng Kết khảo sát độ lặp lại Bảng Kết khảo sát độ p Bảng Kết định lượng stipuleano DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo stipuleanosid R2 Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng Hình 2.1 Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập Hình 3.1 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun H2SO4 10% /EtOH Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 HPLC Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 1.2.1 Cơng thức hóa học 1.2.2 Tính chất lý hóa 1.2.3 Tác dụng sinh học 1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 HPLC 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .6 1.3.1 Nguyên tắc HPLC 1.3.2 Một số thông số đặc trưng 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 1.3.4 Tổng quan nghiên cứu định lượng thành phần hóa học Sâm vũ diệp HPLC CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .10 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp 10 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2 10 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 11 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 11 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.3.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất 12 2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 cao rễ SVD HPLC 13 2.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp 16 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 17 3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 3.1.2 Phương pháp HPLC 17 3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 3.2.1 Chương trình sắc ký 20 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng 20 3.3 ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP 27 3.4 BÀN LUẬN 28 3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 HPLC 28 3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 dược liệu cao sâm vũ diệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thấ t vị thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22] Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin SVD định lượng thành phần có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng dược liệu SVD thực tiễn Qua trình tra cứu tài liệu, thấy nước ta có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tác dụng dược lý sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Trên sở đó, thực đề tài nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ SVD thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất saponin phân lập từ phân đoạn buthanol xác định stipuleanosid R2 thành phần saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài “Định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp sắc ký lỏng hi ệu cao” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn ki ểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin SVD sau Mục tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18 CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học SVD có tên khoa học Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng đặc biệt ưa ẩm [3,21] Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân từ tháng đến đầu tháng dương lịch Lá kép chân vịt, gồm - mọc vịng Lá chét - (ít 3) thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - cm, gốc trịn, đầu thn thành mũi nhọn, xẻ thùy khơng đều, mép có cưa, có lơng Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) [3,21] 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái Sâm vũ diệp loài sâm mọc tự nhiên phát tương đối sớm nước ta Trong tự nhiên, SVD phân bố dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22] Gần sâm vũ diệp nghiên cứu bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Hiện vùng phân bố SVD bị thu hẹp dần đứng trước nguy tuyệt chủng Do SVD loài dược liệu quý cần bảo tồn gìn giữ để phát triển tương lai Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung tán rừng ẩm, gần quanh năm có sương mù Hàng năm vào cuối tháng đầu tháng 3, từ phần đầu mầm [35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards", "Planta Med", 75(7), pp 689-703 [36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", " Yao Xue Xue Bao", 32(9), pp 685-90 [37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599 [38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560 [39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 2028 [40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva C Trang web [41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top [42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 PHỤ LỤC Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu ụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 15,625 µg/ml Sắc ký đồ dung d ịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 37,5 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 75 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 150 µg/ml Sắc ký đồ dung d ịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 200 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 300 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 400 µg/ml Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp ... tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc... HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM. ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... pháp phân tích Định lượng thành phần stipuleanosid R2 sâm vũ diệp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC - DAD Kết thu cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 mẫu cao BuOH c thân rễ sâm vũ diệp 2,477%