NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG mẫu HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS TẠ THỊ THẢO 2 TS HÀ TRẦN HƯNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và TS Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015 Học viên Vũ Anh Phương Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên MỤC LỤC Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Vũ Anh Phương Trường ĐHKH Tự nhiên DANH SÁCH HÌNH Chương 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt % RSD % RSDR ACN AS ATP BN DAD DQ EPQ GC - MS HP HPLC LC - MS LOD LOQ MeOH ppm PQ R ROC RP-HPLC SD SIPP TCA tR Vũ Anh Phương Tên tiếng anh % Relative standard deviation % Reproducibility standard Tên Tiếng việt % Độ lệch chuẩn tương đối % Độ lệch chuẩn tái lặp deviation Acetonitrile Asymmetry factor Adenosin Triphophate Patient diode-array detector Diquat Ethylparaquat Gas chromatography - Mass tương đối Acetonitril Hệ số đối xứng pic Adenosin Triphophat Bệnh nhân detector mảng diode Diquat Ethylparaquat spectroscopy Hemoperfusion High performance liquid Chromatography Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy Limit of Detection Limit of Quantification Methanol Parts per million Paraquat Relative coefficient Receiver operating characteristics Reverse phase-HPLC Standard deviation Severity Index of Paraquat Poisoning Trichloroacetic acid Retention time Sắc ký khí khối phổ Lọc máu hấp phụ Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng khối phổ Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Phần triệu Paraquat Hệ số tương quan Đường cong ROC Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn Chỉ số độ nặng của ngộ độc Paraquat Acid Tricloacetic Thời gian lưu Trường ĐHKH Tự nhiên Tên viết tắt UV-VIS Vũ Anh Phương Tên tiếng anh Ultraviolet-Visible Tên Tiếng việt Tử ngoại và khả kiến Trường ĐHKH Tự nhiên Vũ Anh Phương 7 Trường ĐHKH Tự nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20% Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1] Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27] Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca Tỉ lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác giả nước ngoài [29][32] Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85% Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp điều trị hiệu quả Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc Vũ Anh Phương 8 Trường ĐHKH Tự nhiên PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ máu với kết quả đáng tin cậy Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên cả nước gặp rất nhiều khó khăn Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết tương Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu: 1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để định lượng paraquat 2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội Vũ Anh Phương 9 Trường ĐHKH Tự nhiên CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paraquat 1.1.1 Công thức paraquat Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính diệt cỏ nhanh và triệt để PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, được tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những năm 1950 [42] PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1: Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học của paraquat PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180 oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 - 7,5 PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa PQ ổn định trong dung dịch môi trường acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20 oC), ít tan trong cồn và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ khác PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất PQ không bay hơi Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43] Vũ Anh Phương 10 Trường ĐHKH Tự nhiên BN đến viện trong vòng 10 giờ có nồng độ PQ cao hơn 10 µg/ml đều tử vong Do đó nếu định lượng chính xác PQ trong huyết tương theo thời gian uống sẽ cho phép tiên lượng tử vong Hình 3.20: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân sống và tử vong Căn cứ vào công thức tính chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương (µg/ml)]×[thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP của nhóm BN nghiên cứu trung bình là 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao nhất 354,6) Kết quả biểu diễn kết cục của BN theo điểm SIPP được chỉ ra ở hình 3.20 Các BN ở nhóm sống có điểm SIPP thấp hơn hẳn nhóm tử vong Tất cả các BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong Vũ Anh Phương 67 Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP ở bệnh nhân sống và tử vong Chúng tôi khảo sát chi tiết hơn giá trị của thang điểm SIPP được trình bày dưới dang đường cong ROC (hình 3.23) Diện tích dưới đường cong (AUC) của SIPP là 0,886 Như vậy, điểm SIPP có giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong Giá trị thang điểm SIPP = 25 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (tương ứng 0,82 và 0,88), điểm SIPP trên 40 có độ nhạy 0,73 và độ đặc hiệu đạt 100% có nghĩa BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong Vũ Anh Phương 68 Trường ĐHKH Tự nhiên Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong Nồng độ PQ huyết tương trước và sau lọc mỗi lần lọc được biểu thị trong bảng 3.25 Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tương sau lọc máu hấp phụ Nồng độ trước lọc Nồng độ sau lọc Trung vị (µg/ml) 9,84 (µg/ml) 1,10 Tứ phân vị Trung vị 0,70 - 12,10 0,91 0,23 - 1,60 0,48 Tứ phân vị Trung vị 0,16 - 1,60 0,62 0,08 - 0,60 0,31 Lần HP Lần 1 Lần 2 Lần 3 Số BN p* 12 0,002 11 0,003 6 0,04 Tứ phân vị 0,09 - 0,95 0,001 - 0,54 * Giá trị p xác định bằng Wilcoxon Signed Ranks Test, p