Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TẠ THỊ THẢO TS HÀ TRẦN HƢNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Hà Trần Hƣng tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện thuận lợi cho đƣợc học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá q trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt ngƣời bạn nhóm hố phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 Học viên Vũ Anh Phƣơng Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vềparaquat 1.1.1 Công thức paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 1.1.4 Dƣợc động học paraquat 1.1.4.1 Hấp thu 1.1.4.2 Phân bố 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ 1.1.5 Tiên lƣợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tƣơng .7 1.2 Các phƣơng pháp xác định paraquat huyết tƣơng .9 1.2.1 Phƣơng pháp quang phổ 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký khí khối phở 10 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 11 1.2.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 13 1.3 Các phƣơng pháp xử lý mẫu huyết tƣơng phân tích Paraquat 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 19 2.2.1 Chất chuẩn 19 2.2.2 Hoá chất 19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng paraquat 21 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 21 2.3.1.2 Phƣơng pháp tách PQ từ huyết tƣơng 21 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 2.3.1.3 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lƣợng PQ huyết tƣơng 21 2.3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích PQ huyết tƣơng .22 2.3.2.1 Tính chọn lọc 22 2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính 23 2.3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 23 2.3.2.4 Đánh giá độ (độ thu hồi) độ chụm (độ lặp lại) 23 2.3.2.5 Độ ổn định 23 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .24 2.3.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu cao 26 3.1.1 Xác định bƣớc sóng phát chất phân tích với detector DAD 26 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng thể tích mẫu tiêm vào cột 26 3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động 28 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 29 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 31 3.1.5 Khảo sát ảnh hƣởng pH pha đôngg 31 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 33 3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm 33 3.1.6.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ natriheptanesulfonate 33 3.1.6.2 Ảnh hƣởng nồng độ KCl 35 3.1.6.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ PEG 36 “-” không xuất pic PQ sắc đồ, chứa pic mẫu 37 3.1.7 Khảo sát ảnh hƣởng tốc độ dòng 37 3.1.8 Đƣờng chuẩn, giới haṇ phát hiêṇ vàgiới haṇ đinḥ lƣơngg .39 3.1.8.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 39 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên 3.1.8.2 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 42 3.1.8.3 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn 43 3.2 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu 46 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA 46 3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy 48 3.2.3 Khảo sát độ ởn định mẫu phân tích 50 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp 51 3.3.1 Đánh giáđô cg hoṇ locg 51 3.3.2 Đánh giá độ phƣơng pháp 51 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi phƣơng pháp 51 3.3.2.2 Đánh giá độ phƣơng pháp phân tích 52 3.3.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 53 3.3.2.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị 53 3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp) phƣơng pháp phân tích 55 3.3.3 Độ ổn định 57 Độ ởn định thời gian phân tích 58 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 58 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 58 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tƣơng tiên lƣợng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 60 ́ KÊT LUÂN 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên ̉ ́́ ̉ DANH SACH BANG BIÊU Bảng 3.1: Ảnh hƣởng thểtich́ bơm mâũ 27 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng tỉlê pg đôngg t ới độ phân cực, thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng pH tới thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic .32 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng đô gnatriheptanesulfonate đ ến thời gian lƣu, hệ số đối xứng pic 34 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng nồng đô gKCl đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic 35 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng nồng đô gPEG đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic 37 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng tốc dg ịng đến thời gian lƣu hệ số đối xứng pic 38 Bảng 3.8: Nồng độ diện tích pic trung bình PQ 40 Bảng 3.9: Giới haṇ phát hiêṇ vàgiới haṇ đinḥ lƣơng PQ 43 Bảng 3.10: Kết so sánh giá trị a với giá trị phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ 44 Bảng 3.11: Kết so sánh b b′ phƣơng trình đƣờng chuẩn PQ 45 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng nồng đô gTCA đến hiệu chiết PQ khỏi huyết tƣơng 48 Bảng 3.13: Ảnh hƣởng thời gian lắc xoay đến trình chiết .48 Bảng 3.14: Kết xác định độ ổn định khác ngày 50 Bảng 3.15: Kết đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp phân tích PQ 52 Bảng 3.16: Kết phân tích lặp lại mẫu huyết tƣơng thêm chuẩn 52 Bảng 3.17: Các đại lƣợng thống kê 53 Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lƣu diện tích pic chất 54 Bảng 3.19: Kết hàm lƣợng PQ tìm lại đƣợc phƣơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác 55 Bảng 3.20: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích tiến hành ba KTV khác 56 Bảng 3.21: Các kiện đánh giá độ tái lặp phƣơng pháp phân tích .57 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Bảng 3.22: Kết quảxác đinḥ đô gổn đinḥ ngày 58 Bảng 3.23: Thời gian tƣƣ̀ lúc uống đến lấy mẫu xét nghiệm 60 Bảng 3.24: Kết định lƣợng PQ 31 bệnh nhân 61 Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tƣơng sau lọc máu hấp phụ 65 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH HÌNH Chƣơng Hình 1.1: Cơng thức hóa học paraquat Hình 1.2 Cơ chế gây độc paraquat [15] Hình 1.3: Biểu đồ liên quan nồng độ Paraquat huyết tƣơng (µg/ml), thời gian sau uống, khả sống Chƣơng Hình 3.1: Phởhấp thu U g V PQ 26 Hình 3.2: Sắc đồkhảo sát thểtich́ bơm mâũ 27 Hình 3.3: Sắc đồphân tích PQ với gdung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M nƣớc dung dịch NaOH 0,0125M methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) 28 Hình 3.4: Sắc đồphân tích PQ với gdung môi B 29 Hình 3.5: Sắc đồphân tích PQ với gdung môi C 29 Hình 3.6: Sắc ký đồkhảo sát tỉlê pg đôngg ACN : Đêṃ %v/v 30 Hình 3.7: Sắc đồkhảo sát ảnh hƣởng pH 32 Hình 3.8: Sắc đồkhảo sát nồng đô cg natriheptanesulfonate đêṃ pH 2,5 34 Hình 3.9: Sắc đồcủa PQ thay đởi nồng đô cg KCl pha động 35 Hình 3.10: Sắc đồcủa PQ thay đởi nồng gcủa PEG pha động .37 Hình 3.11: Sắc đồkhảo sát tốc gdịng 38 Hình 3.12: Sắc kýđồcác nồng đô P g Q khác tƣƣ̀ 0,02 – 10,00 µg/ml 40 Hình 3.13: Đƣờng chuẩn PQ theo diện tích pic 41 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ mẫu huyết tƣơng .49 Hình 3.15: Sắc kýđồPQ huyết tƣơng chuẩn áp dungg quy trinh ƣ̀ xƣƣ̉ lýmâũ hình 3.14 50 Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ phƣơng pháp 51 Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm t̉i 58 Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 59 Hình 3.19: Kết bệnh nhân ngộ độc Paraquat 60 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.20: Kết định lƣợng nồng độ PQ vào viện bệnh nhân sống tử vong 63 Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP bệnh nhân sống tử vong 64 Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lƣợng tử vong 65 Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt % RSD % RSDR ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ GC-MS HP HPLC LC-MS LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RP-HPLC Vũ Anh Phương 61 Trường ĐHKH Tự nhiên STT Bệnh nhân 15 Lò Thị C 16 Nguyễn Xuân T 17 Nghiêm Anh V 18 Nguyễn Thanh C 19 Nguyễn Xuân L 20 Nguyễn Ngọc C 21 Nguyễn Mạnh T 22 Nguyễn Thị C 23 Nguyễn Ngọc T 24 Nguyễn Văn S 25 Trần Ngọc D 26 Lê Thị H 27 Dƣơng Thị Q 28 Đòan Văn K 29 Nguyễn Thị B 30 Nguyễn Khả C 31 Phùng Thị N Kết biểu diễn phụ thuộc nồng độ PQ huyết tƣơng vào viện theo thời gian từ uống thuốc đến xét nghiệm (hình 3.20) cho thấy hầu hết Vũ Anh Phương 62 Trường ĐHKH Tự nhiên BN đến viện vịng 10 có nồng độ PQ cao 10 g/ml tử vong Do định lƣợng xác PQ huyết tƣơng theo thời gian uống cho phép tiên lƣợng tử vong Hình 3.20: Kết định lƣợng nồng độ PQ vào viện bệnh nhân sống tử vong Căn vào công thức tính số độ nặng ngộ độc PQ (hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tƣơng (g/ml)]×[thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP nhóm BN nghiên cứu trung bình 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao 354,6) Kết biểu diễn kết cục BN theo điểm SIPP đƣợc hình 3.20 Các BN nhóm sống có điểm SIPP thấp hẳn nhóm tử vong Tất BN có điểm SIPP 40 tử vong Vũ Anh Phương 63 Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP bệnh nhân sống tử vong Chúng khảo sát chi tiết giá trị thang điểm SIPP đƣợc trình bày dƣới dang đƣờng cong ROC (hình 3.23) Diện tích dƣới đƣờng cong (AUC) SIPP 0,886 Nhƣ vậy, điểm SIPP có giá trị tốt dùng để tiên lƣợng tử vong Giá trị thang điểm SIPP = 25 có độ nhạy độ đặc hiệu cao (tƣơng ứng 0,82 0,88), điểm SIPP 40 có độ nhạy 0,73 độ đặc hiệu đạt 100% có nghĩa BN có điểm SIPP 40 tử vong Vũ Anh Phương 64 Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lƣợng tử vong Nồng độ PQ huyết tƣơng trƣớc sau lọc lần lọc đƣợc biểu thị bảng 3.25 Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tƣơng sau lọc máu hấp phụ Lần HP Trung vị Lần Tứ phân vị Trung vị Lần Tứ phân vị Trung vị Lần Vũ Anh Phương Tứ phân vị 65 Trường ĐHKH Tự nhiên * Giá trị p xác định Wilcoxon Signed Ranks Test, p