nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)

nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit (luận văn thạc sĩ)

Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CHẤT KHÁNG SINH METRONIDAZOLE VÀ CÁC SULFAMIT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU ………………………………………………………………… Chƣơng - TỔNG QUAN ……………………………………………… 1.1 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 1.1.1 Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 1.1.2 Tính chất vật lý hoá học Sulfamit, Metronidazole ………… 1.1.3 Tính chất dược lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole 1.1.5 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 1.2 Phƣơng pháp xác định……………………………………………… 1.2.1 Một số công trình nghiên cứu xác định Sas phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………… 1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ……… Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu………………… 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên cứu ………………………………… 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu …………………………………………… 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phương pháp HPLC …… Luận văn Thạc sĩ 2.2.2 Bùi Minh Thái Phân tích định lượng HPLC ………………………… 2.3 Giới thiệu chung phƣơng pháp chiết pha rắn ….………… 2.4 Hóa chất dụng cụ…………………………………………… 2.4.1 Hoá chất ………………………………………………… 2.4.2 Dụng cụ ……………………………………………………… Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký ……………………………………… 3.1.1 Chọn bước sóng detector …………………………………… 3.1.2 Thăm dò khả tách Sulfamit cột RP-C18 ……… 3.2 Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 3.3 Tối ƣu hóa pha động ………………………………………………… 3.3.1 Nồng độ đệm axetat pha động ……………………………… 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………… 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 3.3.4 Tốc độ pha động 3.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích ………………………………… 3.4.1 Khảo sát lập đường chuẩn khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 3.4.2 Giới hạn phát (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) 3.4.3 Độ đúng, độ lặp lại phép đo ………………………………… 3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý kết phân tích ………………… 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 3.5.2 Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… KẾT LUẬN ……………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái MỞ ĐẦU Dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề quan ngại hầu hết quan kiểm soát thực phẩm giới Một số loại kháng sinh thông thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) thân gây tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, số loại khác kháng sinh nhóm nitrofurans qua trình trao đổi chất thể động vật sinh hợp chất có độc tính cao thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, sử dụng nhiều trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v.v Việc sử dụng chất cách tùy tiện dẫn đến tồn dư lượng lớn giới hạn cho phép thể động vật Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay chất kháng sinh thời gian dài gây loạt phản ứng rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn chuyển hóa porphyrin Cho nên việc xác định xác lượng sulfamit, chất kháng sinh thức ăn chăn nuôi lượng tồn dư sản phẩm từ động vật quan trọng Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên cứu điều kiện tách xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole sulfamit sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp có độ chọn lọc, độ nhạy tốt trang bị nhiều sở kiểm nghiệm nước ta, có tính khả thi ứng dụng vào thực tế cao Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Chƣơng - TỔNG QUAN 1.2 Giới thiệu chung sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1 Cấu trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO NH R1 Khi thay nhóm R1, R2 gốc khác nhau, có SAs khác nhau.Vì có họ SAs Khi R2 = H sulfamit có hoạt tính kháng khuẩn Khi R2 # H, chất tiền thuốc R1 mạch thẳng, dị vòng Tuy nhiên R1 dị vòng hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường dị vòng 2-3 dị tố Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt vi khuẩn kỵ khí động vật nguyên sinh MTD thành phần có mặt thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản (với tên thương mại Enro DC) 1.1.3 Tính chất vật lý hoá học Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.2.1 Tính chất vật lý SAs dạng tinh thể màu trắng vàng nhạt, không mùi, thường tan nước, tan dung dịch axít, tan dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin) Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái MTD tinh thể bột kết tinh, vàng, không mùi, bền không khí, sẫm màu dần tiếp xúc với ánh sáng Nóng chảy khoảng 159oC – 163oC Metronidazol khó tan nước, aceton 1.1.2.2 Tính chất hoá học - SAs có tính chất lưỡng tính:  Có tính kiềm có nhóm amin thơm tự do, nên tan dung dịch axít Ví dụ: cho kết tủa muối picrat dung dịch HCl loãng  Có tính axít có nguyên tử H N-amit linh động, nên dễ tan dung dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin): R H2N SO2 R N H2N SO2 N H H H2N SO2 N R Na - SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag+, tạo phức màu kết tủa với ion Cu2+, Co2+, … - Ở nhóm amin bậc SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước sóng hấp thụ cực đại 270-273 nm - Nhóm amin thơm tự cho phản ứng diazo hoá, ngưng tụ với ản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ bước sóng 460nm Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O Muối diazoni Ở đây, Ar – thành phần -C6H5-SO2NH-R1 phân tử SAs Nhờ mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp diễn dễ dàng Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 1.1.6 Tính chất dƣợc lý phổ tác dụng Sulfamit, Metronidazole [3,6,9] Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, làm vi khuẩn yếu đi, không phát triển sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt SAs có phổ tác dụng hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen Ít không tác dụng số vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia Không có tác dụng virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum) Nhưng lại có tác dụng lên số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét Tính hấp thu đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, SAs nói chung hấp thu nhanh ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ khác nên thời gian có tác dụng khác Metronidazole có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh vi khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm B fragilis), Fusobacterium Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm C difficile C perfringens), Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus Nó hiệu B fragilis phân lập kháng với clindamycin Metronidazole có hoạt động ức chế miễn dịch kháng viêm, sử dụng bệnh nhân bị bệnh rosacea Các hoạt động kháng khuẩn metronidazole làm thay đổi trao đổi chất vi khuẩn acid mật đường ruột, giảm ngứa bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát 1.1.7 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.4.1 Cơ chế kháng khuẩn SAs - Ức chế enzym chuyển hóa acid folic Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt có gốc R mang dị vòng, dị vòng dị tố tốt dị vòng dị tố Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic - Ngăn cản tổng hợp axít folic vi khuẩn Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Vi khuẩn tổng hợp chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho tế bào sống) theo sơ đồ sau: OH N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 COOH N COOH H2N N acid glutamic A.PAB N + (vitamin H ) pterin pteoryl Acid folic (acid pteoryl glutamic) Acid Dihydrofolic Dihydrofolat syntetase (enzy m) Dihydrofolat sreductase (enzy m) Acid Tetrahydrofolic Nucleoprp tein Acid folinic Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein Theo sơ đồ đối kháng A.PAB SAs cạnh tranh vào vị trí A.PAB thành phần phân tử axít folic trình vi khuẩn tổng hợp axít Khi nồng độ đủ cao SAs chen vào vị trí A.PAB làm cho việc tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ Sự tranh chấp A.PAB SAs rõ ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần trì nồng độ có tác dụng máu suốt thời gian dùng SAs SAs thay A.PAB chúng giống hình dạng, kích thước nhóm chức hoá học: o 6.9 Ao 6.7 A O O H2N o C 2.3 A H2N o S 2.4 A O OH NH - R Ở mặt phẳng A.PAB Sulfamit Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Như vi khuẩn không cần đến axít folic lấy axít foclic có sẵn môi trường không bị SAs tác dụng Tế bào người động vật lấy axít folic từ bên vào vitamin (axít folic vitamin B9), nên không bị ảnh hưởng SAs Khi dùng SAs để chữa bệnh có tác dụng chọn lọc vi khuẩn H H HH H H N N N (-) N S O (-) (-) OS S N O R R O O H H N O S (-) O O anion sulfamit anion PAB 1.1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn Metronidazole Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí Helicobacter pylori Gardnerella vaginalis, chế hành động chưa hiểu rõ Tuy nhiên, hoạt động chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy thông qua quy trình bốn bước: - Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole hợp chất có khối lượng phân tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào vi sinh vật kỵ khí hiếu khí - Làm suy giảm hoạt hóa vận chuyển protein tế bào: Metronidazole làm giảm pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển điện tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) ty thể vi khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ATP qua decarboxylation oxy hóa pyruvate Với metronidazole tế bào, nhóm nitro hoạt động chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường chuyển giao cho ion hydro chu kỳ Tác dụng làm suy giảm metronidazole thúc đẩy hình thành hợp chất trung gian gốc tự độc hại tế bào Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái - Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - tiểu phân trung gian độc tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA phá hủy chuỗi AND - Sự phá vỡ sản phẩm trung gian gây độc tế bào - tiểu phân trung gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối không hoạt động 1.1.8 Một số chế phẩm Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9] Như ta biết, SAs có họ gồm hàng nghìn chất, với tính chất công dụng khác Vì vậy, sâu vào bốn SAs nghiên cứu luận văn 1.1.8.1 Sulfaguanidin (SGU) Công thức: O O S NH H2N NH2 HN Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan nước, axeton, etanol 96o; không tan metylen clorit (CHCl3); không tan dung dịch có tính kiềm; tan tốt dung dịch axít vô loãng Nhiệt độ nóng chảy 189 – 193oC SGU nhiều SAs khác có cấu trúc giống A.PAB - chất thiếu cho phát triển vi khuẩn Nên dễ dàng thay A.PAB để kìm hãm trình trao đổi chất vi khuẩn Vì SGU tác nhân kháng khuẩn mạnh, dùng loại thuốc chống bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng phù, tăng huyết áp 1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP) Công thức: N O O S NH H2N 10 N OCH Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái SMX SAs TT St Si %X 105905 105434,5 -0,4 103505 105434,5 1,9 102950 105434,5 2,4 104365 105434,5 1,0 105745 105434,5 -0,3 TB 104494 105434,5 0,9 CV% 1,3 Hình 3.18: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm Qua bảng kết quả, phân tích tính toán nhận thấy dải nồng độ cao sai số nhỏ mẫu phân tích có nồng độ nhỏ sai số lớn Theo lý thuyết thống kê sai số cho phép nằm khoảng 15%, với khoảng nồng độ khảo sát độ xác phép đo tin cậy 3.5 Mẫu thực, quy trình xử lý kết phân tích 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi Trên sở nghiên cứu tài liệu liên quan công bố chọn phương pháp thích hợp để xác định hiệu suất thu hồi sau: 51 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 2,5 gam thịt tôm đông khô Thêm 2.5g Na2SO4 khan Thêm 10ml ACN Lắc chiết 30 phút Li tâm 10 phút (5000vòng/ phút) Cặn Bã Thịt + Na2SO4 Thêm 10ml ACN Siêu âm phút Li tâm 10 phút Dung dịch Cặn Bã Thịt + Na2SO4 1.Thêm10ml ACN Siêu âm phút Li tâm 10 phút Dung dịch Cặn Dung dịch Làm cột chiết pha rắn C18 Loại bỏ Bão hoà cột: 10ml MeOH, 10 ml H2O Nạp mẫu Rửa: 10ml H2O Rửa giải: 10ml MeOH 10ml dung dịch SAs MeOH Cô cạn dung dịch dòng khí N2 50oC Định mức thành ml pha động chạy HPLC Lọ Bơm vào hệ thống HPLC Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu tôm Với quy trình xử lý mẫu thêm lượng xác chất phân tích vào mẫu tôm xử lý Với nồng độ chất thêm vào mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình 52 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Các kết nghiên cứu trình bày hình 3.20, bảng 3.13 bảng 3.14: 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 4/8.956 5/9.743 0.0 0.0 0.0 3/6.149 1.0 2/4.201 1.0 1/3.493 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.460 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 2.5 5.0 7.5 0.0 2.5 5.0 (a) 7.5 10.0 (b) Hình 3.20 Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm (a) chưa thêm chuẩn, (b) thêm chuẩn (trong đó: (1) SGU; (2) MTD; (3) SMP ;(4)SDO; (5) SMX) Bảng 3.13: Diện tích pic sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác Ct(ppm) 0,2 0,4 SGU 9610 30104 51859 MTD 24056 43824 SMP 25742 50795 SDO 23144 49734 SMX 21975 48753 S pic(mm) Từ kết trên, hiệu suất thu hồi chất nồng độ bảng 3.13 Hiệu suất thu hồi xác định sau: H = (Cx/Ct)* 100% 53 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Trong đó: Ct - lượng chất biết trước thêm vào Cx - lượng chất xác định phương pháp thêm Với Cx  (S x  So )  A B Sx – Diện tích pic thêm lượng Cx vào mẫu So – Diện tích pic thêm mẫu chưa thêm chất phân tích A, B - hệ số phương trình đường chuẩn chất phân tích Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích Các Sas SGU MTD SMP SDO SMX Ct (ppm) Cx(ppm) H% 0,200 0,165 82,50 0,400 0,200 0,400 0,349 0,151 0,31 87,3 75,5 77,7 0,200 0,167 83,5 0,400 0,361 90,3 0,200 0,146 72,9 0,400 0,343 85,8 0,200 0,142 71,0 0,400 0,352 88,1 Như khoảng nồng độ 0,2 – 0,4ppm, hiệu suất thu hồi metronidazole chất kháng khuẩn SAs đạt từ 71 – 90 %, hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu 3.5.2 Phân tích mẫu thực Các mẫu tôm (bỏ đầu, vỏ, chân, đuôi) lấy phần thịt, sau đông khô xử lý theo sơ đồ 3.19 Sau dung dịch cuối tiến hành phân tích theo phương pháp thêm chuẩn Xây dựng đồ thị biểu diễn diện tích pic theo nồng độ chất thêm  Nồng độ chất phân tích mẫu Cx tính theo công thức: Cx = A/B (với A, B - hệ số phương trình hồi quy đồ thị thêm chuẩn) 54 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái  Khoảng tin cậy nồng độ chất phân tích mẫu là: S S Sx  ( a )2  ( b )2 Cx a b Trong đó: Cx : Nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách a,b hệ số phương trình hồi qui Sa, Sb : sai số hệ số phương trình hồi qui Sx sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn Khối lượng chất phân tích có a(g) mẫu cân đông khô ban đầu : mcpt = V*Cx*F*10-3(mg) Trong mcpt : Khối lượng chất phân tích a (g) mẫu (mg) V : Thể tích dung dịch pha từ a(g) (ml) F : Hệ số pha loãng Cx : Nồng độ chất phân tích xác định từ phương trình hồi quy 10-3 : Hế số chuyển từ µg sang mg 3.5.2.1 Mẫu tôm rảo Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 142,8g Khối lượng mẫu sau đông khô : 32,9g Lượng nước có mẫu : 77% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tôm rảo Chất phân tích SGU Mẫu tôm Rảo 22151 Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 45766 75734 55 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Ta có phương trình hồi quy: 80000 Spic(mAu.s) 70000 60000 50000 40000 Y=A+B*X He so Gia tri Sai so -A 21092.16667 2367.62331 B 267915 18339.5313 30000 20000 R SD N P -0.99767 2593.60139 0.04351 10000 -0,15 -0,10 0,00 -0,05 0,05 0,10 0,15 0,20 CSGU(ppm) Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tôm rảo phân tích thêm chuẩn Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm rảo Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) Hàm lượng chất mẫu đông khô (ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi (ppm) SGU 0,079 ± 0,010 0,53 ± 0,07 0,12 ± 0,02 mV 7.0 Detector A Ch1:270nm mV 7.0 Detector A Ch1:270nm 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 mV Detector A Ch1:270nm 7.0 1/3.407 6.0 4.0 3.0 1/3.441 2.0 1/3.363 5.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu chưa thêm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo 3.5.2.2 Mẫu tôm chân trắng Khối lượng mẫu thịt tươi : 150,1g Khối lượng mẫu sau đông khô : 30,5g Lượng nước có mẫu :79,7% 56 4.0 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tôm chân trắng Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích Mẫu tôm Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm chân trắng 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 30407 59365 74137 SGU Ta có phương trình hồi quy: 90000 6000 Spic(mAu.s) 80000 5000 70000 4000 60000 50000 3000 40000 Y=A+B*X 20000 10000 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 2000 He so Gia tri Sai so -A 31104.66667 1560.03009 B 268650 12083.94113 30000 0.00 1000 R SD N P -0.99899 1708.92734 0.02862 0.05 0.10 0.15 0.20 0.0 CSGU(ppm) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm chân trắng Chất phân tích CSAs từ đường chuẩn (ppm) SGU 0,115 ± 0,008 Hàm lượng chất Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) mẫu tươi(ppm) 0,77 ± 0,05 0,16 ± 0,01 3.5.2.3 Mẫu tôm Sú Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 123,6g Khối lượng mẫu sau đông khô: 37,4g Lượng nước có mẫu : 69,7% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: 57 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích Mẫu tôm sú Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích SGU 18451 30532 45849 SMP 7010 20175 35745 Ta có phương trình hồi quy: 40000 50000 45000 Spic(mAu.s) 35000 40000 Spic(mAu.s) 30000 35000 25000 30000 20000 25000 Y=A+B*X 20000 15000 10000 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 C (ppm) He so Gia tri Sai so -A 6609.16667 896.29058 B 143675 6942.63699 10000 R SD N P -0.99768 1321.09147 0.04334 5000 -0,20 Y=A+B*X 15000 He so Gia tri Sai so -A 17911.66667 1205.986 B 136990 9341.52736 5000 -0.10 -0.05 0.00 R SD N P -0.99883 981.83714 0.03074 0.05 0.10 0.15 0.20 SGU CSMP(ppm) Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tôm sú phân tích thêm chuẩn Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú Chất phân CSAs từ đường Hàm lượng chất Hàm lượng chất tích chuẩn (ppm) mẫu đông khô (ppm) mẫu tươi (ppm) SGU 0,130 ± 0,012 0,87 ± 0,08 0,26 ± 0,02 SMP 0,046 ± 0,007 0,30 ± 0,04 58 0,09 ± 0,01 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái mV 5.0 Detector A Ch1:270nm mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 1/3.308 1/3.358 3.0 2.0 1.0 2/4.476 1.0 2/4.675 2.0 2/4.877 2.0 1/3.340 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú 3.5.2.4 Mẫu tôm lớt Khối lượng mẫu tôm tươi : 132,5g Khối lượng mẫu sau đông khô: 28,4g Lượng nước có mẫu : 78,6% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Kết phân tích sau: Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tôm lớt Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích SGU Mẫu tôm lớt Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 26845 40548 Ta có phương trình hồi quy: 59 60849 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 65000 60000 Spic(mAu.s) 55000 50000 45000 40000 35000 30000 Y=A+B*X 25000 He so Gia tri Sai so -A 25745.3333 2458.929 B 170020 19046.78538 20000 15000 10000 R SD N P -0.99883 2693.62222 0.07102 5000 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20C (ppm) SGU Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm lớt Chất phân CSAs từ đường tích chuẩn (ppm) SGU 0,151 ± 0,022 Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi(ppm) 1,00 ± 0,15 0,21 ± 0,03 9.0 9.0 9.0 8.0 8.0 8.0 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 3.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 1/3.485 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.395 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.427 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 5.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt 60 4.0 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Nhận xét: Với kết xác định cho thấy mẫu tôm xuất chất dư lượng kháng khuẩn SGU Với giới hạn dư lượng sulfamit thịt thủy sản cho phép 0,1ppm( theo thông tư số:29/2010/TT-BNNPTNT) mẫu tôm mà phân tích vượt mức giới hạn Với mẫu tôm sú, tôm lớt dư lượng gấp lần lượng cho phép Không phát thấy MTD, SMX, SDO, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm 61 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC – UV-Vis để tách, xác định đồng thời metronidazole số sulfamit (SGU, SMP, SDO, SMX) số loại tôm, thu số kết sau đây: Đã chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký:  Cột tách RP - C18: 25 cm × 4,6 mm; m  Detector UV-VIS: kênh = 270 nm; =320nm.Rise time = 0,1 s; Range = 0,01 AUFS  Máy ghi: tốc độ giấy = mm/phút; ghi = 10 mV  Thành phần pha động: dung dịch đệm axetat (pH = 4,5) 10mM /acetonitril: 80/20 (v/v)  Tốc độ pha động: ml/phút Đã đánh giá phương pháp phân tích:  Khoảng tuyến tính sulfamit: 0,05 – 1,00ppm  Giới hạn phát hiện: 0,012 – 0,029 ppm  Giới hạn định lượng: 0,040 - 0,096 ppm  Hệ số biến thiên: 0,2% – 5% khoảng nồng độ 0,08- 0,8ppm Khảo sát mẫu thực  Chọn quy trình xử lý mẫu thích hợp, hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu tôm đạt từ 71 -90%  Xác định dư lượng SGU mẫu tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm rảo:0,12±0,02ppm, tôm sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP tôm sú 0,09 ± 0,01ppm 62 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái  Không phát thấy MTD, SDO, SMX, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Từ kết thu được, thấy phương pháp HPLC – Detector UVVis có độ nhạy cao, thích hợp cho phân tích đồng thời metronidazole chất kháng khuẩn SGU, SMP, SDO SMX tôm Chúng hy vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng kỹ thuật HPLC – UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định metronidazole hợp chất thuộc họ sulfamit thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, giúp bảo vệ sức khoẻ cho người 63 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Đình Bính, Phạm Luận, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Phương Thanh (2007), “Xác định dư lượng chất kháng khuẩn họ sulfamit thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(1B), tr 33 – 41 Nguyễn Thị Kim Dung (2004), Xác định sulfonamide thuốc phương pháp hấp thụ nguyên tử, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Huỳnh Kim Thoa, Nguyễn Văn Thục (2006), Hoá dược tập 2, Bộ môn hoá dược, Đại học Dược, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Linh (2006), Xác định gián tiếp hàm lượng sulfamethoxazole thuốc phép đo F-AAS, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007), Nghiên cứu tách xác định đồng thời số sulfamit thức ăn chăn nuôi thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC), Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi(2003), Hóa học phân tích- Phần 2(Các phương pháp phân tích công cụ), Đại học Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2005), Thống kê hoá phân tích, Đại học Quốc gia Hà Nội Tiêu chuẩn ngành (2004), Sulfonamit sản phẩm thuỷ sản-Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao, 28 TCN 196:2004 10 Vũ Cẩm Tú (2009), Xác định sulfamit mẫu Dược phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên 64 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Tiếng Anh 11 A V Pereira, Q B Cass(2005), “High- performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column”, Journal of chromatography B, 826, pp 139- 146 12 Cheong, C.K., Hajeb, P.Jinap, S and Ismail-Fitry, M.R(2010), “Sulfonamides determination in chicken meat products from Malaysia’’, International Food Research Journal,17, pp 885-892 13 Craig D.C Salisbury, Jason C Sweet, Roger Munro(2004), “ Determination of sulfonamide residues in the Tissues of food animals using automated precolumn derivatization and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of AOAC international, 87( 5), pp.1264-1268 14 D.G Kennedy, R.J.McCracken, A.Cannavan, S.A.Hewitt (1998),“Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics on meat and milk” Journal of chromatography A, 812, pp.77-98 15 Gertraud Suhren and W Heeschen(1993) “Detection of eight sulphonamides and dapsone in milk by a liquid chromatographic method”, Analytica Chimica Acta, 275, pp 329-333 65 [...]... số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và metronidazole bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Từ những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công trình đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất kháng sinh thuộc các họ sau: fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,-β... xác định đồng thời các chất trên trong tôm cho độ nhạy, độ chính xác cao mà đơn giản, phù hợp với trang thiết bị sẵn có Xuất phát từ yêu cầu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp HPLC hấp phụ pha ngược, detector ghép nối là detector UV-Vis 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu tách và xác định 19 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái đồng. .. nâng cao) để khảo sát các điều kiện tách và định lượng các chất 2.6.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC [4 ; 8] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích... Bảng 3.2: Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích TT Thời gian lưu tRi (phút) Chất phân tích 1 3,30 SGU 2 4,48 MTD 3 8,49 SMP 4 13,23 SDO 5 15,08 SMX Dựa vào việc khảo sát thời gian lưu đối với các chất phân tích chúng tôi biết được thời gian lưu cụ thể của từng chất làm cơ sở cho quá trình phát hiện định tính rồi định lượng các sulfamit, metronidazole trong các đối tượng nghiên cứu sau... dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi trường đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, ... cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại Thời gian lưu phụ thuộc vào:  Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, cấu trúc xốp )  Pha động chạy sắc ký( loại dung môi, thành phần, tốc độ…)  Bản chất và cấu trúc phân tử của các chất phân tích  Môi trường pH của pha động Muốn tách và xác định đồng thời các chất phân tích, chúng ta phải biết thứ tự xuất hiện pic của các chất Vì vậy,... được đề xuất và các điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất sulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hoá Dư lượng sulfamit trong mô động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn với C18 Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung bình trên 70% Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit. .. máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác 25 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát các điều kiện sắc ký 3.1.1 Chọn bƣớc sóng của detector Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là HPLC ghép nối detector UV – Vis Việc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất. .. trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trong những năm gần đây Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UV xác định đồng thời ranitidine và metronidazole trong huyết tương 250ml huyết tương sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vào... khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng  Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo Tối ưu hoá các điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp xử lý mẫu và xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để phân tích một số mẫu tôm 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu tôm, có thành phần nền rất ... việc xác định xác lượng sulfamit, chất kháng sinh thức ăn chăn nuôi lượng tồn dư sản phẩm từ động vật quan trọng Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên cứu điều kiện tách xác định đồng thời. .. 1.2.2 Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời sulfamit metronidazole phương... detector ghép nối detector UV-Vis 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu trên, luận văn nghiên cứu tách xác định 19 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái đồng thời Sas, MTD HPLC sử dụng cột chiết pha ngược