Mục tiêu của luận văn nhằm nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm; xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chun ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60420107 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – Năm 2015 Cơng trình được hồn thành tại: Cơng ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) – Bộ Y Tế Người hướng dẫn khoa học: TS. Đỗ Tuấn Đạt PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Vân Trang Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, 14h00 ngày 21 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: Trung tâm Thơng tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội PHẦN MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hơ hấp tạo nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phịng vi rút cúm. Do vậy, phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một u cầu rất cấp bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt Nam, Cơng ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng các quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên ni cấy tế bào. Một trong những thơng số rất quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong phịng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng ngun vi rút cúm có mặt trong các sản phẩm của q trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các tiêu chuẩn về chất lượng kháng ngun là một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá được chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng tơi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” 2. MỤC TIÊU, NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Trong nhiều thập kỷ qua, bên cạnh virus cúm mùa, thế giới liên tục phải trải qua đại dịch cúm với chủng khác nhau, A/H5N1, A/H7N9, A/H1N1 đại dịch. Sản xuất virus cúm vừa phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt về chất lượng vắc xin, vừa phải đối diện với việc thay thế chủng hàng năm cũng như các chủng mới gây đại dịch. Việc xây dựng quy trình và tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vắc xin chung cho các vắc xin cúm và riêng cho một số vắc xin phịng các chủng cúm gây đại dịch là rất quan trọng, nhằm đảm bảo chất lượng, tính an tồn và tính kháng ngun của vắc xin. Những đánh giá này có thể là cơ sở để áp dụng cho các vắc xin cúm mới khác, nhằm nhanh chóng đưa vắc xin mới vào thử nghiệm và sử dụng5. KẾT CẤU LUẬN VĂN Luận văn ngồi phần mở đầu, danh mục các hình, danh mục các bảng, bảng ký hiệu các chữ viết tắt, kết luận, tài liệu tham khảo, phụ lục cịn có 3 chương sau: Chương 1. Tổng quan Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung của vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngồi, genom là ARN đơn, (), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn ngun gây nên các đại dịch lớn trên tồn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu trúc 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đơi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80120 nm. Các hạt virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein dạng trần khơng được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, typ A và B có 8 đoạn ARN() với tổng khối lượng 5x106, cịn typ C có 7 đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho q trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn. 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn gen ( khơng có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được cơng bố từ năm 1982. Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit 1.4. Q trình nhân lên của vi rút cúm Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bào chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra q trình dung hợp giữa vỏ ngồi của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN polymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN polymeraza của vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khn đơn, () của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của mARN có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ. Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hồn thiện của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân 1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào Vi rút cúm đầu tiên được ni trên trứng gà có phơi. Sau này, các vi rút cúm có thể được ni trên trứng gà có phơi hoặc trong một số hệ ni cấy tế bào tiên phát. Việc ni cấy vi rút trên trứng gà có phơi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ ni cấy tế bào như thận khỉ tiên phát (PMKC) hay thận chó Madin Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC5 là 57,1% 1.6. Kỹ thuật di truyền ngược Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (), vi rút cúm nhân lên trong nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và q trình phiên mã tái bản diễn ra tại đây, vARN sợi () khơng thể trực tiếp làm khn tổng hợp protein mà vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp polymeraza của vi rút. Trong q trình tái bản vARN được sử dụng làm khn để tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khn để tổng hợp sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản là vRNP 1.7. Dịch tễ học bệnh cúm Dịch cúm xảy ra theo xu hướng khác nhau các năm, thường xảy ra vào mùa đơng ở bắc và nam bán cầu, nhưng xuất hiện hàng năm ở khu vực nhiệt đới. Vi rút cúm có khả năng tấn cơng cao, nên tỷ lệ mắc bệnh do vi rút cúm trong dân số là tương đối cao. Tăng tỷ lệ mắc và tử vong do cúm xảy ra ở cực trị của nhóm tuối và ở người đang mắc sẵn một bệnh khác Mơ hình dịch tễ phản ánh sự thay đổi đặc điểm kháng ngun của vi rút cúm, và sự lây lan của bệnh phụ thuộc vào nhiếu yếu tố, bao gồm khả năng lây nhiễm và sự mẫn cảm của nhóm dân cư. Đặc biệt vi rút cúm A có khả năng thay đổi định kỳ lớp vỏ kháng nguyên glycoproteins hemagglutinin neuraminidase. Trong số các vi rút cúm nhóm A ảnh hưởng đến sức khỏe ở người có ba phân typ chính của hemagglutinin (H1, H2, và H3) và ba phân typ chính của neuraminidase (N1 và N2) đã được cơng bố. Vi rút cúm B ít có sự thay đổi về đặc điểm kháng ngun. TCYTTG ước tính hàng năm có khoảng 35 triệu người mắc và 250.000 – 500.000 người tử vong vì cúm 1.8. Sinh bệnh học Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên. Vi rút phát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phá hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô hấp. Kèm theo sự nhân lên của vi rút, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tình của bệnh trong một thời gian ngắn là ngun nhân của sự nguy hiểm do nhiễm vi rút cúm 1.9. Vắcxin cúm Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm. Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp căn bản để kiểm sốt cúm mức độ cá nhân và cộng đồng. Vắcxin cúm được phát triển và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và vi rút bất hoạt. Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích miễn dịch đối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do đó thành phần của vắcxin cúm thường xun được thay đổi sao cho tương thích nhất với chủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước. Vai trị kích thích các đáp ứng miễn dịch khác của vắcxin trong phịng ngừa bệnh vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Vắcxin cúm an tồn, hiệu quả, và được TCYTTG khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già, người đang mắc bệnh “đặc biệt”, và cán bộ y tế Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phơi (IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP. HCM), trong đó VABIOTECH đã hồn thành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 do VABIOTECH sản xuất là an tồn trên người tình nguyện. Các chỉ số sinh hóa học ở những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường. Vắcxin A/H5N1 sản xuất trên dây truyền cơng nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất cả các đối tượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu Âu Từ kinh nghiệm có sẵn sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH cũng đã xây dựng được một quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định và hiệu suất cao. Người Việt Nam sẽ được sử dụng vắcxin cúm do Việt Nam sản xuất trong một ngày khơng xa 1.10. Một số dạng vắcxin cúm Hiện nay có nhiều cách tiếp cận cơng nghệ khác nhau để sản xuất vắcxin cúm và cũng có nhiều loại vắcxin cúm khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật sử dụng: Vắcxin tồn tế bào (vi rút tồn phần) Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine) Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine) Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào Vắcxin tái tổ hợp và hấp phụ Vắcxin sống giảm độc lực 1.11. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm Kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm Nhận dạng: Xác định các kháng ngun đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán miễn dịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu Xác định hàm lượng kháng ngun HA: Thử nghiệm về các ngun liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh các ngun liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua q trình tinh chế bằng phương pháp chạy SDSPAGE nhưng vấn phải giữ ngun đặc tính kháng ngun bằng phương pháp kính hiển vi điện tử Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry. Kiểm tra chất lượng kháng ngun vắcxin thành phẩm Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt vắcxin Hàm lượng kháng ngun HA Thử nghiệm an tồn chung Thử nghiệm chất gây sốt Thử nghiệm cơng hiệu CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Tế bào Tế bào thận chó thường trực (Madin Darby Canine Kidney): MDCK (London – Anh) 2.1.2. Mẫu thử nghiệm Mẫu nước nổi sau gặt vi rút trong quy trình sản xuất vắc xin cúm. Mẫu bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắc xin cúm 2.1.3. Mơi trường và hóa chất và các trang thiết bị Các mơi trường, hóa chất và trang thiết bị cần thiết 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu: Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50, chuẩn độ hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, xá định nồng độ kháng ngun HA bằng SRID, định lượng protein tổng số, điện di trên gel SDSPAGE, kính hiển vi điện tử, phân tích xu hướng tại Cơng ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng ngun vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 3.1.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 Tách tế bào MDCK từ chai ra phiến với mật độ 4x104 tế bào/ml. Sau 2 ngày ni cấy tế bào MDCK trên các phiến 96 giếng đều kín 1 lớp Chúng tơi đã tiến hành thử nghiệm 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm: nhiệt độ, mơi trường và thời gian ni cấy vi rút. Các phiến trước khi tiến hành thử nghiệm có mật độ tế bào tương đương nhau Hình 3.5. So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại mơi trường MEM, DMEM, LH3E tại 32oC sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày ( Giá trị trung bình của 3 lần thử nghiệm) Qua các kết quả thu được sau 3 lần tiến hành lặp lại thử nghiệm chúng tơi đã tìm được các điều kiện tối ưu cho quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm là: Nhiệt độ ni cấy vi rút: 32oC Mơi trường ni cấy vi rút: mơi trường MEM Thời gian ni cấy vi rút: 4 ngày 3.1.2. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Chúng tơi đã nghiên cứu và áp dụng các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Bảng 3.4. Kết quả kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 Loạt 0112 Loạt 0212 CCID50 HA SRID Protein (CCID50/ml) 107,5 107,8 (HAU) 1024 512 (µg/ml) 177,4 173,1 (µg/ml) 324,13 416,67 10 Loạt 0312 Loạt 0412 Loạt 0512 Loạt 0113 Loạt 0213 Loạt 0313 Loạt 0413 108,0 108,4 108,6 107,9 108,0 108,2 108,5 512 512 512 512 1024 1024 512 195,1 228,0 169,3 169,0 127,7 165,2 182,17 379,01 388,27 373,04 304,61 245,09 278,96 277,02 Bảng 3.5. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 Loạt 0113 Loạt 0213 Loạt 0313 Loạt 0413 Loạt 0114 Loạt 0214 Loạt 0314 Loạt 0414 Loạt 0115 Loạt 0215 CCID50 HA SRID Protein (CCID50/ml) 107,5 108,2 107,0 107,8 108,5 108,6 108,4 108,6 108,2 108,8 (HAU) 256 512 512 512 256 512 512 512 512 512 (µg/ml) 132,2 159,1 131,6 135,2 129,5 145,6 142,5 140,8 125,2 138,5 (µg/ml) 498,1 507,1 525,5 558,8 480,6 563,4 556,2 532,5 505,2 512,8 Sau bước tinh chế bán thành phẩm cúm, chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp điện di mẫu trước siêu ly tâm và mẫu sau siêu ly tâm trên gel SDSPAGE. Kết quả chạy SDSPAGE cho thấy sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ cịn các băng protein của vi rút cúm Đồng thời, với các phương pháp thơng dụng hiện vẫn được áp dụng trong việc đánh giá chất lượng của kháng ngun, trong nghiên cứu này, chúng tơi cũng đã tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh các kháng ngun vi rút cúm. Phương pháp này được tiến hành trên các mẫu ni cấy vi rút cúm trên tế bào để quan sát q trình nhân lên của vi rút cúm Các vi rút cúm A/H1N1 được tổng hợp đã nẩy chồi ra khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hồn tồn bị teo lại, quan sát thấy rất nhiều hạt vi rút hồn chỉnh giải phóng ra bên ngồi tế bào. Mẫu bán thành phẩm vắcxin cúm sau khi tinh chế để thấy được 11 tính tồn vẹn của hạt vi rút cúm với các kháng ngun bề mặt đặc hiệu của vi rút 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Chúng tơi đã phân tích dữ liệu dựa trên kết quả của 9 loạt vắcxin đại dịch cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm mùa A/H1N1 để xây dựng tiêu chuẩn đáng giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắc xin cúm nhằm đảm bảo chất lượng mà cịn đảm bảo tính ổn định của sản phẩm 3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Hàm lượng CCID50 /ml 6.00E+08 Phân tích xu hướng hàm lượng CCID 50 5.00E+08 4.00E+08 3.00E+08 2.00E+08 1.00E+08 Loạt 0.00E+00 -1.00E+08 0112 0213 0313 0413 0513 0113 0213 0313 0413 -2.00E+08 -3.00E+08 CCID50 X-2SD X X+2SD 12 X-SD X-3SD X+SD X+3SD Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hàm lượng CCID50 /ml 1.00E+09 Phân tích xu hướng hàm lượng CCID 50 8.00E+08 6.00E+08 4.00E+08 2.00E+08 Loạt 0.00E+00 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 -2.00E+08 -4.00E+08 -6.00E+08 CCID50 X-2SD X X+2SD X-SD X-3SD X+SD X+3SD Hình 3.10. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Từ đồ thị trên chúng tơi nhận thấy các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD) chứng tỏ các loạt BTP đều ổn định vể hiệu giá vi rút. Từ đó chúng tơi phân tích dữ liệu và xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên 3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 13 Hàm lượng HA (HAU) Phân tích hàm lượng HA 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 -200 Loạt 0112 0212 0312 HA X-2SD 0412 0512 0113 X X+2SD 0213 0313 0413 X-SD X-3SD X+SD X+3SD Hình 3.12. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Phân tích hàm lượng HA Hàm lượng HA (HAU) 900 800 700 600 500 400 300 200 100 Loạt 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 HA X X-SD X+SD X-2SD X+2SD X-3SD X+3SD Hình 3.13. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, các kết quả hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hiệu giá kháng ngun HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tơi đưa ra tiêu chuẩn hiệu giá kháng ngun HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên 14 3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID Phân tích xu hướng hàm lượng SRID Hàm lượng SRID 300.0 250.0 200.0 150.0 100.0 50.0 0.0 0112 SRID X+2SD 0212 0312 0412 0512 X X-3SD 0113 X-SD X+3SD 0213 0313 0413 X+SD Loạt X-2SD Hình 3.15. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng ngun HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hàm lượng SRID Phân tích xu hướng hàm lượng SRID 180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 SRID X+2SD X X-3SD X-SD X+3SD X+SD Loạt X-2SD Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng ngun HA (SRID) trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng kháng ngun HA bằng SRID ổn định. Từ các phân tích trên chúng tơi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng kháng ngun HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên 15 3.2.4. Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số Hàm lượng Protein Phân tích xu hướng hàm lượng Protein 600 500 400 300 200 100 Loạt 0112 Protein X+2SD 0212 0312 X X-3SD 0412 0512 0113 X-SD X+3SD 0213 0313 X+SD 0413 X-2SD Hình 3.17. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hàm lượng Protein Phân tích xu hướng hàm lượng Protein 600 580 560 540 520 500 480 460 440 420 400 Loạt 0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215 Protein X-2SD X X+2SD X-SD X-3SD X+SD X+3SD Hình 3.18. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, các kết quả hàm lượng Protein tổng số đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng Protein tổng số ổn định. Từ các phân tích trên và dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số của vắc xin sản xuất trên trứng gà có phơi, chúng tơi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml 3.2.5. Tiêu chuẩn của điện di trên gel SDSPAGE 16 Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ cịn các băng protein của vi rút cúm 3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử Vi rút cúm sau siêu ly tâm cịn ngun vẹn với các kháng ngun bề mặt đặc hiệu của vi rút 17 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm: Tìm ra các điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là: + Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC + Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày Đã áp dụng được các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm như phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương pháp điện di trên gel SDSPAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định cũng như chất lượng của sản phẩm Hiệu giá vi rút trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên Hiệu giá kháng ngun HA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên Hàm lượng kháng ngun HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên Hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ cịn các băng protein của vi rút cúm 18 Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút 19 ... ? ?Nghiên? ?cứu? ?xây? ?dựng? ?và áp dụng các? ?phương? ?pháp? ?đánh? ?giá? ?chất? ?lượng kháng? ?nguyên? ?trong? ?quy? ?trình? ?sản? ?xuất? ?vắcxin? ?cúm ? ?Xây? ?dựng? ?tiêu chuẩn? ?đánh? ?giá? ?chất? ?lượng? ?kháng? ?nguyên? ?trong? ?quy? ?trình sản? ?xuất? ?vắcxin? ?cúm 3. Ý NGHĨA? ?KHOA? ?HỌC VÀ THỰC TIỄN... tơi đã tiến hành thực hiện đề tài : ? ?Nghiên? ?cứu? ?? ?xây? ?dựng? ?phương? ?pháp? ?đánh? ?giá? ? chất? ?? ?lượng? ?kháng? ?nguyên? ?trong? ?quy? ?trình? ?sản? ?xuất? ?vắcxin? ?cúm? ?? 2. MỤC TIÊU, NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN ? ?Nghiên? ?cứu? ?xây? ?dựng? ?và áp dụng các? ?phương? ?pháp? ?đánh? ?giá? ?chất? ?lượng. .. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.? ?Nghiên? ?cứu? ?xây? ?dựng? ?và áp dụng các? ?phương? ?pháp? ?đánh? ?giá? ?chất? ?lượng? ? kháng? ?ngun? ?vắcxin? ?trong? ?quy? ?trình? ?sản? ?xuất? ?vắcxin? ?cúm 3.1.1.? ?Nghiên? ?cứu? ?xây? ?dựng? ?phương? ?pháp? ?chuẩn độ hiệu? ?giá? ?vi rút? ?cúm? ?