Tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rấtquan trọng.Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cácđiều kiện tách v

MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU ………

Chương 1 - TỔNG QUAN ……….

1.1 Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………

1.1.1 Cấu trúc phân tử ………

1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole …………

1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole

1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole

1.1.5 Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ……… ………

1.2 Phương pháp xác định……….

1.2.1 Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ………

1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ………

1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ………

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu………

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu ………

2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu ………

2.2 Phương pháp nghiên cứu………

2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC …….

2.2.2. Phân tích định lượng bằng HPLC ………

2.3 Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn ….………….

2.4 Hóa chất và dụng cụ………

2.4.1 Hoá chất ………

2.4.2. Dụng cụ ………

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……….

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký ……….

3.1.1 Chọn bước sóng của detector ………

3.1.2 Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 ………

3.2 Chọn pha tĩnh ………

3.3 Tối ưu hóa pha động ………

3.3.1 Nồng độ đệm axetat của pha động ………

3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………

3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ………

3.3.4 Tốc độ pha động

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích ………

3.4.1 Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ)

3.4.3 Độ đúng, độ lặp lại của phép đo ………

3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích ………

3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………

3.5.2 Phân tích mẫu thực ………

KẾT LUẬN ……….

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

triển nông thôn3

4 HPLC High Performance LiquidChromatography Sắc ký lỏng hiệu năngcao

8

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector……… 25

Bảng 3.2: Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích……… 27

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha động……… 29

Bảng 3.4: Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác nhau……… 31

Bảng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động……… 33-34 Bảng 3.6: Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36

Bảng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích……… 38-39 Bảng 3.8: Bảng giá trị các Ftính của các chất phân tích 42

Bảng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43

Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 Bảng 3.11: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm ở các nồng độ thêm chuẩn khác nhau 50 Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các chất phân tích……… 51

Bảng 3.15: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm rảo………. 52

Bảng 3.16: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm rảo……… 53

Bảng 3.17: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm chân trắng………. 54

Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm chân trắng………. 54

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm sú……… 55

Bảng 3.20: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm sú……… 55

Bảng 3.21: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm lớt………. 56

Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm lớt………. 57

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.4: Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động…… 29

Hình 3.5: Píc sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau 29-30

Hình 3.12: Đường chuẩn của chất phân tích trong khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm… 39-40

MỞ ĐẦU

Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hếtcác cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới Một số loại kháng sinh thông thường(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tácđộng có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinhnhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ranhững hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit(SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôitrồng, chế biến nông thủy sản, v.v

Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớnquá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật Khi người tiêu dùng sử dụng thựcphẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ramột loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạnchuyển hóa porphyrin Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất

kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rấtquan trọng.

Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cácđiều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamitnhư sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis,phương pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểmnghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao

Khi R2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn Khi R2 # H, thì chất đó

là tiền thuốc R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng Tuy nhiên nếu R1 là dị vòng thì hiệulực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2-3 dị tố

Cấu trúc Metronidazole(MTD):

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vikhuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh MTD là một trong những thành phần có mặttrong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thươngmại là Enro DC).

1.1.3 Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3]

1.1.2.1 Tính chất vật lý

SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trongnước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin)

MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không khí,

sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng Nóng chảy ở khoảng 159oC – 163oC.Metronidazol khó tan trong nước, aceton

1.1.2.2 Tính chất hoá học

- SAs có tính chất lưỡng tính:

 Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít

Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng

 Có tính axít do có nguyên tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dungdịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):

- Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ vớinaphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.



Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O

Muối diazoni

Ở đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 của phân tử SAs

Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng

1.1.6 Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]

Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không pháttriển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt

SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vikhuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen Ít hoặc không tác dụng trên một số

vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia Không có tác dụngđối với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum) Nhưng lại có tácdụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét

Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chungđều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độkhác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.

Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vikhuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B fragilis), FusobacteriumVeillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C difficile và C perfringens),Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus Nó là hiệu quả đối với B fragilisphân lập kháng với clindamycin

Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và

nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea Các hoạt động khángkhuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trongđường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát

1.1.7 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]

1.1.4.1 Cơ chế kháng khuẩn của SAs

- Ức chế enzym chuyển hóa acid folic

Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị

tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolatsynthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic

- Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn

Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết chomọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:

N N

acid glutamic

pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)

Dihydrofolat syntetase (enzym)

Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat sreductase (enzym)

Acid Tetrahydrofolic

Acid folinic Nucleoprptein

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein

Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trícủa A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợpaxít này Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việctổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trongsuốt thời gian dùng SAs

SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhómchức hoá học:

Ở ngoài mặt phẳng

Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic cósẵn trong môi trường thì không bị SAs tác dụng Tế bào của người và động vật lấy

axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên không bịảnh hưởng bởi SAs Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc trên vikhuẩn.

N H H

S N R

N H H

S O O O

O (-) (-)

N H H

S N R

N H H

S O O O O (-) (-)

1.1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole

Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori vàGardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ Tuynhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thông qua mộtquy trình bốn bước:

- Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân

tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí

- Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào:Metronidazole làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điệntử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vikhuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó

Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylationoxy hóa của pyruvate Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt độngnhư một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ionhydro trong chu kỳ này Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hìnhthành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào

- Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độctương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND

- Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trunggian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.

1.1.8 Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]

Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tínhchất và công dụng khác nhau Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ đượcnghiên cứu trong luận văn này

1.1.8.1 Sulfaguanidin (SGU)

Công thức:

NH S

N

O O

Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol

96o; không tan trong metylen clorit (CHCl3); không tan trong dung dịch có tínhkiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vô cơ loãng Nhiệt độ nóng chảy 189 –

193oC

SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất khôngthể thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãmquá trình trao đổi chất của vi khuẩn Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩnmạnh, được dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứngphù, tăng huyết áp

N

Tính chất: SMP ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng

của ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong

kiềm và axít vô cơ loãng Nhiệt độ nóng chảy của dẫn chất axetyl hoá là 228 –

229oC

SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ ở ruộtnhanh hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu,đồng thời duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài Vì vậydùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh ở đường tiết niệu song cần đề phòng nguy cơtích luỹ gây ngộ độc vì sự đào thải chậm SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễmkhuẩn đường hô hấp, sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế quản, viêm đường niệu đạo (bểthận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v

OCH3OCH3

Tính chất: SDO dạng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan trong

etanol 96o, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vô cơ loãng vàhydroxyt kiềm Nhiệt độ nóng chảy 198oC

SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phếcầu Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, trịsốt rét Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa bỏng SDOcũng có tác dụng kéo dài

O N

CH3

Tính chất: SMX dạng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà Thực tế không tan

trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96o, dễ tan trong axeton, tantrong các dung dịch hydroxyt kim loại kiềm loãng Nhiệt độ nóng chảy là 169 -

172oC

SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợpvới pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa axítdihydrofolic SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hôhấp, tai - mũi - họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đường tiêu hoá,v.v

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAstrong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định

dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độlặp lại cao

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất saukhi rửa giải Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã

mở rộng khả năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đốivới phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất làtách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp Còn thông dụng người ta dùngdetector UV-Vis hay detector huỳnh quang Dùng detector UV-Vis thì xác địnhđược nhiều loại chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọchơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu

Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác địnhhàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfa-methazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazonesulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC- detectorhuỳnh quang Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm100-5 C18 AB Chương trình pha động (gồm: dung dịch H3PO4 0,02M và hỗn hợpmetanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H3PO4 và đến 45 phút 45 %

H3PO4, tốc độ dòng 0,6 ml/phút Thể tích mẫu tiêm 10l Bước sóng kích thích405nm, bước sóng phát xạ 495nm Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thuhồi nằm trong khoảng 60-70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ hơn 5 g/kg

Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV tại bước sóng266nm Điều kiện chạy sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhm, 4.6 mm x 25.0 cm) KênhA: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6) Kênh B: ACN Sử dụng gariend phađộng như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95%A- 5%B Tốc độ pha động 1ml/phút Nồng độ của SAs được phát hiện trong mẫu từ

11 tiểu bang trên bán đảo Malaysia là 0,006-0,062 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/g trong nhu mô và 0,08-0.193

μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/g trong gan

Rodrigo H.M.M Granja, Alfredo M Montes Niño, Fernanda Rabone andAlessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV đểxác định sunfamit trong mật ong Sulfonamid được trích xuất từ mật ong vớidichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha rắntrên các cột Florisil Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng caovới phát hiện tia cực tím Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/kg, 4 mg/kg

và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ứng vớihiệu suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% chosulfadimethoxine ở mức 100μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/kg

Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều côngtrình nghiên cứu còn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD),detector điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.

Tác giả Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC DAD để phân tích đồng thời dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin,sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfa-chlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin) Điều kiệnchạy sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5m) Pha động là axetonitril (A) và dungdịch đệm axetat pH = 4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41%

-B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút Detector DAD đặt 270nm Chuẩn bị mẫu: Cân 10gmẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml Thêm vào đó 10g

Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút Đem ly tâm với tốc độ 3000vòng/phút trong 10 phút Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml Quá trìnhchiết như vậy được lặp lại lần hai Kết hợp hai phần chiết lại đem cô cạn bằng hútchân không Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat Chiết pha rắn: Cột Speediskđược hoạt hoá bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat Sau khi bơm mẫu vào cộtđược rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa giải bằng 20ml hỗn hợpmetanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích) Dung dịch thu được làm khô trongđiều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với0,1% metanol Lọc qua catridge 0,45 và 0,2l trước khi bơm vào máy HPLC.Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới hạn pháthiện 0,05 g/kg

W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xácđịnh đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorpyrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà Điều kiện chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C8 (250 ×2mm, kích thước hạt nhồi 5m) Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) vàaxetonitril (B), chạy gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động

0,35 ml/phút Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối vớichất nội chuẩn) Phương pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.

Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác địnhcác chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau Tuy nhiên, nhiều chất có thểkhông được phát hiện trong HPLC vì không chứa các màu, huỳnh quang hoặcnhóm khử oxy hóa Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các phản ứng dẫn xuấthóa Một phản ứng dẫn xuất hóa là cần thiết để tăng độ nhạy cảm hay chọn lọc và

có thể đạt được bởi một phát hiện cụ thể, chẳng hạn như huỳnh quang hoặc hấp thụtrong ánh sáng nhìn thấy, tại một bước sóng cao Ngày nay, có rất nhiều công trìnhnghiên cứu ứng dụng lý thuyết này để phát hiện và tách các sulfamit trong các mẫusinh học phức tạp

PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượngsulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine,sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine,, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLCvới dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây làOPA (o-phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME) Phát hiện huỳnhquang: Eex =302nm; Eem = 412nm Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu:acetonitrile-nước (3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60)trong 15 phút Cuối cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút,tốc độ 0,5ml/phút Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trongethanol 2% 0,7M H3PO4) được thêm bởi bơm nhu động tại tốc độ 0,25ml/phút.Chúng được trộn lẫn và phản ứng trong cuộn PTFE (2,5 0,8 I.D) ở 40oC Đườngchuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit còn lại 0,02 -2 µg/ml

Craig D.C Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương phápHPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mô lợn, gan bò,cừu ,ngựa , thịt gà, gan cá, thức ăn chăn nuôi Mẫu trích được bảo quản trong đệm

pH 3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine Các chất

dẫn xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động:acid phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (Eex = 405nm; Eem =495nm) Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả các sulfamit được 0,01 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/g,ngoại lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/g

Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao,Jie Han[23] cũng xác định dư lượng đồng thời là 12 sulfamit (sulphadiazine,sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine,sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomethoxine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịtbò) bởi HPLC với detecto UV Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chấtsulfamit với 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và cácđiều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa Các giới hạn phát hiện cho các hợp chấtsulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá Dư lượng sulfamittrong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắnvới C18 Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trungbình trên 70% Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm) Kênhg/kg

1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trongnhững năm gần đây

Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UVxác định đồng thời ranitidine và metronidazole trong huyết tương 250ml huyếttương sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vàoHPLC Điều kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH2PO4 10mM(pH=3,5) –ACN(90:10,v/v), phát hiện UV tại bước sóng 315nm Phương pháp này cho độ

chính xác cao (RSD <15%) Hiệu suất thu hồi: ranitidine (96,22 ± 3,52);

metronidazole (95,00 ± 4,50%) Định lượng ranitidine trong huyết tương là20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml

Năm 2007 Naser Tavakoli[20]và cộng sự cũng đã sử dụng HPLC để xácđịnh đồng thời metronidazole và amoxicillin Điều kiện sắc ký: cột C18, pha động

pH =4, phát hiện bởi detector UV tại bước sóng 254nm Khoảng tuyến tính củaamoxicillin 0,15- 600(mg/ml); metronidazole 0,13 -300mg/ml Giới hạn phát hiệncủa amoxicillin (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 0,1mg/ml,LOQ:0,13mg/ml)

Cũng vào năm đó Han-Wen Sun[17] đã xác định đồng thời dư lượng 7nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole,secnidazole và các chất chuyển hóa chung của ronidazole và hydroxydimetridazoletrong thịt bằng phương pháp HPLC –UV Điều kiện tách: cột silica C18, pha động

H2O- ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm Hiệu suất thu hồi cho cácmẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4-99,5% Khoảng tuyến tính từ 0,7-60mg/kg Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn vàthịt xông khói tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2-13,9% và 20 mg/kg : 4,0-8,7%

Năm 2008 Hadir M Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thờimetronidazole và spiamycin trong cá sử dụng phương pháp HPLC –UV Điều kiệnsắc ký: cột tách C18 Sep-Pak, pha động: rửa giải gradient 0,05M đệm phosphate(pH =2,4)-ACN, tốc độ dòng 1ml/phút Khoảng tuyến tính của metronidazole:0,005-1,000mg/g, LOD:0,002mg/g, LOQ:0,005mg/g Khoảng tuyến tính củapiamycin: 0,025 -1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g

1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình

đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau

Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chấtkháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β lactam(penicillin và cephalosporines), nitroimidazoles và tetracycline trong nước thải bệnhviện Phương pháp phân tích là HPLC – MS Các chất phân tích có nồng độ thay

đổi theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h Nồng độ chất phân tíchthay đổi trong phạm vi sau đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6-101,0 (mg/l); metronidazole0,1-90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4-12,8(mg/l);ofloxacin:0,2-7,6(mg/l);

trimethoprim 0,6-7,6(mg/l); doxycycline 0,6-6,7(mg/l)

Năm 2007, Wang P, Li J, Zheng H [31] đã xác định đồng thời 7 sulfamit(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonomethoxine, sulfamethoxazole) và metronidazole, chloramphenicol trong mỹ phẩmbằng sắc ký HPLC-PDA Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x 4,6

mm, 5µm) Pha động : axit formic0,1% - acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ dòng chảy1,0 ml/phút Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm Giới hạn định lượng 3 - 80 mg/

g Khoảng tuyến tính của các sulfamit 20-200 mg/ml Khoảng tuyến tính củametronidazol, chloramphenicol 40-400 mg / ml Hiệu suất thu hồi trung bình là83,8% - 105,3% Độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 5% Phương pháp này thườngđược sử dụng cho việc xác định bảy sulfamit và metronidazole, chloramphenicoltrong mỹ phẩm

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5 Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

2.5.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Ở Việt Nam nuôi tôm đã trở thành hoạt động quan trọng nhất và được xem làmục tiêu chủ yếu của kế hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản Sự phát triển nhanhchóng của nghề nuôi tôm dẫn đến tình hình sử dụng thuốc và hóa chất cũng giatăng Họ thuốc kháng khuẩn SAs, MTD là nhóm có hoạt phổ rộng, được sử dụngnhiều trong chăn nuôi tôm để phòng ngừa và chữa nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn chovật nuôi Sau khi vật nuôi đã sử dụng các chất đó, nếu không đảm bảo thời giancách ly để vật nuôi tự làm sạch thì sẽ có tồn dư chất kháng khuẩn có thể gây tổn hạicho sức khoẻ người tiêu dùng

Dư lượng kháng sinh trong tôm tác động xấu cho người tiêu dùng đã đượccảnh báo từ nhiều năm trước nhưng đến nay vẫn còn tồn tại vì thế các nghiên cứuliên quan đến lĩnh vực này hiện rất quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện sựbền vững trong nuôi tôm theo định hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm

có chất lượng và an toàn

Vì vậy đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là Metronidazolesulfaguanidin(SGU),sulfamethoxypyridazon(SMP),sulfadoxim(SDO),sulfamethoxazon (SMX) được sử dụng nhiều trong chăn nuôi

Mục tiêu của đề tài chính là cần tìm ra phương pháp có thể tách và xác địnhđồng thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phùhợp với trang thiết bị sẵn có Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phươngpháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối làdetector UV-Vis

2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định

đồng thời các Sas, MTD bằng HPLC sử dụng cột chiết pha ngược dùng detectorUV-Vis

Vì vậy để xây dựng được một quy trình phân tích tốt, chúng tôi đã nghiên cứumột cách có hệ thống các vấn đề sau:

Tối ưu hoá các điều kiện tách và định lượng đồng thời năm chất bằng HPLC:

 Chọn bước sóng của detector

 Chọn pha tĩnh

 Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ…

 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

 Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo

Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:

 Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi

Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tíchmột số mẫu tôm

2.6 Phương pháp nghiên cứu

Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rấtphức tạp Vì vậy chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High Performance LiquidChromatograghy - Sắc ký lỏng hiệu nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách vàđịnh lượng các chất

2.6.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC [4 ; 8]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chấttrong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chấtnhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ

số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả táchsắc ký tốt Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợpnhất Chất tan sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển đến detector để phát

hiện Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau

Trong một hệ pha HPLC, dung lượng hấp phụ của pha tĩnh được đặc trưngbằng hệ số dung tích k’ Nếu k’ càng lớn thì chất phân tích sẽ bị lưu giữ càng nhiều

trên cột tách Hệ số dung tích được tính theo biểu thức :

o

o R

t

t t k'   (tR: thời gian lưutổng cộng, to: thời gian không lưu giữ)

Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:

 Tương tác hấp phụ

 Tương tác trao đổi ion

 Tương tác theo cơ chế rây phân tử

 Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khácnhau:

 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP - HPLC và hấp phụ pha ngược

RP - HPLC)

 Sắc ký trao đổi ion (EX - HPLC)

 Sắc ký rây phân tử (Gel - HPLC)

Đối với hệ NP - HPLC, pha tĩnh là các chất phân cực, pha động là dung môikhông và kém phân cực Ngược lại trong hệ RP - HPLC, pha tĩnh kém phân cực,thông thường pha tĩnh là các chất phân cực đã được silan hoá bề mặt tạo thành cácvật liệu nhồi kém phân cực Pha động trong hệ này là các dung môi phân cực Khácvới hệ pha thường dùng cho các chất không phân cực hay ít phân cực, hệ này có thểphân tích nhiều loại chất với độ phân cực khác nhau Do các ưu điểm như xác địnhđược nhiều loại chất, hiệu quả tách tốt, dung môi ít tốn kém hơn NP – HPLC nênngày nay sắc ký lỏng hiệu năng cao theo cơ chế hấp phụ pha ngược được sử dụngnhiều hơn

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ

2.6.2 Phân tích định lượng bằng HPLC

Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thờigian lưu tRi của chất đó trên cột tách Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu này đểđịnh tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tíchthu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất Thông thườngtrong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vàochiều cao pic hoặc diện tích

H = k.Cb

S = k.CbTrong đó:

H - chiều cao pic sắc ký của chất

S - diện tích pic sắc ký của chất

k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1

Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:

H = k1.C = f(C)

S = k2.C = f(C)

Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo phươngpháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn Dùng phương pháp đường chuẩnthì nhanh, đơn giản Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏthì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.

Đối với các pic tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của diệntích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn Tuy nhiên,trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích Nên trongphân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic Tuy nhiên đốivới các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc đo diện tích píc lạichính xác hơn

Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vàonồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng

độ chất theo phương pháp thêm chuẩn

2.7 Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn [9]

Khi lượng chất phân tích có trong mẫu quá nhỏ, bước làm giàu chất phân tíchqua cột chiết pha rắn là rất cần thiết Hơn nữa, mẫu thực phẩm là loại mẫu có nềnrất phức tạp, ngoài chất phân tích còn có rất nhiều các chất béo khác nên cần phảichiết pha rắn để lấy các chất phân tích một cách định lượng từ dung dịch, loại tạpchất và thu hồi toàn bộ nó Sau khi làm sạch chất phân tích được rửa giải vào mộtthể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định lượng khỏi dung dịch nên có hệ số làmgiàu cao Cơ sở chính của phưong pháp này về căn bản rất giống với sắc ký lỏng (đãđược giới thiệu ở trên), chỉ khác ở chỗ: HPLC tách các hợp chất trong một hệ cópha động chảy liên tục, trong khi chiết pha rắn giữ chất phân tích ở chất hấp phụ,các tạp chất bị loại vào pha động và chất phân tích được rửa giải vào dung môi thíchhợp sau đó Chiết pha rắn là một dạng HPLC đặc biệt, chỉ giữ chất này và khônggiữ chất kia HPLC đòi hỏi một cột (pha tĩnh) có số đĩa lý thuyết lớn (hàmg trămngàn đến hàng triệu đĩa) trong khi chiết pha rắn chỉ yêu cầu một cột có số đĩa lýthuyết nhỏ (khoảng vài chục đĩa)

Nguyên tắc chung của phương pháp chiết pha rắn

Chiết pha rắn là quá trình chuyển chất tan (chất phân tích) từ pha lỏng sangpha rắn Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm sạch mẫu phân tích.Quá trình chiết pha rắn được tiến hành qua 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Hoạt hoá chất hấp thu (pha rắn): Người ta cho dung môi chảy qua

cột chiết để thấm ướt các hạt pha rắn, hoạt hoá các nhóm chức, đuổi bọt khí, lấp đầydung môi vào các khoảng trống Sau khi hoạt hoá, pha rắn cần được ngâm trongdung môi

Giai đoạn 2: Cho mẫu phân tích chảy qua cột chiết Các chất phân tích bị hấp

thu thành dải ở phần đầu của cột chiết nhờ lực tương tác Van-de-van(Vanderwaals), cũng có thể lực liên kết hidro; lực lưỡng cực - lưỡng cực hoặc theo

cơ chế trao đổi ion

Giai đoạn 3: Giai đoạn làm sạch mẫu phân tích.

Người ta tiến hành rửa cột chiết bằng dung môi để loại bỏ các chất lạ bị hấpthu cùng với chất phân tích

Giai đoạn 4: Rửa giải toàn bộ chất phân tích bằng một lượng nhỏ dung môi.

Hệ số làm giàu càng cao khi lượng dung môi rửa càng ít

2.8 Hoá chất và dụng cụ

2.8.1 Hoá chất

Sulfadoxin (SDO), sulfaguanidin (SGU), sulfamethoxypyridazine (SMP),sulfamethoxazon(SMX), metronozazol(MTD) tinh khiết 99.9% của Viện Kiểmnghiệm Dược Bộ y tế - Hai Bà Trưng, Hà Nội

Dung dịch gốc 1000 g/ml được pha từ lượng cân trong metanol tinh khiếtHPLC, dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Các dung dịch chuẩnđược pha từ dung dịch gốc bằng dung môi giống như pha động chạy sắc ký để tránhpic ảo do sai khác dung môi gây ra

Metanol (MeOH), axetonitril (ACN), axít axetic, muối natri axetat loại tinhkhiết HPLC của hãng Meck, Đức

Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách: chuẩn bị 2 dung dịch:

- Dung dịch CH3COONa.H2O có nồng độ 100mM: cân một lượng chính xácchất phân tích loại tinh khiết đã tính trước, hoà tan bằng nước cất hai lần, chuyểnvào bình định mức dung tích 250ml, định mức.

- 250ml dung dịch axit acetic nồng độ 100mM: được chuẩn bị bằng cách phaloãng từ axit acetic đặc của Meck

- Chỉnh pH của dung dịch bằng cách trộn dung dịch CH3COONa.H2O và axitacetic với tỉ lệ xác định, sao cho nồng độ đệm bằng 10mM

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm:

 Bộ loại khí cho dung môi, Degasser – DGU-14AM

 Van trộn dung môi FCV-10ALVP

 Bơm dung môi bốn kênh LC-10ATVP

 Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-10 ASVP

 Van bơm mẫu 6 chiều VS-7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòngmẫu (sample loop) 20µl

 Detector UV – Vis SPD- 10AVVP

 Hệ điều khiển SCL-10AVP

 Phầm mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1

Cột chiết pha rắn : ODS, Sbề mặt : 546 m2/g ; kích thước lỗ trung bình : 60Ao,

pH =7, kích thước hạt : 54µm

Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy,máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký

3.1.1 Chọn bước sóng của detector

Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là HPLC ghép nối detector UV –Vis Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sởtính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một độ dài sóng nào

đó Chính vì thế để thu được pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo ở cực đạihấp thụ

Dựa trên cấu trúc của các SAs, MTD trong phân tử đều có chứa vòng liênhợp và chứa các nhóm mang màu và trợ màu làm tăng khả năng hấp thụ trong vùng

tử ngoại Tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng UV trên máy UV-Vis

8453 trong những điều kiện sau:

Nồng độ chất phân tích 1 ppm đối với các chất

Kết quả được thể hiện ở hình 3.1:

d/SMX Chồng các phổ:

1:SGU, 2:SDO, 3:SMP, 4:SMX, 5:MTD

Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các SAs

Từ quang phổ, chúng tôi thấy rằng các chất hấp thu cực đại tại bước sóngkhông khác nhau nhiều và nằm trong khoảng 260-275nm Riêng MTD hấp thụ cựcđại tại320nm Vì vậy, để có bước sóng chung cho 5 chất chúng tôi chọn bước sóng270nm cho các thí nghiệm tiếp theo Đồng thời để định lượng chất MTD nhạy hơn,Detecto để 2 kênh 320nm và 270nm Để kết quả chính xác hơn,chúng tôi khảo sát

sự thay đổi diện tích pic sắc ký theo bước sóng của detector Tiến hành bơm mẫu

hỗn hợp 5 chất trong vùng điều kiện tách nhưng ở bước sóng khác nhau Kết quả

thu được trình bày trong bảng 3.1:

Bảng 3.1: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector

Hình 3.2: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector

Qua đồ thị chúng tôi thấy: tại bước sóng 270nm các chất SGU,SMP,SDO,SMX đều đạt diện tích pic cực đại, tuy nhiên đối với MTD tại bước sóng 270nm thìdiện tích chưa đạt cực đại Khảo sát thêm khoảng bước sóng 300 – 330nm đối vớiMTD, chúng tôi thấy MTD đạt diện tích cực đại tại bước sóng 320nm(Spic = 258931mAu.s) Kết quả sự phụ thuộc của diện tích pic vào bước sóng phù hợp với việcquét phổ hấp thụ UV- Vis riêng rẽ các chất Như vậy, để định lượng tốt nhất 5 chấtphân tích, chúng tôi đặt detector ở 2 kênh 270nm và 320nm trong quá trình chạy sắcký

3.1.2 Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18

Thời gian lưu được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chấttan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại Thời gian lưu phụ thuộc vào:

 Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp )

 Pha động chạy sắc ký( loại dung môi, thành phần, tốc độ…)

 Bản chất và cấu trúc phân tử của các chất phân tích

 Môi trường pH của pha động

Muốn tách và xác định đồng thời các chất phân tích, chúng ta phải biết thứ tựxuất hiện pic của các chất Vì vậy, việc khảo sát thời gian lưu là cần thiết và đượcthực hiện như sau: Pha 5 dung dịch chuẩn nồng độ 1,0ppm trong pha động chạy sắc

ký (20% ACN – 80% dung dịch đệm axetat, nồng độ dung dịch đệm 10mM,pH=4,5) Nhiệt độ: 30oC Tốc độ pha động: 1ml/phút Detecto UV-Vis: 2 kênh270nm và 320nm Sau đó tiến hành chạy sắc ký trong cùng điều kiện đã chọn Kếtquả thu được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.3:

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0 mAU(x10) Detector A Ch1:270nm

Thời gian lưu của các chất phân tích

Bảng 3.2: Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích

3.2 Chọn pha tĩnh

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định tới hiệu quả tách Bản chất phatĩnh quyết định cơ chế tách và khả năng lưu giữ của chất tan Tuỳ theo bản chất củachất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột cho phùhợp quá trình sắc ký.

Hệ pha ngược được ứng dụng phổ biến do độ ổn định, độ lặp lại và khả năngtách được nhiều loại chất Ngoài ra dung môi khi sử dụng cho pha ngược có tínhkinh tế hơn Để nghiên cứu tách và xác định các SAs, MTD đa phần là chất phâncực do đó chủ yếu các công trình công bố đều sử dụng cột tách chứa chất nhồi phađảo như RP- C4, RP – C12 ….Cột RP – C18 với kích thước hạt nhồi 5µm của hãngSulpenco- Australia được chọn để tách các chất trên

3.3 Tối ưu hoá pha động

3.3.1 Nồng độ đệm axetat của pha động

Các giá trị nồng độ dung dịch đệm được lựa chọn khảo sát trong khoảng 2 –20mM Điều kiện đo như sau:

mV(x1,000) Detector A Ch1:270nm