Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TR Đ I H C QU C GIA HÀ N I NGăĐ I H C KHOA H C T NHIÊN ======= VǛăANHăPH NGHIÊNăC UăĐ NHăL TRONGăM UăHUY TăT PH NG NGăPARAQUAT NG NG I B NG NGăPHÁPăS CăKụăL NGăHI UăNĔNGăCAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã s : 60440118 LU NăVĔNăTH CăSƾăKHOAăH C Ng iăh ng d n khoa h c: PGS.TS T TH TH O TS HÀ TR NăH NG HÀ N I - 2015 L I C Mă N L i cho gửi l i c m ơn sâu sắc tới PGS.TS T Thị Th o TS Hà Trần H ng đư tận tình h ớng dẫn t o điều kiện giúp đỡ su t trình thực đề tài viết luận văn Tôi xin đ ợc gửi l i c m ơn chân thành tới ban lưnh đ o toàn thể nhân viên Trung tâm Ch ng Độc – Bệnh viện B ch Mai đư t o điều kiện thuận lợi cho đ ợc học tập nghiên cứu Tôi xin bày t lòng biết ơn tới thầy cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá, đặc biệt thầy cô môn Hoá Phân tích, đư cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi l i c m ơn anh chị, b n bè tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt ng i b n nhóm hoá phân tích K24 đư giúp đỡ, chia sẻ khó khăn su t trình học tập thực đề tài Cu i xin gửi l i c m ơn tới gia đình b n bè đư động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 H c viên VǜăAnhăPh Vũ Anh Phương ng Trường ĐảKả Tự nhiên M CăL C ĐẶT V NăĐ CH NGă1:ăT NG QUAN 1.1 T̉ng quan paraquat 1.1.1 Công thức paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat .3 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 1.1.4 D ợc động học paraquat 1.1.4.1 Hấp thu 1.1.4.2 Phân b 1.1.4.3 Chuyển hoá, th i trừ .7 1.1.5 Tiên l ợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết t ơng 1.2 Các ph ơng pháp xác định paraquat huyết t ơng 1.2.1 Ph ơng pháp quang ph̉ .9 1.2.2 Ph ơng pháp sắc ký khí kh i ph̉ 10 1.2.3 Ph ơng pháp sắc ký l ng kh i ph̉ 11 1.2.4 Ph ơng pháp sắc ký l ng hiệu cao 13 1.3 Các ph ơng pháp xử lý mẫu huyết t ơng phân tích Paraquat 15 CH NGă2:ăĐ IăT NG VÀ PH NGăPHÁPăNGHIÊN C U 19 2.1 Đ i t ợng nghiên cứu .19 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 19 2.2.1 Chất chuẩn 19 2.2.2 Hoá chất .19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ .20 2.3 Ph ơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định l ợng paraquat 21 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 21 2.3.1.2 Ph ơng pháp tách PQ từ huyết t ơng 21 Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên 2.3.1.3 Ph ơng pháp kh o sát điều kiện sắc ký để định l ợng PQ huyết t ơng 21 2.3.2 Đánh giá ph ơng pháp phân tích PQ huyết t ơng 22 2.3.2.1 Tính chọn lọc .22 2.3.2.2 Kho ng nồng độ tuyến tính 23 2.3.2.3 Giới h n phát giới h n định l ợng 23 2.3.2.4 Đánh giá độ độ chụm 23 2.3.2.5 Độ ̉n định 23 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết t ơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên l ợng bệnh nhân đánh giá hiệu qu lọc máu hấp phụ .24 2.3.3.1 Đ i t ợng nghiên cứu 24 2.3.3.2 Tiêu chuẩn lo i trừ bệnh nhân 24 CH NGă3:ăK T QU VÀ TH O LU N 26 3.1 T i u hóa điều kiện ch y sắc lý l ng hiệu cao 26 3.1.1 Xác định b ớc sóng phát chất phân tích với detector DAD 26 3.1.2 Kh o sát nh h ng thể tích mẫu tiêm vào cột 26 3.1.3 Kh o sát lựa chọn lo i pha động 28 3.1.4 Kh o sát thành phần pha động 29 3.1.5 Kh o sát nh h ng pH pha động 31 3.1.6 Kh o sát thành phần dung dịch đệm 33 3.1.6.1 Kh o sát nh h 3.1.6.2 nh h ng nồng độ KCl .35 3.1.6.3 Kh o sát nh h 3.1.7 Kh o sát nh h 3.1.8 Đ ng nồng độ natriheptanesulfonate 33 ng nồng độ PEG 36 ng t c độ d̀ng .37 ng chuẩn, giới h n phát giới h n định l ợng 39 3.1.8.1 Xây dựng đ ng chuẩn 39 3.1.8.2 Giới h n phát giới h n định l ợng 41 3.1.8.3 Đánh giá ph ơng trình đ ng chuẩn 42 3.2 Kh o sát ph ơng pháp xử lý mẫu 45 3.2.1 Kh o sát nồng độ dung dịch TCA 45 Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên 3.2.2 Kh o sát th i gian lắc xoáy 46 3.2.3 Kh o sát độ ̉n định mẫu phân tích 48 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng ph ơng pháp 49 3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc 49 3.3.2 Đánh giá độ ph ơng pháp 49 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi ph ơng pháp .49 3.3.2.2 Đánh giá độ ph ơng pháp phân tích 50 3.3.3 Đánh giá độ lặp l i tái lặp l i .51 3.3.3.1 Đánh giá độ lặp l i thiết bị 51 3.3.3.2 Đánh giá độ chụm ph ơng pháp phân tích 53 3.3.4 Độ ̉n định 56 Độ ̉n định th i gian phân tích 56 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết t ơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên l ợng bệnh nhân đánh giá hiệu qu lọc máu hấp phụ 56 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 56 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết t ơng tiên l ợng bệnh nhân đánh giá hiệu qu lọc máu hấp phụ 58 K TăLU N 65 TÀI LI U THAM KH O 66 Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên DANHăSÁCHăB NGăBỈU B ng 3.1: B ng 3.2: B ng 3.3: B ng 3.4: B ng 3.5: B ng 3.6: nh h ng thể tích bơm mẫu .27 nh h ng t̉ lệ pha động tới độ phân cực, th i gian l u, hệ s đ i xứng pic .31 nh h ng pH tới th i gian l u, hệ s đ i xứng pic 32 nh h ng nồng độ natriheptanesulfonate đến th i gian l u, hệ s đ i xứng pic .34 nh h nh h ng nồng độ KCl đến th i gian l u hệ s đ i xứng pic 36 ng nồng độ PEG đến th i gian l u hệ s đ i xứng pic .37 ng 3.7: ng 3.8: ng 3.9: ng 3.10: nh h ng t c độ d̀ng đến th i gian l u hệ s đ i xứng pic 38 Nồng độ diện tích pic trung bình PQ .40 Giới h n phát giới h n định l ơng PQ .42 Kết qu so sánh giá trị a với giá trị ph ơng trình đ ng chuẩn PQ 43 B ng 3.11: B ng 3.12: B ng 3.13: Kết qu so sánh b b′ ph ơng trình đ ng chuẩn PQ 44 nh h ng nồng độ TCA đến hiệu qu chiết PQ kh i huyết t ơng 46 nh h ng th i gian lắc xoay đến trình chiết .46 B ng 3.14: B ng 3.15: Kết qu xác định độ ̉n định khác ngày 48 Kết qu đánh giá hiệu suất thu hồi đ i với ph ơng pháp phân tích PQ 50 B B B B Kết qu phân tích lặp l i mẫu huyết t ơng thêm chuẩn .51 Các đ i l ợng th ng kê .51 Độ lặp l i th i gian l u diện tích pic chất 52 Kết qu hàm l ợng PQ tìm l i đ ợc ph ơng pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác .53 Các kiện th ng kê đánh giá độ lặp l i ph ơng pháp phân tích tiến hành b i ba KTV khác .54 B B B B ng 3.16: ng 3.17: ng 3.18: ng 3.19: B ng 3.20: B ng 3.21: B ng 3.22: Các kiện đánh giá độ tái lặp ph ơng pháp phân tích .55 Kết qu xác định độ ̉n định ngày .56 B ng 3.23: Th i gian từ lúc u ng đến lấy mẫu xét nghiệm 59 B ng 3.24: B ng 3.25: Kết qu định l ợng PQ 31 bệnh nhân 60 Thay đ̉i nồng độ Paraquat huyết t ơng sau lọc máu hấp phụ 63 Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên DANHăSÁCHăHỊNH Ch ngă1 Hình 1.1: Công thức hóa học paraquat .3 Hình 1.2 Cơ chế gây độc paraquat Hình 1.3: Biểu đồ liên quan nồng độ Paraquat huyết t ơng, th i gian sau u ng, kh s ng Ch ngă3 Hình 3.1: Ph̉ hấp thụ UV PQ .26 Hình 3.2: Sắc đồ kh o sát thể tích bơm mẫu 27 Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A .28 Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B .29 Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C .29 Hình 3.6: Sắc ký đồ kh o sát t̉ lệ pha động ACN μ Đệm %v/v 30 Hình 3.7: Sắc đồ kh o sát nh h Hình 3.8: Sắc đồ kh o sát nồng độ natriheptanesulfonate đệm pH 2,5 34 Hình 3.9: Sắc đồ PQ thay đ̉i nồng độ KCl pha động 35 ng pH 32 Hình 3.10: Sắc đồ PQ thay đ̉i nồng độ PEG pha động 37 Hình 3.11: Sắc đồ kh o sát t c độ d̀ng 38 Hình 3.12: Sắc ký đồ nồng độ PQ khác từ 0,02 – 10,00 µg/ml .39 Hình 3.13: Đ ng chuẩn PQ theo diện tích pic 40 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ mẫu huyết t ơng 47 Hình 3.15: Sắc ký đồ PQ huyết t ơng chuẩn áp dụng quy trình xử lý mẫu hình 3.14 .48 Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ ph ơng pháp 49 Hình 3.17: Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tủi 57 Hình 3.18: Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 57 Hình 3.19: Kết qu bệnh nhân ngộ độc Paraquat 58 Hình 3.20: Kết qu định l ợng nồng độ PQ vào viện bệnh nhân s ng tử vong 61 Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP bệnh nhân s ng tử vong 62 Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên l ợng tử vong 63 Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên DANH M C CÁC CH Tênăvi tăt t VI T T T Tênăti ngăanh TênăTi ngăvi t % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn t ơng đ i % Reproducibility standard % Độ lệch chuẩn tái lặp deviation t ơng đ i Acetonitrile Acetonitril Asymmetry factor Hệ s đ i xứng pic ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat BN Patient Bệnh nhân diode-array detector detector m ng diode DQ Diquat Diquat EPQ Ethylparaquat Ethylparaquat % RSD % RSDR ACN AS DAD GC - MS HP HPLC LC - MS Gas chromatography - Mass spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy Sắc ký khí kh i ph̉ Lọc máu hấp phụ Sắc ký l ng hiệu cao Sắc ký l ng kh i ph̉ LOD Limit of Detection Giới h n phát LOQ Limit of Quantification Giới h n định l ợng Methanol Methanol ppm Parts per million Phần triệu PQ Paraquat Paraquat Relative coefficient Hệ s t ơng quan Receiver operating characteristics Đ Reverse phase-HPLC Sắc ký l ng pha đ o MeOH R ROC RP-HPLC Vũ Anh Phương ng cong ROC Trường ĐảKả Tự nhiên Tênăvi tăt t SD SIPP TCA tR UV-VIS Vũ Anh Phương Tênăti ngăanh TênăTi ngăvi t Standard deviation Độ lệch chuẩn Severity Index of Paraquat Ch̉ s độ nặng ngộ độc Poisoning Paraquat Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic Retention time Th i gian l u Ultraviolet-Visible Tử ngo i kh kiến Trường ĐảKả Tự nhiên ĐẶTăV NăĐ Paraquat (viết tắt paraquaternary bipyridyl) thu c diệt c giá thành rẻ, hiệu qu diệt c d i nhanh chóng, nh h đ ợc sử dụng rộng rãi ng tới môi tr ng Việt Nam với nhiều tên th ơng m i khác Tuy nhiên, paraquat (PQ) l i chất hóa học vô độc với ng i Liều tử vong PQ ớc tính kho ng 10 ml dung dịch 20% T i nhiều n ớc phát triển, PQ đư bị cấm sử dụng nh ng Việt Nam việc thiếu sách biện pháp qu n lý sử dụng hóa chất nên năm vừa qua có nhiều tr ng hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1] Trên giới, nhiều ca tử vong ngộ độc PQ đư đ ợc báo cáo [10][1λ][27] T i Trung tâm Ch ng độc bệnh viện B ch Mai, năm gần đây, s l ợng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng tr thành vấn n n vô nghiêm trọng, v ợt ng ỡng 300 ca năm 2013 năm 2014 lên tới 3λ1 ca T̉ lệ tử vong ngộ độc PQ cao, th ng kho ng 70-80% theo nhiều nghiên cứu tác gi n ớc [2λ][32] T i Trung tâm ch ng độc (TTCĐ) bệnh viện B ch Mai, t̉ lệ tử vong năm 2007 72,5% [4], năm 2011 72,λ% [2], nghiên cứu t i bệnh viện Chợ Rẫy thành ph Hồ Chí Minh 85% Trong chẩn đoán điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định l ợng PQ huyết t ơng đóng vai tr̀ đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng ngộ độc, tiên l ợng bệnh nhân nh đánh giá hiệu qu biện pháp điều trị, đặc biệt lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong ngộ độc cấp PQ cao thiếu biện pháp điều trị hiệu qu Gần đây, nghiên cứu nhiều tác gi n ớc s tác gi Việt Nam cho thấy kĩ thuật lọc máu mới, lọc máu hấp phụ cột than ho t cột resin nhằm tăng c ng đào th i PQ cho kết qu kh quan, cứu s ng s không nh bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xét nghiệm định l ợng nồng độ PQ huyết t ơng cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu qu biện pháp điều trị tăng th i trừ Tuy nhiên, t i Việt Nam việc xét nghiệm PQ ch̉ dừng mức độ định tính n ớc tiểu ph ơng pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc Vũ Anh Phương Trường ĐảKả Tự nhiên 3.3.4 Độ ̉n định Trong ph m vi để tài, tiến hành đánh giá độ ̉n định PQ huyết t ơng th i gian phân tích th i gian b o qu n Độ ổn định thời gian phân tích Chuẩn bị mẫu PQ huyết t ơng trắng nồng độ µg/ml, xử lý mẫu tiến hành sắc ký tiếp tục gi lần vòng gi Nồng độ đo đ ợc sau gi đ ợc cho b ng sau B ng 3.22μ Kết qu xác định độ ̉n định ngày Gi Mẫu RSD (%) 1(µg/ml) 2,00 1,99 1,99 1,98 1,98 1,98 0,402 (µg/ml) 2,02 2,00 2,00 1,99 1,98 1,97 0,851 (µg/ml) 2,01 2,00 2,03 1,99 1,98 1,98 0,601 Nhận xét thấy, giá trị RSD nh (< 1%) chứng t ph ơng pháp có độ tái lặp t t giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích th i điểm khác sau xử lý mẫu v̀ng tiếng 3.4.ă Phơnă tíchă m uă PQă trongă huy tă t l ngă b nhă nhơnă - ápă d ngă th că t ă tiênă ngăb nhănhơnăvƠăđánhăgiáăhi uăqủăl cămáuăh păph 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn đ ợc chọn vào nghiên cứu Trong 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%) 15 BN nữ (48,4%) Vũ Anh Phương 56 Trường ĐảKả Tự nhiên 70% 60% 50% 40% 65% 30% 20% 10% 19% 16% 0% < 18 tủi 18-50 tủi > 50 tủi Hình 3.17: Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tủi Trong nhóm BN nghiên cứu, tủi thấp 14 tủi, tủi cao 63 tủi, trung bìnhμ 32,1  15,2 Ngộ độc PQ hay gặp độ tủi lao động 18-50 tủi (64,5%) Đặc điểm phân b nhóm tủi BN nghiên cứu t ơng tự nghiên cứu tr ớc tác gi Đặng Thị Xuân, Nguyễn Thị Dụ [4] Vũ Mai Liên [2] t i Trung tâm ch ng độc Đáng ý 16,1% BN ngộ độc PQ Phân b bệnh nhân theo nghề nghiệp đ ợc ch̉ tủi thiếu niên hình 3.18 40% 35% 30% 25% 20% 36% 15% 26% 26% 10% 5% 0% làm ruộng học sinh sinh viên 07% 07% công nhân hành không việc làm Hình 3.18μ Phân b bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp Vũ Anh Phương 57 Trường ĐảKả Tự nhiên Trong s bệnh nhân nghiên cứu, nghề làm ruộng chiếm t̉ lệ cao 11 bệnh nhân (35,5%) phù hợp với việc PQ đ ợc dùng nông nghiệp nên sẵn có nông thôn Học sinh, sinh viên chiếm t̉ lệ cao thứ hai (25,8%) đáng quan tâm Khi xem xét nguyên nhân ngộ độc, hầu hết BN nghiên cứu ngộ độc tự tử (29 bệnh nhân - 93,6%) Ch̉ có BN tai n n (6,4%), BN bất cẩn phun thu c, BN u ng nhầm Trong s n phẩm th ơng m i PQ BN gia đình mang đến viện, Gfaxone 20SL hay gặp nhất, có s tên s n phẩm khác: Gramoxone, Fansipan, Tungmaxone, C cháy 26% S ng Tử vong 74% Hình 3.19: Kết qu bệnh nhân ngộ độc Paraquat 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ Th i gian từ lúc BN u ng PQ lấy mẫu xét nghiệm đ ợc trình bày b ng 3.23 Trung bình th i gian từ lúc u ng đến lúc lấy mẫu xét nghiệm 6,6 ± 4,23 gi Th i gian ngắn gi , nhiều 23 gi Th i gian lấy mẫu sau u ng chủ yếu gi (74,2%) Vũ Anh Phương 58 Trường ĐảKả Tự nhiên B ng 3.23μ Th i gian từ lúc u ng đến lấy mẫu xét nghiệm Th iăgian S ăb nhănhơn T̉ăl ă% ≤ gi 3,2 >2 - gi 22,6 >4 - gi 12 38,7 Sau gi 11 35,5 N ngăđ ăParaquatătrongăhuy tăt ngăkhiăvƠoăvi n:ă Áp dụng quy trình phân tích xây dựng đ ợc, xác định nồng độ PQ huyết t ơng Mỗi mẫu phân tích lặp l i lần Kết qu thu đ ợc b ng 3.24 Giá trị nồng độ PQ huyết t ơng trung bình 8,1 µg/ml (thấp nhấtμ 0,215 µg/ml; cao 88,66 µg/ml) Vũ Anh Phương 59 Trường ĐảKả Tự nhiên B ng 3.24μ Kết qu định l ợng PQ 31 bệnh nhân Dinh Thi P 18 Kieu Anh V 21 Th i gian Giới u ng Vào đến viện XN Nữ 18,68 Nam 21,48 Hoang Van G 60 Nam 38,98 Nguyen T Hong T 42 Nữ 8,6 Vu Thi H 63 Nữ 9,77 Vu Thi H 22 Nữ 3,09 0,26 Nguyen Thi T 22 Nữ 19,3 4,40 Dam Huy Q 48 Nam 14 5,10 2,32 1,90 Đặng Thị H 51 Nữ 0,63 0,03