NGHIÊN cứu xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH sản XUẤT VẮCXIN cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60420107 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – Năm 2015 Cơng trình hồn thành tại: Cơng ty TNHH MTV Vắc xin Sinh phẩm số (VABIOTECH) – Bộ Y Tế Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Tuấn Đạt PGS TS Bùi Thị Việt Hà Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Vân Trang Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Thị Vân Anh Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, 14h00 ngày 21 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: Trung tâm Thông tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội PHẦN MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Bệnh cúm bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên gánh nặng lớn sức khỏe cộng đồng, TCYTTG 40% quốc gia Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm Do vậy, phát triển vắcxin cúm cho người đặt yêu cầu cấp bách Là sở nghiên cứu sản xuất vắcxin cho người Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin sinh phẩm số tiến hành xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 tiến tới vắcxin cúm A/H7N9 nuôi cấy tế bào Một thông số quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin phịng thí nghiệm đặc tính kháng nguyên vi rút cúm có mặt sản phẩm trình sản xuất vắcxin Xây dựng phương pháp để đánh giá, từ đưa tiêu chuẩn chất lượng kháng nguyên việc làm cần thiết Điều giúp cho việc đánh giá chất lượng vắcxin kiểm tra độ ổn định quy trình sản xuất Do vậy, tiến hành thực đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm” MỤC TIÊU, NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN - Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm - Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Trong nhiều thập kỷ qua, bên cạnh virus cúm mùa, giới liên tục phải trải qua đại dịch cúm với chủng khác nhau, A/H5N1, A/H7N9, A/H1N1 đại dịch Sản xuất virus cúm vừa phải tuân thủ quy định nghiêm ngặt chất lượng vắc xin, vừa phải đối diện với việc thay chủng hàng năm chủng gây đại dịch Việc xây dựng quy trình tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vắc xin chung cho vắc xin cúm riêng cho số vắc xin phòng chủng cúm gây đại dịch quan trọng, nhằm đảm bảo chất lượng, tính an tồn tính kháng ngun vắc xin Những đánh giá sở để áp dụng cho vắc xin cúm khác, nhằm nhanh chóng đưa vắc xin vào thử nghiệm sử dụng5 KẾT CẤU LUẬN VĂN Luận văn phần mở đầu, danh mục hình, danh mục bảng, bảng ký hiệu chữ viết tắt, kết luận, tài liệu tham khảo, phụ lục cịn có chương sau: Chương Tổng quan Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương Kết nghiên cứu thảo luận PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genom ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto vi rút Isa Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ biến gia cầm, người động vật khác lợn, ngựa…là nguyên gây nên đại dịch lớn toàn cầu Vi rút cúm B C lưu hành người thường gây nên vụ dịch vừa nhỏ Các vi rút cúm A, B C giống cấu trúc 1.2 Hình thái cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng đa dạng: hình cầu, hình trứng đơi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm Các hạt virion vi rút A B có vỏ bao bọc Vỏ vi rút có chất protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm số protein glycosyl hóa số protein dạng trần khơng glycosyl hóa Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, typ A B có đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, cịn typ C có đoạn Trong virion có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme cần cho trình phiên mã genom ARN chuỗi (-) Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn 1.3 Cấu trúc hệ gen vi rút cúm protein mã hóa Hệ gen vi rút cúm A B có đoạn gen vi rút cúm C có đoạn gen ( khơng có gen NA) Cấu trúc hệ gen vi rút cúm tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút gen polyacrylamit Cấu trúc gen vi rút cúm sau: Đọan gen mã hóa cho PB2, đoạn gen mã hóa cho PB1, đoạn gen mã hóa cho PA, đoạn cho HA, đoạn cho NP, đoạn cho NA, đoạn cho M1 M2, đoạn cho NS1 NS2 Trình tự nucleotit ARN vi rút cúm PR8/34 nhiều phân typ khác cơng bố từ năm 1982 Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit 1.4 Quá trình nhân lên vi rút cúm Trước hết gai H vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic tế bào chủ, tiến hành nhập bào tạo endosom Tiếp đó, xảy q trình dung hợp vỏ ngồi vi rút với màng endosom Điều thực nhờ gai H chồi lên pH endosom thấp Sau dung hợp ribonucleprotein ARNpolymeraza chui vào tế bào chất Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza vi rút Phân tử mARN phiên mã nhân từ chuỗi ARN khuôn đơn, (-) vi rút sử dụng mồi đoạn 10 – 13 nucleotit cắt tử đầu 5’ mARN có gắn mũ vật chủ, sau gắn PolyA lấy từ mARN tế bào chủ Enzym cắt mồi endonucleaza vi rút mang theo Phân tử mARN hoàn thiện vi rút khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành chép genom nhân 1.5 Sự phát triển vi rút cúm tế bào Vi rút cúm nuôi trứng gà có phơi Sau này, vi rút cúm ni trứng gà có phơi số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát Việc ni cấy vi rút trứng gà có phơi lựa chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm giới Hiện nay, hệ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường dùng để phân lập vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm người Tế bào MDCK có độ nhạy 100% phân lập vi rút cúm A độ nhạy Vero 71,4% MRC-5 57,1% 1.6 Kỹ thuật di truyền ngược Giống hầu hết loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên nhân tế bào bị nhiễm Sau dung hợp với màng tế bào, phức hợp ribonucleoprotein vi rút (vRNP) phóng thích vào tế bào chất Phức hợp vRNP, bao gồm ARN vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) loại protein polymeraza (PA, PB1, PB2), chuyển vào nhân trình phiên mã tái diễn đây, vARN sợi (-) trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà vARN bao bọc NP phải phiên mã thành mARN nhờ phức hợp polymeraza vi rút Trong trình tái vARN sử dụng làm khuôn để tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN lại làm khuôn để tổng hợp sợi vARN Như vậy, đơn vị chức tối thiểu để vi rút cúm tái vRNP 1.7 Dịch tễ học bệnh cúm Dịch cúm xảy theo xu hướng khác năm, thường xảy vào mùa đông bắc nam bán cầu, xuất hàng năm khu vực nhiệt đới Vi rút cúm có khả công cao, nên tỷ lệ mắc bệnh vi rút cúm dân số tương đối cao Tăng tỷ lệ mắc tử vong cúm xảy cực trị nhóm tuối người mắc sẵn bệnh khác Mơ hình dịch tễ phản ánh thay đổi đặc điểm kháng nguyên vi rút cúm, lây lan bệnh phụ thuộc vào nhiếu yếu tố, bao gồm khả lây nhiễm mẫn cảm nhóm dân cư Đặc biệt vi rút cúm A có khả thay đổi định kỳ lớp vỏ kháng nguyên glycoproteins hemagglutinin neuraminidase Trong số vi rút cúm nhóm A ảnh hưởng đến sức khỏe người có ba phân typ hemagglutinin (H1, H2, H3) ba phân typ neuraminidase (N1 N2) cơng bố Vi rút cúm B có thay đổi đặc điểm kháng nguyên TCYTTG ước tính hàng năm có khoảng 3-5 triệu người mắc 250.000 – 500.000 người tử vong cúm 1.8 Sinh bệnh học Nhiễm trùng gây vi rút cúm viêm đường hô hấp Vi rút phát triển tế bào biểu mô đường hô hấp phá hủy nhung mao, nơi coi hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng thể hệ thống hô hấp Kèm theo nhân lên vi rút, interferon phát giai đoạn cấp tình bệnh thời gian ngắn nguyên nhân nguy hiểm nhiễm vi rút cúm 1.9 Vắcxin cúm Vi rút tác nhân gây bệnh cúm Miễn dịch ngừa cúm phương pháp để kiểm soát cúm mức độ cá nhân cộng đồng Vắcxin cúm phát triển cấp phép sử dụng người dạng vi rút sống giảm độc lực vi rút bất hoạt Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu kích thích miễn dịch hemagglutinin (HA) neuraminidase (NA), thành phần vắcxin cúm thường xuyên thay đổi cho tương thích với chủng vi rút lưu hành tiên lượng trước Vai trị kích thích đáp ứng miễn dịch khác vắcxin phòng ngừa bệnh chưa hiểu biết cách đầy đủ Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, TCYTTG khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ có thai, trẻ từ đến 59 tháng tuổi, người già, người mắc bệnh “đặc biệt”, cán y tế Việt Nam có nhiều cách tiếp cận khác nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trứng gà có phơi (IVAC), tế bào Vero (Viện Pasteur TP HCM), VABIOTECH hoàn thành đợt thử nghiệm lâm sàng kết cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH sản xuất an tồn người tình nguyện Các số sinh hóa học người tình nguyện sau tiêm vắcxin bình thường Vắcxin A/H5N1 sản xuất dây truyền công nghệ nghiên cứu cho kết đáp ứng tốt tất đối tượng tiêm từ liều 7,5µg trở lên đáp ứng tiêu chuẩn châu Âu Từ kinh nghiệm có sẵn sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định hiệu suất cao Người Việt Nam sử dụng vắcxin cúm Việt Nam sản xuất ngày không xa 1.10 Một số dạng vắcxin cúm Hiện có nhiều cách tiếp cận công nghệ khác để sản xuất vắcxin cúm có nhiều loại vắcxin cúm khác tùy thuộc vào phương pháp kỹ thuật sử dụng: - Vắcxin toàn tế bào (vi rút toàn phần) - Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine) - Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine) - Vắcxin bất hoạt sản xuất tế bào - Vắcxin tái tổ hợp hấp phụ - Vắcxin sống giảm độc lực 1.11 Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm Kiểm tra chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm - Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần chuẩn độ hiệu vi rút cúm - Nhận dạng: Xác định kháng nguyên đặc hiệu phản ứng khuyếch tán miễn dịch ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng kháng thể đặc hiệu - Xác định hàm lượng kháng nguyên HA: - Thử nghiệm nguyên liệu tồn dư: nhà sản xuất phải chứng minh nguyên liệu tồn dư khác sử dụng sản xuất phải giảm qua trình tinh chế phương pháp chạy SDS-PAGE vấn phải giữ nguyên đặc tính kháng nguyên phương pháp kính hiển vi điện tử - Hàm lượng Protein tổng số xác định phương pháp Lorry Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm - Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng thực với lọ cho loạt vắcxin - Hàm lượng kháng nguyên HA - Thử nghiệm an toàn chung - Thử nghiệm chất gây sốt - Thử nghiệm công hiệu CHƯƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Tế bào Tế bào thận chó thường trực (Madin- Darby Canine Kidney): MDCK (London – Anh) 2.1.2 Mẫu thử nghiệm Mẫu nước sau gặt vi rút quy trình sản xuất vắc xin cúm Mẫu bán thành phẩm quy trình sản xuất vắc xin cúm 2.1.3 Mơi trường hóa chất trang thiết bị Các mơi trường, hóa chất trang thiết bị cần thiết 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp sử dụng nghiên cứu: Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50, chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, xá định nồng độ kháng nguyên HA SRID, định lượng protein tổng số, điện di gel SDS-PAGE, kính hiển vi điện tử, phân tích xu hướng Công ty TNHH MTV Vắc xin Sinh phẩm số CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin quy trình sản xuất vắcxin cúm 3.1.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 Tách tế bào MDCK từ chai phiến với mật độ 4x104 tế bào/ml Sau ngày nuôi cấy tế bào MDCK phiến 96 giếng kín lớp Chúng tiến hành thử nghiệm lần nhằm đảm bảo độ xác để tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm: nhiệt độ, môi trường thời gian nuôi cấy vi rút Các phiến trước tiến hành thử nghiệm có mật độ tế bào tương đương Hình 3.5 So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm loại môi trường MEM, DMEM, LH3E 32oC sau ngày, ngày ngày ( Giá trị trung bình lần thử nghiệm) Qua kết thu sau lần tiến hành lặp lại thử nghiệm chúng tơi tìm điều kiện tối ưu cho quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm là: - Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC - Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM - Thời gian nuôi cấy vi rút: ngày 3.1.2 Kết kiểm tra chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm Chúng nghiên cứu áp dụng phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm cho loạt vắcxin cúm A/H5N1 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Bảng 3.4 Kết kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 Loạt 0112 Loạt 0212 Loạt 0312 Loạt 0412 Loạt 0512 Loạt 0113 Loạt 0213 Loạt 0313 Loạt 0413 CCID50 HA SRID Protein (CCID50/ml) 107,5 107,8 108,0 108,4 108,6 107,9 108,0 108,2 108,5 (HAU) 1024 512 512 512 512 512 1024 1024 512 (µg/ml) 177,4 173,1 195,1 228,0 169,3 169,0 127,7 165,2 182,17 (µg/ml) 324,13 416,67 379,01 388,27 373,04 304,61 245,09 278,96 277,02 Bảng 3.5 Kết kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 Loạt 0113 Loạt 0213 Loạt 0313 Loạt 0413 Loạt 0114 Loạt 0214 Loạt 0314 Loạt 0414 Loạt 0115 Loạt 0215 CCID50 HA SRID Protein (CCID50/ml) 107,5 108,2 107,0 107,8 108,5 108,6 108,4 108,6 108,2 108,8 (HAU) 256 512 512 512 256 512 512 512 512 512 (µg/ml) 132,2 159,1 131,6 135,2 129,5 145,6 142,5 140,8 125,2 138,5 (µg/ml) 498,1 507,1 525,5 558,8 480,6 563,4 556,2 532,5 505,2 512,8 Sau bước tinh chế bán thành phẩm cúm, kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm phương pháp điện di mẫu trước siêu ly tâm mẫu sau siêu ly tâm gel SDS-PAGE Kết chạy SDS-PAGE cho thấy sản phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm Đồng thời, với phương pháp thông dụng áp dụng việc đánh giá chất lượng kháng nguyên, nghiên cứu này, 10 tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh kháng nguyên vi rút cúm Phương pháp tiến hành mẫu nuôi cấy vi rút cúm tế bào để quan sát trình nhân lên vi rút cúm Các vi rút cúm A/H1N1 tổng hợp nẩy chồi khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hoàn toàn bị teo lại, quan sát thấy nhiều hạt vi rút hồn chỉnh giải phóng bên ngồi tế bào Mẫu bán thành phẩm vắcxin cúm sau tinh chế để thấy tính tồn vẹn hạt vi rút cúm với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm Chúng tơi phân tích liệu dựa kết loạt vắcxin đại dịch cúm A/H5N1 10 loạt vắcxin cúm mùa A/H1N1 để xây dựng tiêu chuẩn đáng giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắc xin cúm nhằm đảm bảo chất lượng mà cịn đảm bảo tính ổn định sản phẩm 3.2.1 Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm quy trình sản xuất vắcxin cúm 11 Hình 3.9 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.10 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Từ đồ thị nhận thấy kết nằm khoảng (± 2SD) chứng tỏ loạt BTP ổn định vể hiệu giá vi rút Từ chúng tơi phân tích liệu xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên 3.2.2 Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm 12 Hình 3.12 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.13 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hiệu giá kháng nguyên HA ổn định Từ phân tích chúng tơi đưa tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên 3.2.3 Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA SRID 13 Hình 3.15 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.16 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hàm lượng kháng nguyên HA SRID ổn định Từ phân tích chúng tơi đưa tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên 3.2.4 Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số 14 Hình 3.17 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.18 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết hàm lượng Protein tổng số nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hàm lượng Protein tổng số ổn định Từ phân tích dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số vắc xin sản xuất trứng gà có phơi, chúng tơi đưa tiêu chuẩn hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml 3.2.5 Tiêu chuẩn điện di gel SDS-PAGE Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm 15 3.2.6 Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử Vi rút cúm sau siêu ly tâm nguyên vẹn với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm: 16 - Tìm điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là: + Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC + Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: ngày - Đã áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID 50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương pháp điện di gel SDS-PAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho loạt vắcxin cúm A/H5N1 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định chất lượng sản phẩm - Hiệu giá vi rút quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 10 6,5 CCID50/ml trở lên - Hiệu giá kháng nguyên HA phương pháp ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên - Hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên - Hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml - Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm - Vi rút cúm sau siêu ly tâm nguyên vẹn với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút 17