NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HỢP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM

---NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG THUỐC KHÁ

-NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN

VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN

ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG

THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.LACTAM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN

VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN

ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG

THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM.LACTAM.

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: TS Phan Thị Tuyết Mai

TS Bùi Xuân Thành

Hà Nội – 2015

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phan Thị Tuyết Mai, TS.Bùi Xuân Thành đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này.

Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô giảng dạy tại Khoa Hóa phân tích đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình học tập

và nghiên cứu.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị máy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã số 39/2014/HD- NĐT.

Cuối cùng em xin gửu lời cảm ơn tới gia đình và các bạn học viên,sinh viên

bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn.

Hà nội, ngày 19 tháng 7 năm 2015 Học viên

Nguyễn Thị Ánh Tuyết

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh β-lactam 2

1.1.1 Khái niệm và phân loạinhóm β-lactam 2

1.1.1.1 Nhóm penicillin 2

1.1.1.2.Nhóm cephalosporin 4

1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác 8

1.1.2 Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β- Lactam 8

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam 9

1.2.1 Phương pháp đo quang 9

1.2.2 Các phương pháp sắc ký 11

1.2.3 Phương pháp phổ hồng ngoại 13

1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR 13

1.2.3.2 Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại 16

1.2.3.2 Ứng dụng của phương pháp phổ dao động 18

1.3.Ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại để xác định nhóm kháng sinh β- Lactam 19

1.3.1 Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng một hoạt chất trong thuốc 19

1.3.2 Các ứng dụng của phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định lượng thuốc kháng sinh β – lactam 20

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 23

2.1.2 Mẫu phân tích 23

2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 25

2.2.1 Hóa chất 25

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị đo 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 26

2.4 Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần 26

2.4.1 Nguyên tắc phương pháp phân tích 26

2.4.2 Nội dung phương pháp 27

2.4.3 Quy trình phân tích 27

2.5 Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin và Cephalexin 28

2.6 Chương trình máy tínhcủa phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với thuật toán hồi qui cấu tử chính ( PCR) 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM 32

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp 32

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ các hoạt chất penicillin và cephalexin 32

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược 35

3.1.3 Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr 37

3.1.4 Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên 38

3.2 Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 39 3.2.1 Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin khi có chứa tá dược 39

3.2.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy 42

3.3.1 Mô hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Cephlexin khi có chứa tá dược 44

3.3.2 Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi qui 46

3.4 Xây dựng mô hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích đồng thời hoạt chất Penicillin và Cephalexin trong cùng hỗn hợp 48

3.4.1 Xây dựng mô hình đường chuẩn đa biến xác định đồng thời Penicillin và Cephalexin có chứa tá dược 48

3.4.2 Đánh giá tính phù hợp của mô hình hồi qui PCR xác định đồng thời hoạt chất Penicillin và Cephalexin có chứa tá dược 50

3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của phép đo (LOQ) xác định đồng thời Penicillin, cephalexin và tá dược bằng phương pháp PCR 52

3.4.4.Định tính mẫu thực tế 54

3.4.5 Định lượng mẫu thực tế 59

3.4.5.1 Xử lý mẫu sơ bộ 59

3.4.5.2 Phân tích mẫu 60

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

Bảng1.1 Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin 3Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin 6Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin 7Bảng 3.4.Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang tại các số sóng đặc trưng 37Bảng 3.5 Khảo sát độ lặp lại quá trình ép mẫu theo độ hấp thụ và theo diện tích píc 39Bảng 3.6.Ma trận chuẩn hàm lượng của penicillin và tá dược trong hỗn hợp 40Bảng 3.7.Ma trận hàm lượng của penicillin và tá dược để kiểm tra độ đúng của mô hình hồi qui PCR 43Bảng 3.8.Kết quả sai số tương đối (%) khi xác định đồng thời penicillin và tá dược trong mẫu kiểm tra bằng phương pháp PCR 43Bảng 3.9 Ma trận chuẩn hàm lượng của Cephalexin và tá dược trong hỗn hợp 45Bảng 3.10 Ma trận kiểm tra của cephalexin và tá dược có trong hỗn hợp 47Bảng 3.11.Kết quả sai số tương đối của Cephalexin và tá dược bằng phương pháp PCR 47Bảng 3.12 Ma trận chuẩn hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược trong hỗnhợp 49Bảng 3.13 Ma trận kiểm tra hàm lượng của 3 cấu tử PEN,CEP và tá dược để đánh giá tính phù hợp mô hình hồi qui 51

Bảng 3.14 Kết quả (%)sai số tương đối xđ đồng thời CEP,PEN và tá dược bằng

phương pháp PCR 52Bảng 3.15.Giá trị LOD, LOQ khi xác định đồng thời các cấu tử PEN, CEP và tá dược bằng phương pháp PCR 53Bảng 3.16 Thông tin về các mẫu thuốc thực tế 59Bảng 3.17.Khối lượng mẫu bột thực tế cephalexin và tá dược được thêm vàohỗn hợp 60Bảng 3.18 Khối lượng mẫu bột thực tế penicillin và tá dược thêm vào hỗn hợp 61Bảng 3.19 Hàm lượng hoạt chất CEP thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế 61Bảng 3.20 Hàm lượng hoạt chất PEN thực tế tìm thấy trong các mẫu thực tế 62

Hình 1.2: thuốc kháng sinh cephalexin 24

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại trung của Cephalexin trong vùng 4000-400 cm-.1 33

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại trung của Penicillin trong vùng 4000-400 cm-.1 33

Hình 3.5: Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Cephalexin trong vùng 7500-2800 cm-1 34

Hình 3.6.Phổ hấp thụ hồng ngoại gần của Penicillin trong vùng 7500-2800 cm-1 34

Hình 3.7: phổ hồng ngoại của tinh bột sắn đối với penicillin và cephalexin 35

Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie stearat, penicilin, cephalexin 36

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talc, penicillin, cephalexin 36

Hình 3.10: Phổ tự tạo của Penicillin trong thư viện tham chiếu 55

Hình 3.11:Phổ tự tạo của cephalexin trong thư viện tham chiếu 55

Hình 3.12: Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 1 56

Hình 3.13: Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 2 56

Hình3.14 : Phổ định tính mẫu thực tế penicillin 3 57

Hình 3.15: Phổ định tính mẫu thực tế Cephalexin 1 57

Hinh 3.16: Phổ định tính thực tế của Cẹphalexin 2 58

Hình 3.17: Phổ định tính thực tế Cephalexin 3 58

CLS Bình phương tối thiểu thông thường (classical least square)

ILS Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)PLS Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)

(international unit)

Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân dượcnói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến một số tổ chức, cá nhân đã tung

ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày Thuốc giả không chỉ đánh lừangười tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân vàtrong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây ra các phản ứng

dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh nhân dễ kháng thuốc Đại diện

tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7-15% tổng số thuốc ở cácnước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong đó các nước ở khu vực Châu

Á chiếm 50% Các mẫu thuốc giả thường được phát hiện chủ yếu là các loại khángsinh như Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều người quan tâm là tỉ lệ thuốc giả

ở Việt Nam ngày càng một gia tăng và diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến côngtác kiểm tra khó khăn hơn

Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạtchất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết Hiện nay có rất nhiều phương phápxác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao như phương pháp sắc ký lỏng hiệunăng cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, các phương pháp quang học hay các phươngpháp điện hóa để phân tích kháng sinh được qui định trong dược điển Tuy nhiên, hầunhư các phương pháp trên đều được thực hiện trên các thiết bị đắt tiền, chi phí cho quátrình phân tích tốn kém, quy trình xử lí mẫu và tách chất tốn dung môi và mất nhiều thờigian không phải phòng thí nghiệm phân tích nào cũng thực hiện được

Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “ Nghiên cứu xây dựng

phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh thuộc họ β-Lactam” Với mục tiêu là nghiên cứu quy trình phân tích nhóm β-Lactam bằng

phương pháp phổ hồng ngoại gần với kĩ thuật hồi qui đa biến để kiểm định nhanhchất lượng lượng thuốc trên thị trường hiện nay

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Khái niệm và phân loạinhóm β-lactamlactam

Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo rabởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sựphát triển của các vi sinh vật khác [2]

Nhóm β-lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúchóa học chứa vòng β-lactam Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽhình thành các phân nhóm lớn tiếp theo

Cáckháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm gồm các penicillin tự nhiên

và tổng hợp,cáccephalosporin bán tổng hợp,các chấtcarbapenem,monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất là nhóm cácpenicillin và cephalosporin

Các penicillin và cephalosporin tự nhiên được chiết tách từ môi trường nuôi

cây nấm penicilium notaum mà nay gọi là penicillin chrysogenum và

cephalosporium aeremonium [2].

1.1.1.1 Nhóm penicillin

Nguồn gốc: Lexander Fleming (1929) phát hiện môi trường nuôi cấy penicillium

notatum, P chysogenum.Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillinđược đưa ra trong bảng 1.1

Bảng1.1 Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin.

Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta- lactam (amin nộivòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, được gọi là các amin của 6-Aminopenicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R – C9H11N2O4S [4,7]

Tính chất: Là chất bột màu trắng, dễ bị phá hủy trong môi trường oxi hóa, môi

trường có tính kiềm và nhiệt độ cao, hoặc do tác dụng của nước, của men penicillinnaza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr (-) sinh ra

Phân loại:

Sự thay đổi nhóm thế trong cấu trúc của penicilin bán tổng hợp dẫn đến sự thayđổi tính bền vững với các enzym penicilinase và β-lactamase, thay đổi phổ khángkhuẩn cũng như hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh

Dựa vào phổ kháng khuẩn, có thể tiếp tục phân loại các kháng sinh nhómPenicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng bảng như sau:

 Penicillin nhóm 1: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp gồm Gồm:

benzylpenicilin (penicillinG), phenoxymethylpenicilin (penicillin V),

penicillin chậm (procain benzylpenicilin, benzathin benxylpenicilin vàbenethamin penicillin).

 Penicillin nhóm 2: Các penicillin phổ kháng khuẩn hẹp đồng thời có tác

dụng trên tụ cầu gồm Methicillin, oxacillin, Cloxacillin (CLO),Dicloxacillin, Nafcillin

 Penicillin phổ rộng: Hay penicillin chuyên trị vi khuẩn nhóm

Pseudomonas aeruginosa gồm 2 nhóm nhỏ là Carboxypenicilin vàUreidopenicilin

- Carboxypenicilin: Gồm các thuốc: carbenicilin, ticarcilin, temocilin…cóphổ kháng khuẩn giống aminopenicilin nhưng rộng hơn

- Gồm các thuốc azlocilin, mezlocilin, piperacilin có phổ kháng khuẩngiống carboxypenicilin cộng thêm Klebsiella và một số vi khuẩn Gr (-)khác

1.1.1.2.Nhóm cephalosporin

Nguồn gốc:

Cephalosporin trong tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấmCephalosporin acremonium có hoạt tính kháng khuẩn thấp nên không được dùngtrong lâm sàng Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7-amino-cephalosporinic (7ACA).Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinasephá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn

Cấu trúc chung gồm vòng β- lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh

Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ bền,tính kháng khuẩn và dượcđộng học khác nhau

Công thức hóa học:

Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất củaAxit 7-aminocephalosporanic (viết tắt là A7AC) Các cephalosporin khác nhauđược hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng β-lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh Khi thay đổi các gốc R1, R2 được cáccephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau Công thứccấu tạo của một số hoạt chất trong nhóm cephalosporin được đưa ra trong bảng 1.2

Phân loại:

Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ.Cáccephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn G+ mạnh hơn nhưng trên vikhuẩn G- yếu hơn thế hệ sau Các tên thuốc sử dụng các thế hệ Cephalosporin đượcđưa ra trong bảng 1.3

Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin.

Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin.

Cephalosporin thế hệ 1

CefazolinCephalexinCefadroxil

Cephalosporin thế hệ 2

CefoxitinCefaclorcefafrozilcefuroximcefotetanceforanid

Cephalosporin thế hệ 3

CefotaximCefpodoximCeftibutenCefdinirCefditorenCeftizoximCeftriaxonCefoperazonCeftazidim

Kháng sinh monobatam là kháng sinh mà công thức phân tử có chứa β-lactamđơn vòng.Chất điển hình của nhóm này là aztreonam

1.1.2 Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β-lactam Lactam

Các β- Lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trongnước, dạng muối natri và kali dễ tan, tan được trong metanol và một số dung môihữu cơ có độ phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phầnchứa đồng thời nhóm -COOH và –NH2

Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làmdạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,giảm độ hấp thụ)

Tính không bền của vòng β-lactam:

Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng

azetidin-2-on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học [5]

Ví dụ: các bazơ (NaOH, KOH) đậm đặc tạo muối của axit cephalosporic

là axit cephalosporoic.Các cephalosporin có tính axit khá mạnh của axit α, β khôngno.

Phản ứng chuỗi acilamino

Bản chất của chuỗi acilamino ở 7-β xác định tính bền của cephalosporin.Một

sự cản trở không gian tạo ra ở gần vòng β-lactam thì không thuận lợi cho tác dụngcủa β-lactam và vì vậy có tác dụng bảo vệ

Phản ứng của nhóm thế R 2 ( nhóm R2 thuộc cấu trúc cephalosporin)

Sự thay đổi nhóm thế R2 tạo ra nhiều cephalosporin bán tổng hợp khác nhau.Vìvậy, phản ứng tại các nhóm thế này rất quan trọng Sự thay đổi trên R2 làm thay đổiđặc tính dược động học phân tử

1.2 Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactamlactam.

1.2.1 Phương pháp đo quang

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quanghọc của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang…Các phươngpháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ]

Các β-lactam hấp thụ các tia UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ Chúngtạo thành phức chất với một số ion kim loại hoặc tham gia phản ứng quang hóa giúpnâng cao độ nhạy của phép đo

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 đã qui định phương pháp gián tiếp sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt vàsản

phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc Phương pháp này dựavào phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử phenantrolin-cadimi sinh ra phức bền Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổhấp thụ nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủypha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi Phương phápnày phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin

Wei Liu và cộng sự [36] đã sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệluminol – K3Fe(CN)6 kết hợp với phương pháp chiết pha rắn để phân tích một số β-lactam trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5mg/l, cefadin là 0,04 mg/l, CEP là 0,1mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, cácphương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh vàtrong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích việcxác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cầnthủy phân mới phát hiện cũng được

Sheikha M Al- ghannam [35] cũng đã sử dụng phương pháp hấp thụ nguyên

tử AAS để xác định hai hợp chất của cephalosporins (Cephalexin monohydrate vàCephradine) Các quy trình này dựa trên sự tạo phức cặp ion giữa các thuốc vớimuối ammonium reineckate Các kết tủa tạo thành dùng để định lượng hoặc bằngphương pháp đo quang trắc hoặc bằng phương pháp AAS Các phương pháp nàygồm phản ứng của các thuốc với muối Reinecke trong môi trường axit ở nhiệt độ

25 ± 20 Quy trình phép phổ quang kế (quy trình 1) dựa trên sự hòa tan tạo kết tủabằng axeton, đo độ hấp thụ của dung dịch tại bước sóng 525 nm Còn đối các quytrình phổ hấp thụ AAS (quy trình 2) được định lượng trực tiếp hay gián tiếp thôngqua sự tạo thành các kết tủa crom hay lượng crom dư không phản ứng trong dungdịch lọc tại bước sóng 358,6 nm Theo định luật Lambert – Beer cho nghiên cứu cácmẫu thuốc trong khoảng 0,1-1,5 mg mL-1 cho phổ quang kế và 5-70 μg mLg mL-1 chophương pháp AAS, hệ số tương quan ≥ 0,9965 Cả hai phương pháp đều có độchính xác khi phân tích các cephalosporins trong các mẫu thuốc và đều cho phầntrăm độ thu hồi tốt từ 98,90 ± 0,94 đến 100,15 ± 0,97 mà không cần thêm phụ gia

1.2.2 Các phương pháp sắc ký

Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 qui định phương pháp định lượng Penicillin [13] trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệmphosphat, pH= 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất

hoá và định lượng bằng HPLC với detector PDA Qui trình này trải qua quá trìnhdẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản

TitusA.M.Msagati và cộng sự [4] đã xác định lượng dư các β-lactam trong thựcphẩm bằng sắc ký lỏng – khối phổ bằng hỗn hợp đệm phosphat,tetraetylammoniumclorua (Et4NCl) và acetonitril.Sau đó, các β-lactam sẽ được tách

và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương (LC-PI-ESI-MS) Giớihạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V trong gan vàbầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l

Helio A.Martins-Júnior [25] cũng đã sử dụng phương pháp LC/MS để xác địnhlượng dư kháng sinh có trong sữa Mục đích của nghiên cứu này nhằm phát triểnmột phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để xác định và địnhlượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau Trong đó, có năm β-lactam,bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin Các chấtnày đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,75-3,75 mg L-1, hệ số tuyến tính (r2)cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút Giới hạn định lượng thấpnhất và cao nhất của Dicloxacillin và erythromycin tương ứng 0,05 và 9,77 µg L-1,

có hiệu suất thu hồi dao động từ 65-125%, độ lệch chuẩn từ 2,0 to 15%

Phương pháp bằng sắc ký lỏng khối phổ-tandem (LC-MS / MS) cũng đã đượcFrédérique van Holthoon và các cộng sự [23] sử dụng để xác định tám penicillintrong các mô của heo, sữa và thức ăn gia súc Kết quả đạt độ chính xác dao độngtrong khoảng 94-113% (cơ bắp), 83-111% (thận) và 87-103% (sữa) và 88-116%(thức ăn gia súc) Độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) r) trong ngày daođộng từ 5-13% (cơ bắp, n = 18), 4-17% (thận, n = 7) và 5-18% (sữa, n = 7) đến 11-32% (thức ăn gia súc, n = 18) Độ chính xác lặp lại giữa các ngày (RSDRL, n = 18)dao động 6-23% (cơ bắp) để 11-36% (thức ăn gia súc)

Tác giả Yuko Ito và cộng sự [4] thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản)

đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin:Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong

thịt Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bòvới NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc kýlỏng cặp ion với detectơ tử ngoại Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%.Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/viên.

Tác giả E.Benito-Pena và các cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp HPLC,detector UV để phân tích đồng thời các kháng sinh β-lactam (penicillin G,amoxicillin, ampicillin, penicillin V, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin và nafcillin)trong nước thải Phương pháp này dựa trên chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng hiệunăng cao Các penicillin đã được tách ra bằng cách sử dụng cột LUNA C18 (150

mm x 4.6 mm, 5 µm), gradient rửa giải với các pha động bao gồm các axittrifluoroacetic, dung dịch nước và acetonitril tại bước sóng 220 nm Hiệu suất thuhồi đạt trong khoảng 82-97% (RSD 2-9%) cho tất cả các kháng sinh trừ amoxicillin(52%, RSD 8%), giới hạn phát hiện trong khoảng 8-24 ng L-1

J.M.Cha và các cộng sự [27] cũng đã dùng phương pháp HPLC – MS để xácđịnh lượng vết của thuốc kháng sinh β-lactam trong mẫu nước tự nhiên và nướcthải Mẫu nước được làm giàu bằng chiết pha rắn, cột Xterra MS C18 (2,1mm x50mm,; 2,5 µm), pha động gồm axit focmic,metanol và acetonitil Các chất phântích bao gồm amoxicillin (AMOX), ampicillin (AMP), oxacillin (OXA), cloxacillin(ClOx) và cephapirin (CEP) Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu thườngtrên 75% (trừ amoxicillin) với độ lệch chuẩn thấp hơn 10% trong các mẫu nước.Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%) Giới hạn phát hiện phương pháp(MDL) được ước tính khoảng từ 8 - 10 ng/L với nước bề mặt, 13 - 18 ng / L vớinước thải trước xử lý và 8 - 15 ng / L nước thải sau xử lý của một nhà máy xử lýnước thải

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã

sử dụng phương pháp HPLC để xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, vàdicloxacillin) ở mức lượng vết trong các mô cơ Các điều kiện chiết các penicillinvới đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn C18, phản

ứng với anhydrit benzoic ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4-triazol, dung dịch thủyngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút Các hợp chất dẫn xuất được táchrửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat (pH=6; 0,1mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium-hydro sunfat.Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 3-11 µg/l.

1.2.3 Phương pháp phổ hồng ngoại

1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR

Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) là một trong những kỹ thuậtphân tích rất hiệu quả.Các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạhồng ngoại.Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chấthoá học dao động với nhiều tần số dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổhấp thụ bức xạ hồng ngoại Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoạiđặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết có trong phân tử Do vậy, phổ hồngngoại của một hợp chất hoá học coi như "dấu vân tay", có thể căn cứ vào đó đểnhận dạng chúng

Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ hồng ngoạivượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộnghưởng từ điện tử vv…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc phân tửnhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp Phổ hấp thu hồng ngoại

là phổ dao động quay vì khi hấp thu bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động daođộng và chuyển động quay đều bị kích thích

Bản chất của phương pháp phổ hồng ngoại là dựa trên hiện tượng các hợp chấthóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại Các phân tử chỉ cókhả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố:

- Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử và cácliên kết trong phân tử) bằng chính tần số dao động của bức xạ tới

- Hai là một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ đó gâynên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng

Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần

số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chum bức xạ này sẽ bịmất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ

*Các vùng phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T hoặc

độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm-1)

- Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới

- Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang

Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ có độ dài bước sóng từ 0,8 đến1000µm và chia thành ba vùng:

- Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 12500-4000 cm-1 (λ = 0,8–2,5µm)

- Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000-400 cm-1 (λ = 2,5–50µm)

- Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 400-10 cm-1 (λ = 50-100µm)

Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 650cm-1

4000-1 Vùng hồng ngoại gần (NIR):

Trong vùng 12500 cm-1 -4000 cm-1 có rất nhiều đám phổ có liên quan đếnnguyên tử H Trong số đó, dao động co giãn (bội) của O-H gần 7140 cm-1 và N-Hgần 6667 cm-1, đám phổ tổ hợp do các dao động co giãn và dao động biến dạng củaC-H của nhóm ankyl ở 1548 cm-1 và 3856 cm-1.

Độ hấp thụ của đám phổ NIR thấp hơn từ 10 đến1000 lần so với các đám phổvùng hồng ngoại giữa.Vùng NIR có thể ghi được với hệ quang học thạch anh, kếtnối với các detectơ nhạy với NIR và nguồn bức xạ mạnh hơn.

 Vùng hồng ngoại trung :

Vùng này được chia thành vùng "tần số nhóm" 4000 – 1300 cm-1 và vùng"dấu vântay" 1300 - 650 cm-1 Trong khoảng 4000 – 2500 cm-1 sự hấp thụ đặc trưng cho daođộng co giãn của H với các nguyên tố khối lượng < 19

Phần chủ yếu trong phổ giữa 1300 và 650 cm-1, là các tần số co giãn của liênkết đơn và tần số các dao động uốn (các tần số bộ khung) của hệ nhiều nguyên tử

Đó là vùng "nhận dạng" "(vùng "dấu vân tay").Vùng phổ này hết sức đa dạng, khócho việc nhận biết riêng rẽ các đám phổ một cách chắc chắn, nhưng kết hợp cácđám phổ hấp thụ, giúp cho việc nhận biết các chất

 Vùng hồng ngoại xa:

Vùng 667 – 10 cm-1 bao gồm các dao động biên dạng của C, N, O, F với cácnguyên tử khối lượng > 19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vònghoặc chưa no Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với sựthay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ vùng hồng ngoại xa thường cho phép dựđoán các dạng đồng phân

1.2.3.2 Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại

Một trong các lợi thế vượt trội của phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) là cóthể phân tích được hầu hết các dạng vật chất như: chất lỏng, dung dịch, bột nhão,bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…

Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toàn phần trong đó kỹ thuật truyền qua được sử dụng nhiều nhất

Phổ FTIR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha rắn:

 Mẫu ở thể rắn: Có ba cách đo khi mẫu ở thể rắn:

- Màng nhão: Nghiền nhỏ vài mg chất nghiên cứu với một vài giọt parafin lỏng(nujol) và ép phần thu được giữa hai tấm NaCl Để tránh các đỉnh pic hấp thụ mạnhcủa parafin ở 2950-2850 cm -1 và 1450-1350 cm -1 khi khảo sát sự hấp thụ của cácnhóm C-H, người ta có thể thay parafin bằng hexaclo 1,3-butadien

- Màng bột: Mẫu được trộn với dung môi, sau đó phết lên bề mặt cửa sổ KBr hoặcNaCl, chờ đến khi dung môi bay hơi hết tạo thành một lớp màng bột trên cửa sổ thìtiến hành đo mẫu Yêu cầu đối với dung môi là không tác dụng với chất đo, dễ bayhơi và phải khan nước

- Mẫu ép màng KBr: Trộn mẫu thật đồng đều với KBr, rồi ép thành các viên mỏngtrong suốt bằng máy ép thuỷ lực Do KBr có tính hút ẩm, trên phổ hồng ngoạithường xuất hiện các vân hấp thụ của nước ở 3450 cm -1 Khi dùng KBr cũng cầulưu ý đến khả năng xảy ra phản ứng trao đổi cation hoặc anion trong trường hợpchất nghiên cứu là muối hoặc phức chất vô cơ

 Mẫu dạng màng lỏng:

Khi mẫu ở thể lỏng tinh khiết, người ta có thể chuẩn bị mẫu bằng cách nhỏ một giọtchất lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01-0,1mm, gọi làmàng lỏng Đây là kỹ thuật ghi phổ đơn giản nhất, thường sử dụng cho chất lỏng có

độ nhớt cao và ít bay hơi

 Mẫu dung dịch :

Hoà tan chất nghiên cứu bằng dung môi thành dung dịch có nồng độ 1-5%.Cho dung dịch và dung môi nguyên chất vào hai cuvet có bề dày 0,1-1,0 mm vàbằng việc so sánh hai chùm tia đi qua dung dịch và dung môi có thể loại được vânhấp thu của dung môi.Kỹ thuật thường sử dụng cho các chất lỏng có độ nhớt thấp và

dễ bay hơi.Dung môi không được phép hấp thụ quá 65% bức xạ chiếu vào vì cường

độ bức xạ còn lại sẽ quá yếu Ngoài ảnh hưởng do bản chất của dung môi, cũng cầnlưu ý đến bề dày của cuvet Một số dung môi thường sử dụng là CCl4, CHCl3,

CH2Cl2, Cl2C=CCl2… Mặc dù vùng không hấp thu của CHCl3 hẹp hơn CCl4 nhưngkhả năng hoà tan các chất của CHCl3 tốt hơn nên thường được sử dụng nhiều hơn.Đặc biệt là có thể đo dung dịch đặc hơn trong các cuvet có bề dày nhỏ hơn Cáccuvet thường có cửa sổ bằng NaCl, KBr, CaF2 hoặc AgCl thì cửa sổ sẽ bị đen saumột thời gian sử dụng

kí (tương ứng với mỗi pic trên sắc kí đồ) sẽ được ghi phổ hồng ngoại (thường dùngFTIR) và được lưu giữ trong bộ nhớ của máy tính Máy có thể in ra những phổ đồhồng ngoại của các hợp phần ứng với các pic trên sắc kí đồ mà ta quan tâm Nhờ sosánh các phổ mẫu với thư viện phổ chuẩn lưu trong máy tính, máy có thể chỉ rõ cấutạo của các hợp chuẩn hoặc cho biết các nhóm chức có mặt trong hợp phần đó

1.2.3.2 Ứng dụng của phương pháp phổ dao động

* Định tính các chất

Trước khi ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta đã có thể có nhiều thông tin vềhợp chất hoặc hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngoài, độtan, điểm nóng chảy, điểm cháy Nếu có thể thì cần biết chắc mẫu là chất nguyênchất hay hỗn hợp Sau khi ghi phổ hồng ngọai, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu

cơ thì trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫuthuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hoặc cả hai Sau đó nghiên cứu cácvùng tần số nhóm để xác định có hay không có các nhóm chức Trong nhiều trườnghợp việc đọc phổ (giải phổ) và tìm các tần số đặc trưng không đủ để nhận biết mộtcách toàn diện về chất nghiên cứu, nhưng có lẽ là có thể suy đoán được kiểu hoặcloại hợp chất Cũng cần tránh khuynh hướng cố gắng giải và gán cho mọi đám phổquan sát thấy, nhất là những đám phổ vừa và yếu trong vùng phổ phức tạp Mỗi khiphát hiện một loại chất, người ta so sánh phổ của chất nghiên cứu với phổ của chấtnguyên chất tương ứng để có thể nhận định đúng

Phổ hồng ngoại được dùng để xác định độ tinh khiết của các chất.Phổ hồngngoại của chất không tinh khiết thì thường độ rõ nét của đám phổ riêng biệt bị giảm,

sự xuất hiện thêm các đám phổ sẽ làm "nhoè" phổ [3].Khi tạp chất hấp thụ mạnh IR

mà ở đó thành phần chính không hấp thụ hoặc hấp thụ yếu thì việc xác định rấtthuân lợi

Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) còn có thể được ứng dụng trong phântích định lượng một chất trong dung dịch hoặc hỗn hợp Khả năng ứng dụng phổFTIR để phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị và trình độ của các phòng thínghiệm Ngày nay, sự ra đời của các máy quang phổ hồng ngoại hiện đại, sự tăng tỷ

lệ tín hiệu/nhiễu làm cho việc phân tích định lượng càng thêm chính xác và do đó

mở rộng được phạm vi phân tích định lượng Khi chiếu chùm bức xạ hồng ngoại đi

qua một lớp mỏng vật chất, thì sau khi đi qua cường độ bức xạ bị giảm do bị khuếchtán hay hấp thụ trong lớp mỏng vật chất Trong một vùng sóng nhất định thì độ hấpthụ hay mật độ quang đều tỷ lệ tuyến tính với nồng độ dung dịch Nguyên tắc chung của phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại là thiết lập mốiquan hệ giữa tỷ số I0/I ở một bước sóng nhất định với nồng độ chất

Theo định luậnt Lambert-Beer:

lg (I0/I)λ = ελ.d C Trong đó: Io, I: Cường độ bức xạ hồng ngoại trước và sau khi qua mẫu

ελ – Hệ số hấp thụ

C – Nồng độ

d – Chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet

Do vậy, dựa vào phương trình này có thể xác định được hàm lượng của mộtchất trong hỗn hợp và độ chuyển hóa của một phản ứng dựa vào cường độ của mộtđỉnh píc đặc trưng cho nhóm chức có trong chất đó

1.3.Ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại để xác định nhóm kháng sinh β-lactam Lactam

1.3.1 Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng một hoạt chất trong thuốc

Andréia de Haro Moreno và cộng sự [18]cũng đã tiến hành định lượngCeftazidime bằng phương pháp phổ hồng ngoại trên các mẫu dược phẩm dạng bột

để tiêm bằng việc khảo sát cường độ hấp thụ của các đỉnh pic đặc trưng cho vòngthơm trong vùng 1475-1600 cm-1 Kết quả cho thấy tá dược không làm ảnh hưởngđến độ chính xác của phép phân tích Đường chuẩn được thiết lập trong khoảngnồng độ 0,5 – 0,7 mg, phần trăm hiệu suất thu hồi 98.98 ± 0.70

Tác giả Macedo Vieira cùng các cộng sự [20] đã sử dụng phương pháp phổhồng ngoại để định lượng cefuroxime (CFU) dạng bột dùng để tiêm, phương phápnày đo cường độ hấp thụ của các đỉnh pic hấp thụ đặc trưng cho vòng thơm trong

vùng từ 1475-1600 cm-1 Khoảng tuyến tính được xác định từ 5,0-20,0 μg mLg.ml-1(phương trình hồi qui: y = 0,5053x + 0,0114; r2 = 0,9991) Độ chính xác củaphương pháp được cho là tốt với giá trị RSD gần 2 %, không lớn hơn 5%.

Eliane Gandolpho Tótoli và cộng sự [21] cũng đã phân tích định lượng NatriAmpicillin dạng bột dùng để tiêm bằng phương pháp phổ FTIR bằng đo cường độhấp thụ các đỉnh pic đặc trưng cho các nhóm cacbonyl trong phân tử trong vùng

1800 -1700 cm-1 Hệ số tuyến tính r2 = 0,9993, trong khoảng nồng độ 1- 3mg/viên

1.3.2 Các ứng dụng của phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định lượng thuốc kháng sinh β –LACTAM lactam.

Kết hợp phổ hồng ngoại FTIR với Chemometric đã trở thành một công cụmạnh cho ngành công nghiệp dược phẩm, phù hợp cho việc phân tích các mẫu dượcphẩm cả dạng rắn cũng như dạng lỏng Đồng thời, phổ hồng ngoại còn có thể sửdụng trong quá trình kiểm soát chất lượng dược phẩm

Cho đến nay, đã có nhiều công trình trên thế giới nghiên cứu theo hướng này

và đã đạt được những thành tựu nhất định trong việc định lượng nhóm thuốc khángsinh β – Lactam Phương pháp này được đánh giá có nhiều ưu điểm như không tốndung môi, không cần phá mẫu mà vẫn phân tích trực tiếp được các mẫu rắn, giáthành phân tích thấp phù hợp kiểm định nhanh các loại thuốc đang lưu hành trên thịtrường hiện nay

Eliane Gandolpho Tótoli và cộng sự [21] đã sử dụng phương pháp phổ hồngngoại chuyển Fourier FTIR để phân tích định lượng bột natri ampicillin Phươngpháp này không sử dụng dung môi hữu cơ là một ưu điểm vượt trội hơn so với cácphương pháp phân tích khác, thực tế đã đóng góp làm giảm lượng dung môi hữu cơthải ra môi trường Hàm lượng bột natri ampicillin trong mẫu phân tích được xácđịnh bằng cường độ hấp thụ của đỉnh pic đặc trưng cho nhóm cacbonyl trong vùng1800-1700 cm-1 Độ chính xác của phương pháp này đã được đánh giá qua độ tuyếntính r2 = 0,9993 của đường chuẩn trong khoảng nồng độ 1,0 - 3,0 mg/viên, giới hạnphát hiện và định lượng lần lượt 0,13mg, 0,4 mg [18]

Tác giả Graciele ParisottoI [24] đã tiến hành xác định hàm lượngAmoxicillin trong các mẫu thuốc dược phẩm sử dụng phổ hồng ngoại gần NIR kếthợp với phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) Mô hình thựcnghiệm: có 24 mẫu chuẩn được trộn với tinh bột trong đó 17 mẫu được sử dụng môhình chuẩn, 7 mẫu dùng cho mô hình đánh giá Các hoạt chất được trộn tạo ra cácmẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 76.7 – 94.3% (w/w) Quá trình phân tích

dữ liệu phổ sử dụng máy quang phổ Nicolet Magna 550 FTIR với độ phân giải 4 cm-1, 32 lần quét Mô hình tốt nhất chỉ ra có r2 = 0,9936, RMSEC = 0,441 và RMSEV

= 0,790

Tác giả Michaela Dračková1 [31] cũng sử đã sử dụng phương pháp phổ hồngngoại gần biến đổi Fourie ( FT-NIR) kết hợp với phương pháp bình phương tối từngphần PLS để xác định hàm lượng dư Penicillin G và Cloxacillin trong sữa tươi Phổđược đo trong vùng 4000 – 10.000 cm-1, 100 lần quét Mô hình chuẩn được pháttriển, đánh giá dựa trên hệ số tương quan (R) và sai số chuẩn (SEC) Giá trị thuđược đối với Penicillin: R= 0,951 và SEC = 0,004 và đối với Cloxacillin: R = 0,871,SEC = 0,007 Các mô hình chuẩn được sau đó được đánh giá chéo Tuy nhiênphương pháp phổ này không phải là một phương pháp thích hợp để xác định chínhxác các chất này trong sữa tươi vì sự thay đổi thành phần sữa có thể ảnh hưởng đếngiới hạn phát hiện chất ở nồng độ thấp

Tác giả YanYun Li [37]sử dụng phương pháp hồng ngoại xây dựng mô hìnhđịnh lượng xác định natri cefazolin ở các dạng tinh thể khác nhau Các natricefazolin có thể được tạo ra từ hai dạng tinh thể α và β Các sản phẩm vô định hìnhđược sản xuất từ quy trình sản xuất khác nhau đã tạo ra các loại thuốc đa hìnhthường có tính chất vật lí, hóa học khác nhau.Phương pháp phổ hồng ngoại gần kếthợp với phương pháp Chemometric đa biến được xem là công cụ hữu hiệu cho việcxác định các tinh thể trong việc lựa chọn các dãy quang phổ tối ưu tương ứng vớidạng tinh thể đặc trưng với thành phần đặc trưng Các kết quả cho thấy các bướcsóng nằm trong khoảng 9102 – 8597 cm-1 được dùng để xác định đặc tính và dãysóng 6001– 5496 cm-1 đươc dùng để định lượng natri cefzolin

Như vậy thực tế phân tích cho thấy, các phương pháp truyền thống nhưHPLC, phương pháp quang học hay phương pháp phổ hồng ngoại thường chỉ đượcdùng để xác định các hoạt chất ở dạng riêng rẽ, không thể dùng xác định đồng thờiđồng thời các hoạt chất có cấu trúc phân tử gần giống nhau trong cùng nhóm cótrong cùng mẫu thuốc Do đó Chemometrics là công cụ hữu hiệu để xác định đồngthời các hoạt chất trong cùng mẫu mà không cần phải tách loại.

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chất phân tích.

Công thức phân tử: C6H18N2O5S; Tên quốc tế, tên khoa học: axit (2S, 5R, 6 R) 3,3

dimethyl – 7- oxo – 6 ( 2 phenoxyacetamido] 4-thia – 1- azabicyclo [3,2,0] heptan –

2 carboxylic

Penicilin V là chất bột kết tinh trắng, khó tan trong nước, dễ tan trong etanol96%, không tan trong dầu và paraffin lỏng [4], được sản xuất bằng nuôi cấy chủngPenicillium notatum hoặc các chủng cùng họ trong môi trường có chứa tiền chấtthích hợp hay bằng các phương pháp khác Tổng hàm lượng củaphenoxylmethylpenicillin và 4- hydroxymethylpenicillin phải từ 95% đến 100,5 %,tính theo chế phẩm khan

Công thức phân tử: C16H17N3O4S.H2O; Tên quốc tế, tên khoa học: axit 7 (α amino

αphenylacetamido) 3 methylcephem – 4- carboxylic monohyrat

Cephalexin là chất bột kết tinh trắng hơi có mùi lưu huỳnh, tan ít trong nước,

tan trong các dung dịch kiềm loãng, không tan trong etanol [4,6], được điều chếbằng con đường tổng hợp hóa học

(dập viên, đóng nang), tá dược còn đóng vai trò quan trọng trong độ ổn định củathuốc (dược chất, dạng bào chế) giúp thuốc đạt được tuổi thọ như mong muốn Các thuốc kháng sinh nhóm penicillin có tá dược chính là magie stearate, tinhbột sắn, talc, gelatin; Các thuốc kháng sinh nhóm cephalosporin có thành phần tádược chính là tinh bột,lactoza, magie stearate, talc, tinh bột, natri glycolat.

 Một số mẫu thuốc phân tích:

Mẫu 1: Hoạt chất Penicillin V:

Hinh 1.1: Thuốc kháng sinh penicillin

Tên thuốc: PEN-VEE-K; VEETIDS…

Dạng dùng: Viên nén 125mg, 250mg, 500mg… Dung dịch uống: 125mg/5ml,250mg/5ml

Thành phần hoạt chất: Phenoxymethylpenicilin Kali

Tá dược thường dung: Amidon, bột talc, magnesistearat, tinh bột

Mẫu 2: Hoạt chất Cephalexin:

Hình 1.2: thuốc kháng sinh cephalexin

Tên thuốc: Cephalexin

Dạng dùng : Nang và viên nén 250 mg, 500 mg; viên nén 1 g Nhũ dịch 125 mg,

250 mg/5 ml (sau khi pha thêm nước cho chế phẩm) Siro 250 mg, 500 mg/5 ml(sau khi pha thêm nước cho chế phẩm) Thuốc giọt dùng cho trẻ em 125 mg/1,25 ml(sau khi pha thêm nước cho chế phẩm)

Chất chuẩn Cephalexin monohydrat C16H17N3O4S có hàm lượng nguyên trạng94,33%, Viện kiểm nghiệm trung ương (chuẩn phòng thí nghiệm), số kiểm soát :0108041

- KBr dùng cho hồng ngoại (Merck)

- Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi), đạt tiêu chuẩn đãkiểm tra theo DĐVN 4

- Magie stearat : Mã sản phẩm: dp004; quy cách: 20kg/bao Nước sản xuất:PETER GREVEN – MALAI, hàm lượng: 6.8 - 8.3%

- Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn đã kiểm tratheo DĐVN 4

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Axit Acetic, NaOH, Acetonitril, triethylamin,Metanol (Merck)

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị đo

- Cân phân tích Sartorious độ chính xác ± 0,0001g

- Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIRspectrometer, dải bước sóng đo trong vùng 7500-2800 cm-1

- Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no:Pike- 162- 1000)

- Cối chày mã não: Được dùng để chuẩn bị viên KBr hoặc cho phương phápkhuếch tán và phản xạ

- Cối sứ có kích thước D106xH74 mm

- Thư viện phổ chuẩn: ST- Japan spectral libraries (part no: K8159-1000)

- Phần mềm Matlab 12: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS, ILS

và PCR để phân tích đồng thời các chất trong cùng một hỗn hợp

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để xây dựng qui trình xác định đồng thời các hoạt chất Penicillin vàCephalexin bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê

đa biến chúng tôi tập chung nghiên cứu vấn đề sau:

1 Khảo sát các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại gần và trung bình của cácmẫu thuốc chuẩn của các chất trong nhóm β-lactam

2 Khảo sát mô hình hồi qui đa biến xác định đồng thời các hoạt chất có trongnhóm β-lactam và tá dược

3 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp chuẩn trong dược điểnViệt Nam V

4 Ứng dụng phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thịtrường hiện nay

2.4 Phương pháp định lượng bằng phổ hồng ngoại gần

2.4.1 Nguyên tắc phương pháp phân tích

Cơ sở của phương pháp là dựa trên sự hấp thụ có chọn lọc các bức xạ hồngngoại của Penicillin trong vùng 3950 – 2800 cm-1và Cephalexin trong vùng 3950 –

2800 cm-1 Mẫu đo được chuẩn bị bằng cách trộn từng hoạt chất Penicillin hoặcCephalexin với 3 tá dược khác nhau theo tỉ lệ phù hợp, sau đó nghiền và trộn đều đểđồng nhất các chất trong một mẫu, tiến hành đo các mẫu ở điều kiện đã khảo sát thuđược các tín hiệu đo Các dữ liệu tín hiệu đo độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩnthu được chuyển vào phần mềm Matlab tính toán theo thuật toán hồi qui cấu tửchính (PCR) để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp

2.4.2 Nội dung phương pháp

Để xây dựng qui trình xác định đồng thời các hoạt chất Penicillin vàCephalexin bằng phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp thống kê

đa biến chúng tôi tập chung nghiên cứu vấn đề sau:

1 Khảo sát các điều kiện tối ưu để đo phổ hồng ngoại gần và trung bình của cácmẫu thuốc chuẩn trong nhóm β-lactam

2 Khảo sát mô hình hồi qui đa biến xác định đồng thời các hoạt chất có trongnhóm β-lactam và tá dược

3 So sánh phương pháp nghiên cứu với phương pháp chuẩn trong dược điểnViệt Nam

4 Ứng dụng phân tích một số mẫu thuốc kháng sinh đang lưu hành trên thịtrường hiện nay

2.4.3 Quy trình phân tích

1 Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời hai hoạt chất gồmPenicillin với hai tá dược gồm tinh bột và talc; cephalexin cùng với hai tádược là tinh bột sắn và Magie stearate có hàm lượng thay đổi sao cho tín hiệu

độ hấp thụ quang của các chất thay đổi trong vùng tuyến tính

2 Nghiền và trộn từng mẫu trong vòng 15 phút để thu được hỗn hợp đồngnhất

3 Lấy 3 mg hỗn hợp chất vừa đồng nhất trên, trộn với 97 mg KBr rồi tiến hànhnghiền mịn, đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 12 phút

4 Lấy khoảng 15 mg bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên để thu được viênmẫu và đo phổ hồng ngoại trong vùng số sóng nghiên cứu từ 4000-2800 cm-

1, ghi lại phổ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạngASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm Matlab để tính toán

5 Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng trên ma trận

độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở phầntrên Nhập số liệu ma trận hàm lượng các mẫu chuẩn, ma trận hàm lượng cácmẫu kiểm tra và ma trận tín hiệu đo độ hấp thụ quang tương ứng vào phầnmềm Matlab, chạy chương trình tính toán ma trận hệ số hồi qui theo phươngpháp PCR trên phần mềm matlab, từ đó xác định được hàm lượng mỗi hoạtchất trong từng mẫu Độ đúng của phép đo được xác định qua sai số tươngđối của phương pháp, từ đó lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến hànhđịnh lượng các mẫu thuốc thực tế

6 Tiến hành định lượng các mẫu thuốc thực tế bằng cách trộn một lượng bộtmẫu với tá dược để pha loãng hàm lượng hoạt chất có hàm lượng nằm trong

ma trận chuẩn đã xây dựng, đo tín hiệu đo độ hấp thụ quang của các mẫunày, lưu phổ và chuyển các ma trận hàm lượng mẫu đo và ma trận tín hiệu đovào phần mềm Matlab để tính toán theo mô hình hồi qui cấu tử chính PCR

Từ đó tính toán được hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theocông thức dưới đây:

mt: khối lượng của mẫu thử (mg)

mtb: khối lượng trung bình của 1 viên của thuốc (mg)

2.5 Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin và Cephalexin

Phương pháp phân tích đối chứng mẫu Penicillin và Cephalexin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được tiến hành phân tích tại phòng kiểm nghiệm –

Công ty CP Dược phẩm Trung ương 1 –PHARBACO; Địa chỉ 160 Tôn Đức Q.Đống Đa –TP Hà nội.

Thắng- Định lượng Cephalexin trong viên nang

Hàm lượng Cephalexin trong viên nang được xác định theo phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao như hướng dẫn trong dược điển Việt Nam IV

- Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6mm) được nhồi pha tĩnhC18 (5µm) Detector quang phổ tử ngoại tại bước sóng 254 nm, tốc độ dòng:1,5 ml/min, thể tích tiêm:20µl Pha động: Methanol – acetonitril – dung dịchkali dihydrophosphat 0,136% - nước (2:5:10:83)

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan 50,4 mg cephalexin chuẩn vào nước và pha loãngthành 100ml với dung môi nước

- Dung dịch thử: Hòa tan 50,6 mg Cephalexin, hòa tan chế phẩm vào trongnước và pha loãng thành 100ml với cùng dung môi nước

 Định lượng penicillin V kali trong viên nang

Hàm lượng penicillin V kali trong viên nang được xác định bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao như trong Dược điển Việt Nam IV

- Điều kiện chạy sắc ký: Cột thép không gỉ (30 cm x 4mm), được nhồi phatĩnh C18 (3µm đến 10µm), detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bướcsóng 254nm, tốc độ dòng 1,0ml/min, thể tích tiêm 10 µl Pha động: Nước-acetonitril- acid acetic (650:350:5,75)

- Dung dịch chuẩn: Cân lượng bột khoảng 49,8 mg penicillin chuẩn hòa tantrong pha động vừa đủ 100ml

- Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên rồi nghiền thànhbột mịn Cân chính xác lượng bột viên khoảng 51,1 mgphenoxylmethuypenicillin hòa tan trong pha động vừa đủ 100ml, lắc kỹ 5