NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG mẫu HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQtrong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng củangộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng nh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS TẠ THỊ THẢO

2 TS HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và

TS Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốtquá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhânviên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôiđược học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặcbiệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giátrong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoáK24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻnhững khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015

Học viên

Vũ Anh Phương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về paraquat 3

1.1.1 Công thức paraquat 3

1.1.2 Tính chất lý, hóa học của paraquat 3

1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat 4

1.1.4 Dược động học paraquat 6

1.1.4.1 Hấp thu 6

1.1.4.2 Phân bố 6

1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ 7

1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương 7

1.2 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương 9

1.2.1 Phương pháp quang phổ 9

1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 10

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 11

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 19

2.2.1 Chất chuẩn 19

2.2.2 Hoá chất 19

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat 21

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 21

2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương 21

2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương 21

2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương 22

2.3.2.1 Tính chọn lọc 22

2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính 23

2.3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 23

2.3.2.4 Đánh giá độ đúng và độ chụm 23

2.3.2.5 Độ ổn định 23

2.3.3 Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 24

2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao 26

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD 26

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột 26

3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động 28

3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 29

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động 31

3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm 33

3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natriheptanesulfonate 33

3.1.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ KCl 35

3.1.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ PEG 36

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 37

3.1.8 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 39

3.1.8.1 Xây dựng đường chuẩn 39

3.1.8.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 41

3.1.8.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn 42

3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 45

3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA 45

3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy 46

3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích 48

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 49

3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc 49

3.3.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp 49

3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi của phương pháp 49

3.3.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích 50

3.3.3 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại 51

3.3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 51

3.3.3.2 Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích 53

3.3.4 Độ ổn định 56

Độ ổn định trong thời gian phân tích 56

3.4 Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 56

3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 56

3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương trong tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 58

KẾT LUẬN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu 27

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối xứng pic 31

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic 32

Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ natriheptanesulfonate đến thời gian lưu, hệ số đối xứng pic 34

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic 36

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic 37

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic.38 Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ 40

Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lương của PQ 42

Bảng 3.10: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn PQ 43

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phương trình đường chuẩn của PQ 44

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tương .46 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết 46

Bảng 3.14: Kết quả xác định độ ổn định khác ngày 48

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp phân tích PQ 50

Bảng 3.16: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyết tương thêm chuẩn 51

Bảng 3.17: Các đại lượng thống kê 51

Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất 52

Bảng 3.19: Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau 53

Bảng 3.20: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba KTV khác nhau 54

Bảng 3.21: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích 55

Bảng 3.22: Kết quả xác định độ ổn định trong ngày 56

Bảng 3.23: Thời gian từ lúc uống đến khi lấy mẫu xét nghiệm 59

Bảng 3.24: Kết quả định lượng PQ trên 31 bệnh nhân 60

Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tương sau lọc máu hấp phụ 63

DANH SÁCH HÌNH

Chương 1.

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat 3

Hình 1.2 Cơ chế gây độc của paraquat 4

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương, thời gian sau uống, và khả năng sống 8

Chương 3. Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của PQ 26

Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu 27

Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A 28

Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B 29

Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C 29

Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ACN : Đệm %v/v 30

Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của pH 32

Hình 3.8: Sắc đồ khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5.34 Hình 3.9: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của KCl trong pha động 35

Hình 3.10: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của PEG trong pha động 37

Hình 3.11: Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng 38

Hình 3.12: Sắc ký đồ các nồng độ PQ khác nhau từ 0,02 – 10,00 µg/ml 39

Hình 3.13: Đường chuẩn PQ theo diện tích pic 40

Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tương 47

Hình 3.15: Sắc ký đồ PQ trong huyết tương chuẩn áp dụng quy trình xử lý mẫu hình 3.14 48

Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ của phương pháp 49

Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi 57

Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 57

Hình 3.19: Kết quả bệnh nhân ngộ độc Paraquat 58

Hình 3.20: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân sống và tử vong 61

Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP ở bệnh nhân sống và tử vong 62

Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

% RSD % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR

% Reproducibility standard deviation

% Độ lệch chuẩn tái lặptương đối

DAD diode-array detector detector mảng diode

GC - MS Gas chromatography - Mass

HPLC High performance liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC - MS Liquid Chromatography - Mass

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt

SIPP Severity Index of Paraquat

Poisoning

Chỉ số độ nặng của ngộ độcParaquat

TCA Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

ĐẶT VẤN ĐỀ

Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá

thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiệnđang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau Tuynhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong của

PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20% Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm

sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóachất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấpcứu [1] Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27].Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượngbệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùngnghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca Tỉ lệ tửvong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tácgiả nước ngoài [29][32] Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ

tử vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện ChợRẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85%

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQtrong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng củangộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điềutrị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếucác biện pháp điều trị hiệu quả Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nướcngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọcmáu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ chokết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xétnghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánhgiá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này

Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độđịnh tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQmáu với kết quả đáng tin cậy Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩnđoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm choviệc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên

cả nước gặp rất nhiều khó khăn

Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phươngpháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máysắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trìnhchuẩn định lượng PQ huyết tương Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu:

1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người

và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat.

2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về paraquat

1.1.1 Công thức paraquat

Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là

1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tínhdiệt cỏ nhanh và triệt để PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,được tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốctrừ cỏ từ những năm 1950 [42]

PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat

1.1.2 Tính chất lý, hóa học của paraquat

PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQtrong nước 6,5 - 7,5

-PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride Dạng dichloride tinhthể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa PQ ổn định trong dung dịch môi trườngacid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm

PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu nhưkhông tan trong các dung môi hữu cơ khác

PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bềmặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất PQ khôngbay hơi Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43]

PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại vàhàm lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh Một sốtên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,Owen [42].

Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm

sử dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu).Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàmlượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc Thực tế hiện nay trênthế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơngộ độc cấp tính rất lớn

Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay làSyngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh Trên đất nước

họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nướcthứ ba [39]

1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat

Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

Hình 1.2 Cơ chế gây độc của paraquat [15]

Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+ cùng với NADPH trải quamột phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ+) và NADP+ PQ+ phản ứng hầu nhưngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid Có sẵn NADPH và oxy, chutrình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi vàkhông ngừng tạo ra gốc superoxid Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bảnthân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự dohydroxyl [18] [31] Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào Chu trình oxy hoá - khửtạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứngvới lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho

tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40]

Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự

do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu Các thử nghiệm điều trị nhằm vàoviệc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase,α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức Tuy nhiên, cho đến hiệnnay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng

Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫnchưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tácgiữa PQ, NADPH và oxy Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết choviệc hình thành bệnh lý do PQ Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trongviệc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ

PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da,mắt và các niêm mạc Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ làđường tiêu hoá, thận và phổi Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ănmòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao Thận là cơ quanđào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác Riêng

ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo

cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP

Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều cóliên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng lànguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận,viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiếntriển và suy thận [33] Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ cóliên quan với hội chứng Parkinson [21][23].

Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ tronghuyết tương Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thìhầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độtrong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22]

1.1.4 Dược động học paraquat

1.1.4.1 Hấp thu

Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%) Hấp thu chủyếu ở ruột non Khi dạ dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc được hấpthu sẽ tăng lên PQ không gắn với protein huyết tương Nồng độ đỉnh của PQ tronghuyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [6] [37] Tiếp xúc qua da, hấp thuvào cơ thể nói chung chỉ xảy ra khi tiếp xúc kéo dài hoặc da bị tổn thương Tiếp xúcvới PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ được hấp thu đến mức đủ đểgây nhiễm độc Bởi vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làmcho PQ không đi sâu được xuống đường hô hấp để hấp thu [11] Mắt tiếp xúc với

PQ sẽ bị tổn thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân

1.1.4.2 Phân bố

Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng nhất tới tất cả các cơ quan chính nhưphổi, thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi, PQ sẽ bị khử thành dạng gốc tự do hoạt tínhcao [8][22] Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg

PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi

có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần Sau uống 5-7 giờ, nồng độ

PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạtđến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11]

PQ qua được nhau thai Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối vàmáu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11] Không có bào thainào sống sót Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau khôngnguy hiểm đến bào thai.

1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ

PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầuthận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bìnhthường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do

có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài

12-120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạngkhông đổi [8][22]

1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.

Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theothời gian Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làmgiảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…) Proudfoot và cộng sự [29]lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng

độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân Những BNsống có nồng độ dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24giờ sau uống PQ Schermann và cộng sự [35] mở rộng đường cong tiên lượng BNnày lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng

độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốctim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiênlượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống Suzuki và cộng sự(1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượngchính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giátrong vòng 24 h sau uống PQ Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độnặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng

đôi khi tiên đoán sai Nguyên nhân do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặcbiệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh sai số về thời gianthậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đổi hoàn toàn mối quan hệ nồng độ và tiên lượng.Ngoài ra, nồng độ PQ trong huyết tương có thể không hoàn toàn chính xác vì đượcphân tích bằng một số phương pháp khác nhau và các nghiên cứu thường khôngtrình bày rõ nồng độ của ion hay là muối PQ, và thực tế có thể có khác biệt giữacác bệnh nhân về mức độ nhạy cảm với tác dụng độc của PQ, tuy khác biệt nàychưa được nghiên cứu.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian

sau uống, và khả năng sống

Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lượng ngộ độc PQdựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BNsống Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tínhbằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQhuyết thanh (µg/ml) khi vào viện

SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tửvong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP <50) với tử vong sớm do suy tuần hoàn

(SIPP > 50) Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm địnhlượng dùng huyết thanh không phải huyết tương Suzuki và cộng sự (1991) đã sosánh SIPP với đồ thị tiên lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sauuống PQ Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10trường hợp tử vong Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luậnrằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiênlượng chính xác hơn SIPP [36].

1.2 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương

1.2.1 Phương pháp quang phổ

Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trongmôi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm

trong khi Kato K và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester

(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,

có thể chiết được bằng dichloromethane Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định

lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với

Na2S2O4 10% và NaOH 5M

Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điềukiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h vàkhông cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo địnhluật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml Trong khi đó,phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút Cả 2

phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato

K [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ

Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của cácthuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác DQ, có cấu trúc gần giống PQ,

sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêmNaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, cóthể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%

trước khi thêm dung dịch NaOH [30] Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết

được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE cóquang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603

nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M Giới hạn pháthiện 4,77.10-7 M

Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã được ứng dụng để định lượng

PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫuthực phẩm và các mẫu trong môi trường

Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại

bước sóng 257 nm Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ

trong huyết tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật

Lambert Beer với r = 0,996) Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước

sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất Huyết tương sạch và các dungdịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v).Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Lấy dịch trong phần trên đi đo quétbước sóng từ 200 đến 300 nm Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trênđược chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng Trước khi đo, 400

μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích

Na2S2O4 10% và NaOH 5M Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và

đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bướcsóng Δλ = 0,5 nm) Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức

Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24]

1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ

Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,

từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học L Gao [16] và

Almeida R M [5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ Trong cả

hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ionmonitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột Dung dịch mẫu

phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.

Tác giả L Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m × 0,18 mm,

độ dày màng 0,25 µm) Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là

280, 280, 200oC Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút Mẫuđược đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là

70oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút Nhiệt độ 295oC đượcduy trì trong 10 phút Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng

PQ & EPQ Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là0,01 µg/ml đối với cả máu và nước tiểu Phương pháp này đã được áp dụng để phântích các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ

Trong khi đó, Almeida R M và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký

GC-MS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector GC-MSD model 5972)với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút Nhiệt độ của bơm và interface (bộphận ghép nối giữa GC và MS) là 270oC Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng Nhiệt

độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến

270oC và duy trì 270oC trong 4 phút Số khối của các mảnh ion được chọn cho cáchợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220(EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 được dùng để định lượng PQ & EPQ

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P đều định lượng PQ trong mẫu sinh

học bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41]

ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với Tiêm mẫu 5 μl với cột

ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30oC Còn Proenca P sử

dùng hệ thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 ×2,1 mm × 5 µm) Nhiệt độ cột duy trì 35oC Bơm mẫu 10 µl Detector mảng

photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.

Độ hấp thụ UV được đo ở 258 nm

Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile

Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH

3,7 bằng acid formic) và acetonitrile Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc

độ dòng 0,3 ml/phút Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20%trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp Tổng

thời gian chạy là 3 phút Thì tác giả Proenca P dùng pha động gồm acetonitrile và

đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc

độ 300 µl/phút

Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ vàchuẩn nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ

Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY

BSM_SM_Quattro Premier XE MS Tối ưu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêmdòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250

mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h

ở 350oC Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multi-reaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sảnphẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sảnphẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41]

Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy

khối phổ tứ cực Water ZQ 2000 Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt

độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2)

600 l/h Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượngion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)0,1s Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu

(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước

tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994) Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và

nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu.

Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưuvới PQ và chất chuẩn nội

1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trongdịch sinh học [7][17][26]

Arys K và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC Gồm bơm model 126 và

tiêm mẫu type 210A với vòng tiêm mẫu 50 µl Bước sóng hoạt động là 230 nm.Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5µm) với cột bảo vệ 100 RP-select B (4 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 µm) Phađộng là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nước (dung dịch A) và dungdịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1 ml/phút.Chạy pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15phút Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện ban đầu trong 5 phút trước khichuyển sang chạy mẫu mới Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu

và nước tiểu lần lượt là 63 và 32 µg/l

Paixão P [26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được

làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn Hệ thống HPLC gồm bơm mẫumodel 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaParC18 (150×4,6 mm, 5µm) Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm) PQ và chất nội chuẩnđược rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm.Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong

1,19-diethyl-4,49-900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine Acetonitrilenồng độ 10% (v/v) Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml tronghuyết tương và huyết thanh Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối

với huyết tương, huyết thanh Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1%đối với huyết tương, huyết thanh Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lầnlượt là 98,9% và 98,7%.

Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng

phương pháp HPLC Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơmmẫu (20 µl) Rheodyne 7125 PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaKC18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dungdịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M vàsodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v) Tốc độ dòng của pha động 0,5ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC Dịch rửa từ cột HPLC được trộnvới dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn Tốc độ dòng 0,4ml/phút Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bểnước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằngdetector UV Hitachi L- 7405 Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy C-R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật) Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là

50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương

Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

cặp ion đã được Brunetto M.R thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2

bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model

64 để chuyển pha động vào cột chiết Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy cáchạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18(25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích Cột chiết và cộtphân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2nòng Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm vớiflowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu

Các pha động:

- Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM

và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọcmàng 0,45 µm Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thêm 2-propanolnồng độ 3% (v/v)

- Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mMtrong acid orthophosphoric 0,05 M Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu

âm trước khi sử dụng Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền(Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9]

Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

để xác định PQ trong huyết thanh người Trong thí nghiệm này, các mẫu huyếtthanh đã được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile vàdichlormethane, thu được 50 ml dung dịch Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dungdịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh

pH đến 2,0 bằng triethylamine Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256

nm, nhiệt độ cột 40oC Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1

-40 mg/l (r = 0,9999) Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3) Độ lệch chuẩn (RSD)của các mẫu chứng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%,

độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705% - 2,796%, và độ thu hồi của phương pháp xử lýmẫu 96,79 % - 100,07%, và độ thu hồi phương pháp là 91,66% - 108,49% Phươngpháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thểđược sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

* Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để địnhlượng PQ trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]…

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp địnhlượng đó là phương pháp xử lý mẫu

Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinhhọc trong phân tích PQ [5][16][20][28][41] Một số tác giả dùng đệm phosphate đểthêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41]

Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử[20] Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng NaOH Cột đượchoạt hóa bằng 5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột

3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu.Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho quacột để rửa giải PQ & DQ Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M.Mẫu này được mang đi đo quang [20]

Chang-bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml

methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0) Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửavới 2 ml nước khử khoáng Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giảiđược bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitrogen Hòa tan cắn trong 100 µlmethanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC-MS

Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH

7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút Các cộtWaters Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khửkhoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7) Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cộtvới 3 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7), 3 ml nước khử khoáng và 3 ml methanol.Sấy khô chân không cột trong 10 phút Chất phân tích được rửa giải bằng 2 ml dungdịch acid formic 2% trong acetonitrile 80% Bay hơi dịch rửa giải bằng dòng khínitrogen ở 45oC Hòa tan cắn bằng 50 μl pha động (dung dịch acetonitrile vàammonium formate 250 mM tỉ lệ 1:1)

Proenca P [28] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml máu hoặc 1 ml nước tiểu thêm

50 µl chuẩn nội (10 µg/ml) và 2 ml acetonitrile Lắc, ly tâm 2500 vòng/phút trong

10 phút Cột chiết pha rắn (Oasis, 3 cc) được rửa với lần lượt 1 ml methanol và 1 mlnước khử khoáng Đưa mẫu qua cột chiết pha rắn Rửa cột với 1 ml đệm phosphate

pH 7,1 ml nước khử khoáng và 1 ml methanol Sau khi làm khô 10 phút trong chân

không, rửa giải cột với 1,5 ml acetonitrile/water/TFA (84:14:2, v/v/v) Dịch rửa giảiđược bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitrogen ở 40oC Cắn được hòa tan trong 100 µlmethanol và bơm 10 µl vào hệ thống LC-ESI-MS.

Kyoko KATO, P Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26].

Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa proteintrong mẫu huyết tương [7][17][24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy cóthể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm

Phương pháp này được Rai M.K và cộng sự áp dụng để định lượng PQ trong

máu, nước tiểu và sữa mẹ Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acidtrichloracetic 1% vào để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein Lytâm 1850 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30]

Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/mlđược thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1) Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24]

Arys K [7] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn

nội và thêm nước vừa đủ 4 ml Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làmsạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận Thêm 1,5 ml dung dịch acidtrichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút Sau khi chuyểndịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dưới được hòa tan lạibằng 2,5 ml dung dịch acid trichloroacetic 5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100vòng/phút trong 5 phút, gộp phần dịch trong lại, chuyển sang ống silan hóa Tuynhiên ở một số trường hợp đã được chứng minh cần thêm bước ly tâm nữa (2200vòng/phút trong 10 phút) để thu được phần dịch sạch hoàn toàn Đối với nướctiểu và dịch dạ dày, bước loại protein có thể bỏ qua và làm ngay bước tiếp theo

là khử PQ bằng natri borohydride Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH lớn hơn

10 bằng 1 ml NaOH 1M (đối với nước tiểu và dịch dạ dày) hoặc 1 ml NaOH 5M(đối với các mẫu khác) Sau đó, thêm 250 mg bột NaBH4 và lắc ở 60oC trong 25phút Sau khi làm mát ở nhiệt độ phòng, chiết dung dịch với 8 ml diethyl etherbằng máy trong 15 phút Sau khi ly tâm (1100 vòng/phút trong 10 phút), chuyển

lớp hữu cơ phía trên sang ống silan hóa hình nón Bay hơi dịch chiết đến khôbằng dòng khí nitrogen Cắn được hòa tan trong 60 µl pha động (dung dịch A :dung dịch B là 50:50, v/v) và tiêm 50 µl vào hệ thống HPLC.

Theo nghiên cứu của Shuuji Hara và cộng sự [17] chỉ cần lấy 200 µl huyết

thanh trộn với 20 µl dung dịch nội chuẩn (10 µg/ml) và 120 µl TCA 10% và lắcxoáy trong 20 giây, ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, lấy 20 µl dịch nổi

ở trên bơm vào máy

Tóm lại, tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ trongmẫu huyết tương chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp HPLC Trong đó mẫuhuyết tương được loại bỏ protein bằng cách kết tủa với TCA và định lượng trên hệHPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệmphotphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Để xây dựng và xác định giá trị sử dụng của phương pháp phân tích PQ

trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:

- Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu trung ương.

- Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu.

- Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu được từ mẫu máu, ly

tâm lấy phần huyết tương

2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

- KCl tinh thể, độ tinh khiết: 99,5% của hãng Merck

- Acid trichloroacetic tinh khiết 98,5% của hãng Merck

- Acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của hãng Merck

- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu của hãng Merck và đạt tiêu chuẩntinh khiết phân tích (P.A.)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá

- Dung dịch đệm pha động pH = 2,5 được chuẩn bị bằng cách sau: gồm 1,1 gnatri heptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 200 ml MeOH; 0,5 mltriethylamine thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH của pha động bằng H3PO4

đến các giá trị pH mong muốn Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion

- Pha dung dịch chuẩn gốc PQ: Hòa tan 100 mg chất chuẩn paraquatdichloride (C12H14Cl2N2.xH2O), hòa tan trong 100 ml nước để được dung dịch gốc

Từ đó pha thành các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,1 - 20 µg/ml trong nước

Trộn các nồng độ dung dịch chuẩn thứ cấp với huyết tương trắng để có nồng độ PQ0,02 - 10 µg/ml để khảo sát và xác định giá trị sử dụng của phương pháp

- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ đọc của cân 0,0001 g

- Bể siêu âm Model: S30/H Hãng ELMA, Đức

- Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00

- Máy ly tâm Universal 320 hãng Hettich, Đức, tốc độ tối đa 4000vòng/phút

- Máy lắc xoáy model: 3005 của hãng GFL, Đức

- Tủ sấy model: 500 của hãng Memmert, Đức

- Máy cất nước hai lần Model: A4000D/Aquatron hãng Stuart - BarloworldScientific, 4 l/h, Anh

- Bộ lọc nước siêu sạch Model: WaterPro PS/HPLC/UF hybrid - Labconco,115V, 60Hz, Mỹ

 Dụng cụ

- Bình định mức dung tích: 5, 10, 25, 50, 100 ml

- Pipetman các loại từ 0 - 1000 µl

- Bộ lọc dung môi của hãng Agilent, Mỹ

- Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy

Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất,sau đó tráng bằng MeOH và để khô, tráng n-hexan 3 lần sau đó sấy ở 105oC trongvòng 1 giờ, lấy ra để nguội trước khi sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Theo như tính chất đã biết của paraquat dichloride là tan tốt trong nước và íttan trong dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH… Tham khảo các tài liệu và so sánh

về độ phân cực của nước và các dung môi, chúng tôi lựa chọn nước để hòa tan PQ

vì nước không độc hại, thân thiện với môi trường hơn EtOH, MeOH

2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương

Dựa theo tính chất lý hóa của PQ, theo các tài liệu đã công bố và trang thiết

bị phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để tách PQ từ huyếttương như sau:

Với 1 ml mẫu huyết tương, thêm dung dịch TCA để loại protein, lắc xoáy và

ly tâm với nồng độ dung dịch TCA thay đổi là: 2,0%; 4,0%; 5,0%; 6,0% và thờigian lắc xoáy: 30 giây, 1 phút, 2 phút

2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương

Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, các mẫu chuẩnchiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồichạy sắc ký Dựa trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo

* Cột sắc ký: Cột tách có vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trìnhtách có độ phân giải tốt hay không [3] Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứvào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích Dựa trên khảo sát các tàiliệu tham khảo và điều kiện cơ sở vật chất sẵn có tại Trung tâm Chống độc, chúngtôi sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20

mm x 4,0 mm, 5 μm) trong nghiên cứu này

* Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của PQ trong mẫu thử, xác định cực đạihấp thụ của PQ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc

ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD

* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl.

* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ phađộng có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi chophân tích định lượng gồm các hệ pha động sau:

- Hệ A: Kênh 1 là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M trong nước và kênh 2

là dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol Tốc độ dòng 0,5 ml/phút Tỷ lệ thểtích 2 kênh tương ứng là 90 : 10

- Hệ B: Gồm kênh 1 là ACN kênh 2 là dung dịch đệm pH = 3 (10:90, v/v).Thành phần đệm gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 Mtrong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine

- Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natriheptanesulfonate; 2 g KCl; 2 ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 mlMeOH thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH bằng H3PO4 đặc Định mức vừa

đủ 1000 ml bằng nước deion

* Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp chúng tôi tiến hànhkhảo sát thành phần của pha động Giá trị pH pha động cũng được khảo sát trongkhoảng từ 2,5 đến 4,5

* Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl

tR của các chất phải không quá lớn nhưng đảm bảo phải tách xa nhau

2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương

2.3.2.1 Tính chọn lọc

Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng không có PQ và mẫu huyết tương trắng có

PQ Tiến hành xử lý và phân tích mẫu, đánh giá hiệu quả tách PQ ra khỏi nền mẫu

2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính

Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng, thêm PQ để thu được các mẫu chuẩn cónồng độ PQ từ 0,02 - 10 µg/ml Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 8 nồng độ PQđược them vào mẫu huyết tương trắng lần lượt là 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 và

10 µg/ml Sau đó xử lý mẫu và tiến hành phân tích

2.3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Tiến hành xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn có nồng độ khoảng0,01 - 0,1 µg/ml và phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ lệch chuẩn của phươngtrình hồi quy và xác định LOD theo quy tắc 3ϭ, LOQ theo quy tắc 10 ϭ

2.3.2.4 Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)

- Độ đúng: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 5 nồng độ khác

nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký rồi so sánh giá trị trungbình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị chất thêm vào trong mẫu

- Độ lặp lại:

+ Độ lặp lại trong ngày: chuẩn bị các mẫu PQ trong huyết tương trắng ở 3nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ làm 5 lần, xử lý mẫu và phân tích sắc ký như phần

độ đúng, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ

+ Độ lặp lại khác ngày : tiến hành tương tự như trên nhưng làm ở 5 ngàykhác nhau

2.3.2.5 Độ ổn định

Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gianphân tích và thời gian bảo quản

- Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu PQ nồng độ 1 µg/ml

trong huyết tương, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lầntrong vòng 5 giờ, xác định RSDr

- Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như trên, lấy 1 phần

ra xử lý và tiến hành sắc ký ngay, phần còn lại bảo quản ở -30oC trong 21 ngày.Lấy các mẫu đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký ngay vào các ngàythứ 7, 14 và 21

2.3.3 Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ

2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độc bệnh viện BạchMai từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2015

Chẩn đoán ngộ độc PQ dựa vào: bệnh nhân có 1 trong 2 tiêu chuẩn:

- Bệnh nhân uống thuốc trừ cỏ PQ và có biểu hiện lâm sàng ngộ độc PQ

- Xét nghiệm định tính độc chất nước tiểu tìm thấy PQ

2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

- Bệnh nhân có tiền sử bệnh phổi, thận, gan

- Những bệnh nhân ngộ độc đồng thời các chất độc khác

Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca bệnh.

Tiến hành nghiên cứu:

* Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án (theo đánh giá củabác sĩ điều trị):

- Tên loại thuốc trừ cỏ có PQ, hàm lượng PQ trong thuốc trừ cỏ, lượng PQuống, thời gian đến viện, thời gian bắt đầu điều trị

- Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng

- Điều trị lọc máu hấp phụ được áp dụng

- Các điều trị khác: than hoạt, ức chế miễn dịch, liệu pháp lipid

Các số liệu này được dùng trong đánh giá hiệu quả điều trị và mức độ nhiễm độc

* Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và sau các lần lọcmáu hấp phụ:

- Tiến hành lấy máu bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại Trung tâm Chống độcbệnh viện Bạch Mai ngay vào viện khi được chẩn đoán xác định ngộ độc PQ Cácbệnh nhân lọc máu hấp phụ được lấy máu ngay trước và sau lọc Lấy máu tĩnh mạchcánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tương

- Mẫu huyết tương được xử lý và phân tích bằng phương pháp HPLC đã xâydựng Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần (n=3), tính kết quả trung bình Phươngpháp định lượng là phương pháp đường chuẩn.

- Kết quả nồng độ PQ trong mẫu (µg/ml) trong dung dịch thử được tính dựavào đường chuẩn

* Thu thập kết quả điều trị Tỷ lệ tử vong tại viện, sau 3 tháng: ghi số điệnthoại của BN và người nhà, gọi điện thoại xác định tình trạng BN sống/tử vong sau

SIPP = [nồng độ PQ huyết tương (µg/ml)] × [thời gian từ khi uống đến bắt đầu định

lượng (h)]

* Hiệu quả lọc PQ của lọc máu hấp phụ (HP) (dựa vào nồng độ PQ huyếttương trước và sau các lần lọc máu hấp phụ)

*Xử lý số liệu: bằng phần mềm SPSS for Windows 16.0 Số liệu được trình

bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn, hoặc trung vị và tứ phân vị nếu phân bốkhông chuẩn, đánh giá giá trị tiên lượng tử vong của nồng độc Paraquat vào việnbằng cách tính diện tích dưới đường ROC, so sánh giá trị nồng độc Paraquat giá trịtrước sau điều trị bằng test Wilcoxon

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng cao

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD

Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc

ký chảy ra một cách liên tục Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hayhợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích [4] Paraquat là chất cótính hấp thụ quang tốt trong vùng UV do đó detector DAD (Diode - Array Detector)rất tốt cho việc định tính và định lượng chất phân tích

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của

PQ trong dải bước sóng 210 tới 400 nm trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng caoAgilent 1200 với detector DAD

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của PQKết quả trên cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 259 nm Do

đó chúng tôi chọn bước sóng phát hiện chất phân tích đối với PQ là 259 nm

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột

Trên thực tế, một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãngchân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng làmột nguyên nhân gây ra hiện tượng này; nếu lượng mẫu bơm vào cột quá lớn dẫnđến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá

trình tách trên cột sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây rahiện tượng doãng chân pic Tuy nhiên, nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số sẽrất lớn Hệ thống HPLC Agilent 1200 có trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động do đóchúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn thể tích mẫu tiêm vào cột sao cho hiệu quảtách là tốt nhất Thể tích tiêm mẫu được khảo sát giới hạn trong khoảng 10 µl đến

50 µl Quá trình khảo sát được thực hiện trong điều kiện cố định như sau: sử dụngpha động là ACN – dung dịch đệm pH 2,5 (5:95, v/v) với tốc độ dòng là 0,5ml/phút, PQ có nồng độ 5,0 µg/ml

Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫua: 10 µl, b: 20 µl, c: 30 µl, d: 40 µl, e: 50 µl

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu

Thể tích tiêm mẫu (µl) Thời gian lưu (phút) AS

Nhận xét thấy thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả phântích Nếu lượng mẫu tiêm vào cột nhỏ hơn 30 μl thì pic của PQ sẽ không đối xứngtốt, giá trị diện tích pic của các pic này nhỏ, chiều cao pic thấp không chính xác vàdẫn tới kết quả phân tích sai Còn với thể tích mẫu lớn hơn 30 μl thì pic bị kéo đuôi,điều này được giải thích theo thuyết tốc độ (thuyết Van Deemter), khi lượng mẫutăng thì số đĩa lý thuyết (N) của cột giảm, độ phân giải giảm theo vì RS  [10].Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, với lượng mẫu tiêm vào cột là 30 μl thì cho kếtquả tách tốt nhất Vì vậy, chúng tôi chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 30 μl cho cáckhảo sát tiếp theo

3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động

Khảo sát khả năng phân tách PQ trong huyết tương trắng với các hệ phađộng chuẩn bị như trong mục 2.3.1.3 Sắc đồ quá trình tách PQ ra khỏi nền mẫu khi

sử dụng các hệ khác nhau thu được ở hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5

Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trongnước và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v)

Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B(ACN và dung dịch đệm pH = 3 tỷ lệ 10:90, v/v).

Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C(ACN - dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v)

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN - đệm (5:95, v/v)pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt và chọn lọc đối với PQtrong huyết tương, cho pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý Do vậy trongnghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột C8 và chọn hệ dung môi ACN - Đệm(5:95, v/v) làm pha động

3.1.4 Khảo sát thành phần pha động

Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động cóthể ảnh hưởng tới những vấn đề sau trong phép tách sắc ký:

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu trữ của chất tan

- Hiệu lực cột tách (đại lượng Nef)

- Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng của pic sắc ký

Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thường là nước có trộn với một sốdung môi hữu cơ để thu được dung dịch có độ phân cực từ cao tới thấp, phù hợp vớiquá trình tách Căn cứ theo tài liệu số [3] ta có chỉ số độ phân cực của nước là 10,2đơn vị, của ACN là 5,8 đơn vị, từ đó ta tính được độ phân cực của các hệ dung dịchpha động ACN và đệm ứng với các tỷ lệ thể tích khác nhau từ 3:97, 5:95, 10:90,15:85 và 20:80 Công thức tính độ phân cực là:

PI = %Vi x PIi/ 100 (CT 2)Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng C7H15SO3- để tạo phức liên hợp ionvới ion PQ2+, phức chất này là chất không phân cực Trong khi đó, pha tĩnh đượcchọn cũng là cột pha đảo kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phâncực vừa phải thì quá trình tách mới tối ưu

Kết quả khảo sát được cho trong bảng 3.2

Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ACN : Đệm %v/v

a: 20:80; b: 15:85; c: 10:90; d: 5:95; e: 3:97

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối

xứng pic

Tỉ lệ pha động

(ACN: Đệm, v/v)

PI (đơn vị)

Thời gian lưu(phút)

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu

Kết quả cho thấy khi tăng thành phần ACN trong pha động độ phân cực củapha động giảm, thời gian lưu ngắn hơn Ở tỷ lệ thể tích 15:85 và 20:80, độ phân cựccủa pha động thấp, làm cho PQ không tách ra khỏi nền mẫu Ở tỷ lệ 10:90, đã táchđược PQ ra khỏi nền mẫu tuy nhiên tín hiệu đo thấp và pic không cân đối Khi độphân cực của dung dịch pha động tăng, chất bị giữ trong cột lâu làm cho thời gianlưu tăng dài, pic doãng Ở tỷ lệ 5:95, pic chất cân đối AS: 0,87, thời gian lưu ngắnhơn, pic tách tốt ra khỏi nền mẫu Do đó, chúng tôi chọn tỷ lệ thể tích 5:95 là điềukiện tối ưu

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động

Sau khi chọn được hệ dung môi pha động phù hợp là ACN - đệm tỷ lệ5:95, chúng tôi khảo sát lại pH của pha động Trong sắc ký lỏng pha đảo RP -HPLC, pH có vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng tới dạng tồn tại của chất phântích, dạng tồn tại thay đổi thì thời gian lưu trữ chất phân tích trên cột cũng thayđổi Do đó phải lựa chọn pH cho phù hợp với quá trình tách và sự an toàn của cộttách Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn khảo sát pH trong khoảng từ 2,5