Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tóm tắt)

ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ sử dụng rộng rãi Việt Nam Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng trở thành vấn nạn vô nghiêm trọng Tỉ lệ tử vong ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% Trong chẩn đoán điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu biện pháp điều trị, đặc biệt lọc máu hấp phụ Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat mẫu huyết tương người phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat huyết tương người phân tích HPLC để định lượng paraquat Xác định giá trị sử dụng phương pháp áp dụng định lượng paraquat huyết tương bệnh nhân ngộ Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự độc paraquat Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Paraquat từ viết tắt paraquaternary bipyridyl, tên khoa học 1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định paraquat huyết tương Có nhều tác giả sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ dịch sinh học Paixão P định lượng PQ huyết huyết tương người làm đơn giản nhanh phương pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49- bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS Vòng bơm mẫu 50 µl, cột NovaPar C18 (150×4,6 mm, 5µm) Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm) PQ chất nội chuẩn rửa giải 25 oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút bước sóng hấp thụ 258 nm Pha động gồm acid - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 diethylamine Acetonitrile nồng độ 10% (v/v) Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự Chen Lu cộng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để xác định PQ huyết người Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 triethylamine Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát 256 nm, nhiệt độ cột 40oC Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999) Giới hạn phát 0,1 mg/l (S/N = 3) Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat Một yếu tố định đến hiệu phương pháp định lượng phương pháp xử lý mẫu Có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh học phân tích PQ Một số tác giả dùng đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước cho qua cột chiết pha rắn Kyoko KATO, P Paixão dùng acid perchloric để loại protein Tuy nhiên, số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein mẫu huyết tương đơn giản cho hiệu cao áp dụng rộng rãi đơn vị xét nghiệm Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự Qua tài liệu tham khảo cho thấy việc định lượng PQ mẫu huyết tương thực phương pháp HPLC Trong mẫu huyết tương loại bỏ protein cách kết tủa với TCA định lượng hệ HPLC cột tách C8 dung môi pha động theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm photphat pH=2,5 gồm (natri heptanesulfonate; KCl; PEG ; triethylamine; MeOH) CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu trắng: huyết tương người viện Huyết học truyền máu trung ương - Mẫu chuẩn: mẫu trắng thêm lượng xác định PQ tạo thành mẫu - Mẫu thử: huyết tương bệnh nhân ngộ độc PQ thu từ mẫu máu, ly tâm lấy phần huyết tương 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 2.2.1 Chất chuẩn Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate hãng Sigma - Aldrich độ tinh khiết 99,5% Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự 2.2.2 Thiết bị, - Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1200, detector mảng Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng Diode.Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; µm) cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, μm) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn 2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương Để đánh giá khả tách PQ khỏi mẫu huyết tương, mẫu chuẩn chiết PQ mẫu chuẩn bị cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc chạy sắc ký Dựa tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp điều kiện đo * Cột sắc ký: sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; µm) cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, μm) * Bước sóng (λ): khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1200, detector DAD * Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm mẫu từ 10 - 50 µl * Pha động: - Hệ A: Kênh hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125M nước kênh dung dịch NaOH 0,0125M Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự methanol Tốc độ dòng 0,5 ml/phút Tỷ lệ thể tích kênh tương ứng 90 : 10 - Hệ B: Gồm kênh ACN kênh dung dịch đệm pH = (10:90, v/v) Thành phần đệm gồm acid - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 diethylamine - Hệ C: ACN – dung dịch đệm (5:95, v/v) pH = 2,5 gồm 1,1 g natri heptanesulfonate; g KCl; ml polyetylenglycol 400; 0,5 ml triethylamine; 200 ml MeOH thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH H3PO4 đặc Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion * Giá trị pH pha động khảo sát khoảng từ 2,5 đến 4,5 * Khảo sát thành phần dung dịch đệm: nồng độ natri heptanesulfonate, KCl & polyethylenglycol * Tốc độ dòng: thay đổi tốc độ pha động từ 0,2 - 0,8 ml/phút để xác định tốc độ phù hợp cho thời gian lưu tối ưu 2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ huyết tương - Tính chọn lọc - Khoảng nồng độ tuyến tính Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự - Giới hạn phát giới hạn định lượng - Đánh giá độ (độ thu hồi) độ chụm (độ lặp lại) - Độ ổn định 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ - Đối tượng nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng đến tháng năm 2015 - Thu thập số liệu bệnh nhân nhập viện từ bệnh án - Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương vào viện, trước sau lần lọc máu hấp phụ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu cao 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất phân tích với detector DAD Kết cho thấy PQ hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 259 nm Do chọn bước sóng phát chất phân tích PQ là 259 nm 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột Kết cho thấy, với lượng mẫu tiêm vào cột 30 μl cho kết tách tốt Vì vậy, chọn thể tích mẫu tiêm vào cột 30 μl cho khảo sát 3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động Hình 1: Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C (ACN - dung dịch đệm tỷ lệ 5:95, v/v) Vũ Anh Phương nhiên Trường ĐHKH Tự Kết khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN - đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 phù hợp nhất, có khả tách tốt chọn lọc PQ huyết tương, cho pic cân đối có thời gian lưu hợp lý 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động - Pha động: ACN – Đệm (5:95, v/v) Đệm gồm 1,10 g natri heptanesulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol 400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm nước xấp xỉ 1000 ml Điều chỉnh pH đến 2,5 dung dịch H3PO4 đặc Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút 3.1.5 Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Kết cho thấy, phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PQ có tuyến tính khoảng từ 0,05 µg/ml đến 10 µg/ml Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chuẩn có dạng y = 0,84 + 205,06x với hệ số số tương quan R = 0,9999 b 205,06 Sy 0,89 LOD (µg/ml) 0,013 Vũ Anh Phương nhiên LOQ (µg/ml) 0,040 Trường ĐHKH Tự 3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu PQ khỏi mẫu huyết tương có TCA ly tâm lọc lấy dung dịch xác định hệ thống HPLC Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích Nhận xét thấy, giá trị RSD nhỏ (< 2%) chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp tương đối tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích mẫu sau nhiều ngày kể từ lấy mẫu 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc Hình 2: Độ chọn lọc PQ của phương pháp Vũ Anh Phương 10 nhiên Trường ĐHKH Tự Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của PQ không xuất hiện pic lạ Sắc ký đồ huyết tương có PQ cân đối, sắc nét, tách riêng biệt Kết quả xác nhận phương pháp vừa xây dựng có tính chọn lọc tốt đối với PQ 3.3.2 Đánh giá độ phương pháp 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi phương pháp Kết độ thu hồi PQ cao, đạt 100,56% Vì kết luận rằng phương pháp xử lý mẫu là đáng tin cậy 3.3.2.2 Đánh giá độ phương pháp phân tích Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết ttính < tbảng chứng tỏ sai khác giá trị phân tích lại giá trị thêm chuẩn ý nghĩa thống kê 3.3.2 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 3.3.2.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị Kết cho thấy giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện hệ thống sắc ký HPLC lựa chọn ổn định, phù hợp để định lượng PQ Vũ Anh Phương 11 nhiên Trường ĐHKH Tự 3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp) phương pháp phân tích Nhận xét thấy, giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích nhiều phòng thí nghiệm khác 3.3.3 Độ ổn định Độ ổn định thời gian phân tích Nhận xét thấy, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích các thời điểm khác sau xử lý mẫu vòng tiếng 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu Trong 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%) Tuổi trung bình: 32,1 ± 15,2 (14-63 tuổi) Hầu hết ngộ độc tự tử (93,6%) Tỷ lệ tử vong 74,2% Kết biểu diễn phụ thuộc nồng độ PQ huyết tương vào viện theo thời gian từ uống thuốc đến xét nghiệm (hình 3.20) cho thấy hầu hết BN đến viện vòng 10 có nồng độ PQ cao 10 µg/ml tử vong Vũ Anh Phương 12 nhiên Trường ĐHKH Tự Hình 3: Kết định lượng nồng độ PQ vào viện bệnh nhân sống tử vong Căn vào công thức tính số độ nặng ngộ độc PQ (hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương (µg/ml)]×[thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP nhóm BN nghiên cứu trung bình 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao 354,6) Chúng khảo sát chi tiết giá trị thang điểm SIPP trình bày dang đường cong ROC Diện tích đường cong (AUC) SIPP 0,886 Như vậy, điểm SIPP có Vũ Anh Phương 13 nhiên Trường ĐHKH Tự giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong Giá trị thang điểm SIPP = 25 có độ nhạy độ đặc hiệu cao (tương ứng 0,82 0,88), điểm SIPP 40 có độ nhạy 0,73 độ đặc hiệu đạt 100% có nghĩa BN có điểm SIPP 40 tử vong Hình 4: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong Vũ Anh Phương 14 nhiên Trường ĐHKH Tự KẾT LUẬN Đã xây dượng quy trình phân tích PQ mẫu huyết tương - Tối ưu hóa điều kiện để tách PQ xá định phương pháp HPLC, detetor DAD (λ=259 nm) Các điều kiện tối ưu bao gồm: cột pha đảo Agilent C8 ((150 mm x 4,6 mm; µm) cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, μm) Pha động đệm photphat pH = 2,5 theo thể tích (5:95) gồm ACN – Đệm gồm (natri heptanesulfonate; KCl; polyethylenglycol; triethylamine; MeOH) - Điều kiện xử lý mẫu PQ khỏi mẫu huyết tương có TCA ly tâm lọc lấy dung dịch xác định hệ thống HPLC Phương pháp phân tích PQ mẫu huyết tương thu phương trình đường chuẩn khoảng nồng độ từ 0,040 - 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ± 0.08) x có LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml và hệ số tương quan R2 = 0.9999 Độ lặp lại của thiết bị và phương pháp phân tích (RSD nhỏ 3%) độ tái lặp lại (RSDR nhỏ 1%); độ ổn định thời gian Vũ Anh Phương 15 nhiên Trường ĐHKH Tự phân tích và độ ổn định thời gian bảo quản (RSD đều nhỏ 2%); tính tuyến tính (giá trị R2 = 0,9999); độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của PQ trung bình 100,56%) Phương phá p định lượng PQ xây dựng được áp dụng để đị nh lượng PQ mẫu huyết tương 31 bệnh nhân ngộ độc cấp Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, cho thấy giá trị nồng độ PQ lúc BN vào viện , trước sau lọc hấp phụ có giá trị việc tiên lượng tử vong cung cấp công cụ hữu ích để đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ Vũ Anh Phương 16 nhiên Trường ĐHKH Tự [...]... thống sắc ký HPLC đã lựa chọn là ổn định, phù hợp để định lượng PQ Vũ Anh Phương 11 nhiên Trường ĐHKH Tự 3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phương pháp phân tích Nhận xét thấy, các giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau 3.3.3 Độ ổn định Độ ổn định trong thời... kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương khi có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác định trên hệ thống HPLC 2 Phương pháp phân tích PQ trên nền mẫu huyết tương thu được phương trình đường chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0,040 - 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ± 0.08) x có LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml và hệ số tương quan R2 = 0.9999 Độ lặp lại của thiết bị và phương pháp... trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích ở các thời điểm khác nhau sau khi xử lý mẫu trong vòng 5 tiếng 3.4 Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn được chọn vào nghiên cứu Trong đó 16 bệnh nhân (BN)... ứng 0,82 và 0,88), điểm SIPP trên 40 có độ nhạy 0,73 và độ đặc hiệu đạt 100% có nghĩa BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong Hình 4: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong Vũ Anh Phương 14 nhiên Trường ĐHKH Tự KẾT LUẬN 1 Đã xây dượng được quy trình phân tích PQ trong mẫu huyết tương - Tối ưu hóa các điều kiện để tách PQ và xá định bằng phương pháp HPLC, detetor DAD (λ=259 nm) Các điều kiện tối ưu bao gồm:... PQ trong huyết tương khi vào viện theo thời gian từ khi uống thuốc đến khi xét nghiệm (hình 3.20) cho thấy hầu hết BN đến viện trong vòng 10 giờ có nồng độ PQ cao hơn 10 µg/ml đều tử vong Vũ Anh Phương 12 nhiên Trường ĐHKH Tự Hình 3: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân sống và tử vong Căn cứ vào công thức tính chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương. .. đồ mẫu huyết tương trắng tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của PQ không xuất hiện pic lạ Sắc ký đồ huyết tương có PQ cân đối, sắc nét, tách riêng biệt Kết quả trên xác nhận phương pháp vừa xây dựng có tính chọn lọc tốt đối với PQ 3.3.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi của phương pháp Kết quả độ thu hồi của PQ khá cao, đạt 100,56%... lại (RSDR nhỏ hơn 1%); độ ổn định trong thời gian Vũ Anh Phương 15 nhiên Trường ĐHKH Tự phân tích và độ ổn định trong thời gian bảo quản (RSD đều nhỏ hơn 2%); tính tuyến tính (giá trị R2 = 0,9999); độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của PQ trung bình 100,56%) 3 Phương phá p định lượng PQ xây dựng được đã được áp dụng để đị nh lượng PQ trong mẫu huyết tương trên 31 bệnh nhân ngộ độc cấp... của nhóm BN nghiên cứu trung bình là 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao nhất 354,6) Chúng tôi khảo sát chi tiết hơn giá trị của thang điểm SIPP được trình bày dưới dang đường cong ROC Diện tích dưới đường cong (AUC) của SIPP là 0,886 Như vậy, điểm SIPP có Vũ Anh Phương 13 nhiên Trường ĐHKH Tự giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong Giá trị thang điểm SIPP = 25 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (tương ứng 0,82... giá độ đúng của phương pháp 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi của phương pháp Kết quả độ thu hồi của PQ khá cao, đạt 100,56% Vì vậy có thể kết luận rằng phương pháp xử lý mẫu này là đáng tin cậy 3.3.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết quả ttính < tbảng chứng tỏ sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm chuẩn không có ý nghĩa thống kê 3.3.2... nhân ngộ độc cấp tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, cho thấy giá trị của nồng độ PQ lúc BN vào viện , trước và sau lọc hấp phụ có giá trị trong việc tiên lượng tử vong và cung cấp công cụ rất hữu ích để đánh giá hiệu quả của lọc máu hấp phụ Vũ Anh Phương 16 nhiên Trường ĐHKH Tự